Interactions between Lymphatic Vessels and Leukocytes: Elucidating their impact on lymphatic function and immunity

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1 DISS. ETH NO Interactions between Lymphatic Vessels and Leukocytes: Elucidating their impact on lymphatic function and immunity A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH (Dr. sc. ETH Zürich) Presented by Erica Russo Master degree in Medical, Cellular and Molecular Biotechnologies. Sapienza University of Rome, Italy Born on Citizen of Italy Accepted on the recommendation of Prof. Cornelia Halin Prof. Michael Detmar

2 Summary The lymphatic vascular system plays an essential role in maintaining tissue fluid homeostasis and enabling the migration of leukocytes from peripheral tissue to draining lymph nodes (dlns). Over the past twenty years, considerable knowledge has been gained on the migration of leukocytes from BVs into tissues. By contrast, the migration of leukocytes from the tissue into and within lymphatic vessels (LVs) is, at present, not as well understood. Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells (APCs), which migrate from the tissue through LVs into the dlns to orchestrate an adaptive immune response or to induce tolerance. Our group has recently described a new step in DC migration from the periphery into dlns: we observed that upon entry into LVs, DCs actively crawl in a semi-directed manner within initial lymphatic capillaries, essentially displaying a patrolling behavior. In the first project of this thesis we wanted to further elucidate the mechanisms involved in DC migration within LVs, in particular the molecular control of intralymphatic DC directionality. We identified a novel role for the chemokine CCL21, which is constitutively expressed by LVs, in orchestrating the migration of DCs within LVs in the downstream direction of the dlns. Performing time-lapse imaging in murine ear skin in vivo and ex vivo, we found that the downstream-directed migration of DCs within lymphatic capillaries occurs independently of lymph flow. Moreover, we could show that the blockade of CCL21 or the genetic ablation of the chemokine receptor CCR7 completely abolished DC migration from capillaries towards collecting vessels and reduced the ability of intralymphatic DCs to emigrate from the skin. Performing in vitro flow chamber experiments, we found that low laminar flow was capable of establishing a functional CCL21 gradient across lymphatic endothelial cell (LEC) monolayers, thereby inducing DC migration in the downstream direction of the applied flow. Together, these findings reveal a novel role for intralymphatic CCL21 in promoting DC trafficking to dlns, through the formation of an intralymphatic flow-induced chemokine gradient. Our laboratory is particularly interested in investigating the mechanisms involved in the cross talk between the lymphatic vasculature and the immune 8

3 systems. The starting point for the second project of this thesis was a microarray-based gene expression analysis previously performed in our lab on LECs isolated from inflamed and resting murine skin. The latter study indicated that Nectin-2 and Nectin-3, two adhesion molecules, were expressed in LECs in vivo. In the second project, we investigated the role of Nectin-2 and Nectin-3 in the LV biology and in immunity. Nectin-2 and Nectin- 3 belong to the immunoglobulin superfamily and interact in a homophilic or heterophilic manner with each other or with other Nectin family members to mediate cell-cell adhesion. Additionally, they may interact with other immune receptors, such as CD226 or TIGIT, expressed on specialized immune cells to modulate immune functions. We found that Nectin-2 and Nectin-3 are expressed in cultured human and murine LECs in vitro and are involved in controlling migration and permeability in human LECs. In contrast to the in vitro data, we only found Nectin-2 to be expressed in blood and lymphatic vasculature in vivo. Preliminary experiments, in which ears of mice were locally treated with Nectin-2 and Nectin-3 blocking antibodies or control antibodies, revealed that Nectinblockade reduced the tissue clearance of a lymphatic-specific dye. In preliminary experiments performed in Nectin-2-deficient mice we observed no evident lymphatic phenotype in the LV network of the ear skin in absence of Nectin-2. However, Nectin-2-deficient mice displayed heavier LNs with increased cellularity and CD45 + leukocyte counts in comparison to littermate controls. Additionally, we found that murine DCs expressed Nectin-2, but not Nectin-3, and that blockade of Nectin-2 or the combination of Nectin-2 and Nectin-3 blockade was capable of reducing adhesion and transmigration of bone marrow-derived DCs across murine LECs monolayers. Collectively, our data revealed a new role for Nectin-2 in stabilizing LEC-LEC interactions. Additionally, our preliminary in vitro data suggested an involvement of Nectin-2 in the lymphatic system physiology and in immune activation in LNs. 9

