L'Immunoematologia è una parte della Ematologia che studia le reazioni antigene anticorpo relative agli antigeni eritrocitari, piastrinici,

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1 L'Immunoematologia è una parte della Ematologia che studia le reazioni antigene anticorpo relative agli antigeni eritrocitari, piastrinici, leucocitari e le patologie ad esse associate.

2 La conoscenza della immunoematologia eritrocitaria, ha consentito : lo studio delle anemie emolitiche autoimmuni di individuare e prevenire le incompatibilità materno-fetali e la malattia emolitica del neonato di effettuare la trasfusione del sangue

3 La trasfusione del sangue può essere attuata solo se esiste compatibilità biologica tra donatore e ricevente. L'identità antigenica (limitatamente agli antigeni che sono maggiormente presenti sulla membrana eritrocitaria) tra donatore e ricevente consente la trasfusione. In analogia con quanto avviene per i trapianti, ( il sangue è un tessuto) la risposta immune verso antigeni non self condiziona la sopravvivenza delle cellule del donatore.

4 Jean Baptiste Denis 1667 prime trasfusioni animale ( agnello) uomo Indicazione nel 17 e 18 secolo: la malattia mentale A seguito di ripetuti decessi le trasfusioni vengono bandite in Francia in Inghilterra ed in Italia (1669)

5 In letteratura 317 trasfusioni con il 50% di mortalità Cause: Reazioni Emolitiche Embolie da sangue coagulato Reazioni settiche

6 All'inizio del 1900 K.Landsteiner identifica, sulla base di reazioni di agglutinazione tra sangue di soggetti diversi, quattro diversi tipi che vengono chiamati A,B,O,AB. I suoi lavori,pubblicati tra il 1902 ed il 1920, pongono le basi della immunoematologia e della terapia trasfusionale

7 L'immunoematologia ha come campo di studio: Gli antigeni eritrocitari Gli anticorpi antieritrocitari L' attività complementare La reazione ATG/ATC Il test di Coomb e la agglutinazione Il riconoscimento e la identificazione degli ATC antieritrocitari

8 Settori di applicazione della immunoematologia: Prove di compatibilità pretrasfusionale Reazioni emolitiche intra ed extra vascolari Anemie emolitiche autoimmuni da ATC freddi ed ATC caldi Anemie emolitiche da farmaci Incompatibilità materno/fetale e malattia emolitica del neonato (MEN)

9 Antigeni eritrocitari Come vedremo gli ATG eritrocitari sono numerosissimi ( milioni sulla superficie di un globulo rosso) ma solo pochi sono realmente in grado di determinare risposte immunitarie clinicamente significative. Occorre fare una netta distinzione operativa tra ANTIGENE e IMMUNOGENO L'antigene è una sostanza in grado di legarsi ad uno specifico anticorpo (oppure a un linfocita ): tutti gli antigeni sono teoricamente in grado di produrre anticorpi specifici, ma solo alcuni sono in grado di farlo realmente, perché la maggior parte si comportano da APTENI, ovvero ci riescono solo se legati ad una molecola (CARRIER) che li fa diventare IMMUNOGENI Una molecola può essere antigenica (cioè può reagire con iprodotti o componenti del S.I.) ma non essere immunogenica (cioè non essere in grado da sola di indurre una risposta immunitaria). Quindi: TUTTI GLI IMMUNOGENI SONO ANTIGENI, MA NON TUTTI GLI ANTIGENI SONO IMMUNOGENI

10 DEFINIZIONI APTENE: molecola a basso peso molecolare (< 4 kd) in grado di agire come epitopo ma che di per sé non è in grado di evocare una risposta anticorpale. L aptene è quindi una molecola antigenica ma non immunogena, a meno che non sia legata ad un CARRIER; induce una risposta immunitaria solo nel caso in cui il S.I. sia venuto precedentemente a contatto col complesso aptene carrier EPITOPO o DETERMINANTE ANTIGENICO: parte di un antigene che entra in contatto con il sito di legame di un ATC o col recettore per l ATG delle cellule T. (Gli epitopi sono praticamente le porzioni più importanti dell antigene, capaci di evocare la risposta immunitaria).