4 Riassunto Il sistema vascolare linfatico gioca un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi dei fluidi corporei; inoltre, permette la migrazione dei leucociti dai tessuti periferici ai linfonodi drenanti. Ricerche effettuate negli ultimi anni hanno chiarito molti aspetti riguardo alla migrazione dei leucociti dai vasi sanguigni nei tessuti. Al contrario, la migrazione dei leucociti dai tessuti verso i vasi linfatici, e il loro ingresso all interno di questi, sono, ad oggi, aspetti non totalmente compresi. Le cellule dendritiche sono un particolare tipo cellulare in grado di presentare antigeni e di migrare dal tessuto attraverso i vasi linfatici nel linfonodo drenante. Qui inducono una risposta immunitaria adattativa o la tolleranza verso l antigene presentato. Il nostro gruppo di ricerca ha recentemente descritto un nuovo passo nella migrazione delle cellule dendritiche dalla periferia al linfonodo drenante. Abbiamo osservato che dopo il loro ingresso nei capillari linfatici iniziali, le cellule dendritiche migrano attivamente e in modo semi-diretto, essenzialmente assumendo un comportamento di pattugliamento. Nel primo progetto di questa tesi abbiamo voluto chiarire ulteriormente il meccanismo coinvolto nella migrazione delle cellule dendritiche all'interno dei vasi linfatici, e in special modo il controllo molecolare della loro direzionalità intralinfatica. Abbiamo descritto un nuovo ruolo per la chemochina CCL21, che è costitutivamente espressa dai vasi linfatici, nell orchestrare la migrazione delle cellule dendritiche all'interno dei vasi linfatici a valle, verso i linfonodi drenanti. Compiendo esperimenti di time-lapse, abbiamo scoperto che la migrazione a valle delle cellule dendritiche all'interno dei capillari linfatici occorre indipendentemente dal flusso linfatico. Inoltre, abbiamo potuto dimostrare che il blocco di CCL21 o l'ablazione genetica del suo recettore CCR7, abolisce completamente la migrazione delle cellule dendritiche dai capillari verso i vasi collettori; inoltre, riduce la capacità delle cellule dendritiche intralinfatiche di emigrare dalla pelle. Esperimenti in vitro in una flow chamber, ci hanno permesso di concludere che un basso flusso laminare stabilisce un gradiente funzionale di CCL21 su un monostrato di cellule linfatiche endoteliali, cosi da indurre la migrazione delle cellule dendritiche nella direzione a valle del flusso applicato. Insieme, questi risultati rivelano un nuovo ruolo per la chemochina 10

5 CCL21 intralinfatica nel promuovere il traffico delle cellule dendritiche verso i linfonodi drenanti. Il nostro laboratorio è particolarmente interessato a indagare i meccanismi coinvolti nell interfaccia tra il sistema vascolare linfatico e il sistema immunitario. Il punto di partenza per il nostro secondo progetto è stata un analisi dell espressione genica di cellule linfatiche endoteliali isolate dalla pelle di topo infiammata o a riposo, precedentemente eseguita nel nostro laboratorio. Questo studio ha indicato che Nectina-2 e Nectina-3, due molecole di adesione, sono espresse dalle cellule linfatiche endoteliali in vivo. Sulla base di questi dati, abbiamo studiato del ruolo di Nectina-2 e Nectina-3 nella biologia dei vasi linfatici e nell attivazione immunitaria. Nectina-2 e Nectina-3 appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline e interagiscono in maniera omofilica o eterofilica con loro stesse, o con altri membri della famiglia delle Nectine, per mediare l adesione cellula-cellula. Inoltre, esse possono interagire con recettori del sistema immunitario (ad esempio CD226 o TIGIT) espressi su cellule immunitarie specializzate, per modulare la funzione immunitaria. In questo progetto, abbiamo scoperto che Nectina-2 e Nectina-3 sono espresse dalle cellule linfatiche endoteliali umane e murine in coltura in vitro; inoltre, controllano la migrazione e la permeabilità delle cellule linfatiche endoteliali umane. A differenza dei dati ottenuti in vitro, abbiamo individuato che solo Nectina-2, ma non Nectine-3, è espressa nei vasi sanguigni e linfatici in vivo. Esperimenti preliminari, in cui orecchie di topo sono state trattate localmente con anticorpi bloccanti per Nectina-2 e Nectina-3 o con anticorpi di controllo, hanno rivelato che il blocco delle Nectine riduce la clearance dai tessuti di un colorante specifico per il sistema linfatico. In esperimenti preliminari, condotti in topi deficienti per Nectina-2, non abbiamo osservato alcun evidente fenotipo della rete vascolare linfatica della pelle dell'orecchio. Tuttavia, i topi deficienti per Nectina-2 mostravano linfonodi più pesanti, con aumentata cellularità e un maggior numero di leucociti CD45 + rispetto ai topi di controllo. Inoltre, abbiamo osservato che le cellule dendritiche murine esprimono Nectina-2, ma non Nectina-3, e che il blocco di Nectina-2, o il trattamento simultaneo di anticorpi bloccanti per Nectina-2 e Nectina-3, sono in grado di ridurre l'adesione e la trasmigrazione delle cellule dendritiche 11

6 derivate dal midollo osseo attraverso monostrati di cellule linfatiche endoteliali. Collettivamente, questi dati preliminari hanno rivelato un ruolo di Nectina-2 nello stabilizzare le interazioni tra le cellule linfatiche endoteliali. Inoltre, i nostri esperimenti preliminari in vitro suggeriscono un coinvolgimento di Nectina-2 nella fisiologia del sistema linfatico e nell attivazione immunitaria nei linfonodi. 12