11 CARATTERISTICHE DELLE PROTEINE CON FUNZIONI di ATG Peso molecolare superiore a 5.000Da. Infatti, più una proteina è grande e complessa, più verrà spezzettata e frammentata (le APC hanno preferenza a legare e presentare frammenti peptidici, e non proteine intere). Complessità chimica Solubilità (necessaria per il trasporto) Estraneità ( l Ag deve differenziarsi il più possibile dalla forma delle proteine self, altrimenti si ha l instaurarsi di patologie autoimmuni) Dose di somministrazione: sotto certe dosi, molte proteine non sono in grado di provocare una risposta immune. A dosi molto alte la risposta immunitaria è inibita. Le Risposte Secondarie in genere necessitano di una dose più bassa di Ag, come conseguenza dell instaurarsi della Memoria Immunologica. Via di somministrazione: di solito la via sottocutanea è la più potente

12 Caratteristiche dei determinanti antigenici (epitopi) I determinanti antigenici devono essere accessibili agli anticorpi; se il determinante antigenico risulta inaccessibile agli Ac non si ha risposta immunitaria, risposta che compare invece in seguito allo smascheramento degli epitopi (ad es, per denaturazione dell'antigene) I determinanti antigenici possono essere continui o discontinui Si definiscono continui quelli determinati da aminoacidi disposti in modo lineare nella sequenza primaria della proteina I determinanti discontinui ( o conformazionali) sono dati da aminoacidi non contigui nella sequenza primaria, ma che lo diventano nella struttura terziaria, perché sono portati ad unirsi grazie al ripiegamento tridimensionale della proteina. (ad es. 2 regioni legate da ponti disolfuro).

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14 Epitopi dominanti Negli antigeni sono riconoscibili parti di maggiore o minore importanza nella risposta immune, Le zone in grado di stimolare e legarsi con anticorpi ad alta affinità sono definite epitopi immuno dominanti. In genere queste strutture si trovano su porzioni idrofiliche degli Ag (perché piu facilmente raggiungibili dagli Ac) piuttosto che idrofobiche. Essendo questi epitopi quelli contro cui, con maggiore probabilità, reagiranno gli Ac, anche in individui diversi, sono solitamente utilizzati per la preparazione di vaccini.

15 Antigeni eritrocitari Sono attualmente conosciuti 33 sistemi genetici che codificano 339 antigeni (2012) 6 collections che raccolgono antigeni non attribuibili a sistemi definiti 2 serie : 700 e 901 che raccolgono rispettivamente antigeni a bassa frequenza (privati) e ad alta frequenza (pubblici)

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22 Membrana eritrocitaria I globuli rossi, privi di nucleo, sono le uniche cellule umane in cui la membrana plasmatica costituisce la sola componente strutturale, in essa sono raccolte tutte le funzioni meccaniche, di trasporto ed antigeniche della cellula. La forma discoidale, caratteristica del globulo rosso, si genera nella evoluzione di reticolociti multilobulari che maturano prima nel midollo e quindi nei vasi fino alla cellula matura ed ha importanza fondamentale nelle funzioni e nella sopravvivenza delle emazie essendo dotata di ampia deformabilità che consente il passaggio della cellula attraverso capillari con una sezione pari ad un terzo del suo diametro. Questa proprietà del globulo rosso si manifesta particolarmente nella polpa splenica e consente alla cellula una vita di circa 120 giorni. Il sequestro splenico di emazie con ridotta deformabilità è alla base della emocateresi e delle anemie emolitiche associate a varie patologie ematologiche.

23 BLOOD, 15 NOVEMBER 2008 VOLUME 112, NUMBER 10

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25 Proteine della membrana Sono attualmente note più di 50 proteine transmenbrana per singolo globulo rosso presenti in quantità variabile da poche centinaia a milioni di copie Una ampia parte di loro (almeno 25) sono parte integrale degli antigeni dei gruppi sanguigni Le proteine di membrana evidenziano una ampia variabilità funzionale servendo come proteine di trasporto, proteine di adesione coinvolte nella interazione tra globuli rossi e con le cellule dell'endotelio, recettori e con compiti strutturali. Le proteine di membrana con attività di trasporto coinvolgono vari gruppi ematici : Na-K-ATPase, Ca ATPase, Na-K-2Cl cotransportatore, Na-Cl cotransportatore, Na-K cotransportatore, K-Cl cotransportatore, e Gardos Channel (canale per K attivato dal Ca).

26 Lipidi di membrana Il doppio strato lipidico è quantitativamente ripartito in parti uguali tra colesterolo e fosfolipidi. Si ritiene che il colesterolo sia rappresentato in parti uguali nei due foglietti della membrana mentre i quattro principali fosfolipidi fosfolipidi sono distribuiti asimmetricamente. Fosfatidilcolina e sfingomieline sono prevelenti nella parte esterna della membrana, mentre fosfatidiletanolamina e tutta la fosfatidilserina, assieme ad una piccola quota di fosfatidilinositolo si trovanosi trovano prevalentemente nel monostrato interno.

27 Proteine del citoscheletro I principali costituenti proteici della rete scheletrica bidimensionale che si trova sotto lo strato fosfolipidico, sono: spectrina,actina,anchirina, proteina 4.1R, adducina, dematina, tropomiosina e tropomodulina La spectrina rappresenta circa il 70% dìi tutte le proteine del citoschletro. E' costituita da due catene (catena α e catenaβ) riunite in un eterodimero antiparallelo di circa 100 nm. Le catene sono date da un filamento di sequenze ripetitive si 106 aminoacidi ripiegati a formare una struttura a tripla elica. Gli eterodimeri si legano tra loro con le rispettive parti terminali costituendo dei tetrameri e quindi la rete del membranoscheletro.

28 Actina. E' fondamentale nel legame trai tetrameri di spectrina,risulta costituta da corti filamenti di circa 30 monomeri Proteina 4.1. È presente in due isoforme differenti all'estremità! carbossiterminale, la 4.1a e la 4.1b. Entrambe sono glicosilate da N-acetilglucosammina La proteina 4.1 gioca un ruolo chiave nell'assemblaggio del cito scheletro e nel mantenimento d li ancoraggi dello stesso membranoscheletro al dominio integrale di membrana Proteina 4.9. La sua funzione non è ancora ben nota, ma è ormai stato dimostrato in vitro che concorre alla formazione degli oligomeri di actina. Tropomiosina eritrocitaria. È composta da due polipeptidi e si differenzia dalle altre forme non muscolari poiché si lega bene alla actina a concentrazioni fisiologiche di Mg++. La funzione della tropomiosina è probabilmente la stabilizzazione della actina

29 Proteine di legame tra citoscheletro e membrana fosfolipidica I contatti tra membranoscheletro e membrana si stabiliscono a livello della spectrina che interagisce col dominio citoplasmatico della Banda 3 attraverso l'anchirina e a livello della proteina 4.1, sulla cui molecola sono stati identificati i siti responsabili della interazione con la glicoforina C. L'anchirina è una proteina globulare di 215 kda, fosforilata Una parte dell'anchirina si lega alla catena β della spectrina nella regione della interazione dimericaed un' altra si associa con il dominio citoplasmatico della proteina della Banda 3. L'anchirina presenta 3 domini funzionali, : un dominio di 89 kda che si lega alla proteina della Banda 3 ( interagisce solo con la forma tetramerica della Banda 3), un dominio centrale che lega la β spectrina ed un dominio carbossiterminale che ha funzioni di regolazione.

30 The horizontal linkages between spectrin spectrin dimers and between spectrin, actin, and protein 4.1R in the junctional complex in the spectrin based membrane skeleton

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32 Globuli rossi normali Acantociti Sferociti Ellissociti

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35 I gruppi ematici sono ereditati in modo indipendente tra loro

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37 Immunogenicità degli ATG eritrocitari La immunogenicità è condizionata dalle caratteristiche dell'antigene già elencate (dimensioni, forma fisica, composizione chimica,degradabilità estraneità della molecola) e da condizioni tipiche dell'ospite come l'età o la sua risposta immunitaria. Alcune sostanze sono immunogene per una specie, manon per altre, oppure per un individuo, ma non per altri ( responder, nonresponder). I geni che codificano per i recettori dei linfociti B e T possono essere alterati o persi o non appropriati per la presentazione dell' ATG da parte delle APC(antigen presenting cell) La risposta immune dell'ospite è inoltre regolata dal MHC (Major Histocompatibility Complex) che codifica le proteine espresse sulla membrana cellulare con funzione di riconoscimento da parte dei linfociti T

38 Transfus Med Hemother 2014;41:

39 Transfus Med Hemother 2014;41:

40 Nella trasfusione del sangue la risposta immune del paziente agli antigeni eritrocitari del donatore si manifesta in modo ampiamente variabile a seconda dei sistemi gruppo ematici considerati

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42 TRANSFUSION 2006;46:

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44 Funzioni degli ATG eritrocitari Oltre a quello di natura immunologica ( riconoscimento del self e partecipazione alla rispota immunitaria ) sono definite le seguenti attività: 1 DI TRASPORTO 2 DI RECETTPORE 3 DI ADESIONE 4 ENZIMATICA 5 STRUTTURALE Funzione di trasporto Esempi di questa attività sono la banda 3, l'aqp-1 e il sistema Kidd 1) Banda 3: trasporto di ioni transmembrana,fondamentale nello scambio O2/CO2 e nella composizione della struttura della membrana. E' il prodotto del locu DI(Diego) 2) L'AQP-1funge da canale dell'acqua. Prodotto dal locus CO ( Colton) 3) Gli antigeni Kidd e UHT11 trasportatore dell'urea nei globuli rossi sono strutture presenti sulla stessa proteina. L'assenza dell'atg Kidd ( Jk a-,b-) causa una ridotta resistenza alla emolisi da urea

45 Funzione recettoriale 1) La glicoproteina del gruppo Daffy possiede due attività recettoriali: la prima per le chemochine (Duffy antigen receptor for chemokines DARC) la seconda per il Plasmodium vivax della malaria 2) Il gruppo Knops corrisponde al recettore per il complemento CR1 che lega sulle emazie Il C3b ed il C4b. ed inoltre lega il Plasmodium falciparum 3) Il gruppo ematico MNSs ha come maggiore costituente le glicoforine GPa e Gpb che agiscono legando virus,batteri e P.falciparum 4) Il sistema Cromer ppssiede una proteina ad atività complementare DAF (Decay Accelerating Factor)che ha la capacità di legare E.coli ed enterovirus 5)La catena globoside principale componente del gruppo P, si lega al parvovirus B19

46 Funzione di adesione Sono coinvolte proteine sintetizzate dai geni dei locus In (Indian), LW ( Landsteiner Wiener), Lu (Luteran), Xg (gruppo Xg sul cromosoma X). la più conosciuta è la proteina CD44 ( gruppo Indian) che si lega all'acido jaluronico partecipando direttamente all'hominglinfocitario alla regolazione della risposta immune, alla diffusione delle metastasi Funzione enzimatica E' prevalentemente associata alle transferasi prodotte dai locus H e Se, alla acetilcolinesterasi legata al gruppo Rartwright (Yt) ed alla Znmetalloproteinasi del sistema Kell(K) Funzione strutturale E' legata al sistema Rh la cui assenza (Rhnull) causa sferocitosi, al gruppo Kell le cui alterazioni portano alla acantocitosi (fenotipo McLeod) ed al sistema Gerbrich a cui appartengono le glicoforine C e D la cui assenza detremina ellissocitosi

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