Orrico C, Pasquinelli G, Foroni L, Muscarà D, Tazzari PL, Ricci F, Buzzi M, Muccini N, Gargiulo M, Stella A

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1 rrico C, Pasquinelli G, Foroni L, Muscarà D, Tazzari PL, Ricci F, Buzzi M, Muccini, Gargiulo M, Stella

2 TRDUZ DBT MLLT TP CMPLCZ MCRVSCLR MCRVSCLR SCHM CRTC VSCULPT GRLZZT FRT DL MCRD CTUS RTRPT PRFRCH (CP)

3 RTRPT DBTC Dal p.to di vista anatomopatologico è caratterizzata dalla presenza di lesioni aterosclerotiche, in segmenti multipli dei vasi arteriosi periferici prevalentemente in sede popliteo-tibiale a livello dell arteria iliaca a livello dell aorta addominale inferiore. Rapida progressione dell aterosclerosi intenso rimodellamento della parete vasale Decellularizzazione intimo-mediale Calcificazione mediale Focolai di infiammazione riduzione del lume arterioso, responsabile del ridotto afflusso di sangue e quindi dell ischemia dei tessuti a valle dell ostruzione

4 RTRPT DBTC steso danno endoteliale (CC) poperfusione ed ipossia dei tessuti ttivazione delle cellule endoteliali residenti Rilascio di diversi fattori di crescita (Vascular ndothelial Growth Factor) VGF gisce sulle cellule vascolari residenti Promuove il rilascio in circolo delle PC di origine midollare GGS

5 BTTV DLL STUD Stabilire in pazienti diabetici affetti darteriopatia struttiva Cronica Periferica un alterazione della neoangiogenesi della parete arteriosa un associazione tra alterata angiogenesi e severità del danno parietale tal scopo sono stati valutati: - l entità del danno parietale causato dal prolungato insulto vascolare - la condizione angiogenica in situ della parete arteriosa - l espressione in situ ed in circolo del fattore pro-angiogenico VGF

6 rterial tissue samples HSTPTHLGCL VLUT MMUHSTCHMCL LYSS RL TM RT-PCR LYSS Femoral arteries from the Surgical Pathology s rchive Femoral arteries from the Surgical Pathology s rchive Femoral arteries fragments from multiorgan donors S T R T G 33 PD and CL PTTS (22 Diabetic) Peripheral blood samples FLW CYTMTRY SSY LS SSY Samples from blood donors Samples from blood donors Healthy CTRLS S P R M T L

7 RSULTT PZT 33 soggetti dei quali 73% maschi con età media di anni Maschi significativamente più anziani rispetto alle femmine 100% affetti da arteriopatia ostruttiva cronica periferica ed ischemia critica degli arti inferiori, senza alcuna differenza statisticamente significativa di frequenza della patologia arteriosa tra i due generi di pazienti 67% affetti da diabete mellito di tipo, senza alcuna differenza statisticamente significativa di frequenza della patologia diabetica tra i due generi di pazienti 159 mg/ml: valore glicemico medio nei soggetti diabetici, fuori quindi dal range di normalità ( mg/ml), sebbene sottoposti a terapia ipoglicemica (85% trattati con insulina, 15% trattati con farmaci ipoglicemizzanti orali) essuna differenza statisticamente significativa tra casi e controlli per sesso ed età.

8 RSULTT : TT DL D PRTL VLUTZ STPTLGC preparati istologici osservati sono stati suddivisi in campioni di parete arteriosa con lesioni precoci o intermedie (type - lesions) i m Modesta iperplasia intimale Cellule muscolari lisce nel subendotelio

9 FM CLL

10 RSULTT : TT DL D PRTL VLUTZ STPTLGC campioni di parete arteriosa con lesioni aterosclerotiche avanzate (type V-V lesions) Proliferazione delle cellule muscolari lisce nel subendotelio Core lipidico con capsula fibrosa

11 GCCL LPDCH TR- D XTRCLLULR; CLLUL FMMTR

12 DPST D CLC LPD

13 lesion frequence RSULTT : TT DL D PRTL VLUTZ STPTLGC La parete arteriosa nei pazienti diabetici confrontata con quella dei non diabetici ha rivelato una più alta frequenza (60% vs 45%) di lesioni aterosclerotiche avanzate, senza peraltro mostrare alcuna differenza statisticamente significativa (p>0.05) tra i due gruppi di pazienti :

14 LS CTFLURMTRC RSULTT : TT DL D PRTL Dall analisi dei dati è emerso che il numero medio delle cellule endoteliali circolanti CD146+ (CC/ml) è significativamente aumentato nel sangue periferico di tutti i pazienti CP rispetto ai controlli sani, mostrando i soggetti diabetici i valori più alti in assoluto pur essendo il numero medio di CC/ml più elevato nei pazienti diabetici confrontati con quelli non diabetici, non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa tra i due gruppi di pazienti P=0.001 P=0.004

15 C T R nd P D d P D RSULTT : CDZ GGC STU DLL PRT RTRS CD 34 adv vwf n tutti i pazienti CP, quando confrontati con i controlli sani, è stato rivelato un significativo aumento della neoangiogenesi avventiziale, CD34+ e vwf+ P=0.002 P< L S M M U S T C H M C

16 nd P D d P D RSULTT : CDZ GGC STU DLL PRT RTRS CD 34 m vwf ella media di tutti i pazienti CP il CD34 è risultato significativamente più espresso rispetto al vwf P< L S M M U S T C H M C

17 RSULTT : CDZ GGC STU DLL PRT RTRS CD 34 L S M M U S T C H M C l gruppo dei diabetici, confrontato con quello dei non diabetici, ha mostrato una significativa riduzione della neoangiogenesi mediale CD34+ nd P D d P D m adv P<0.05

18 RSULTT: SPRSS DL FTTR PR-GGC VGF VGF in situ P=0.028 L analisi molecolare mediante Real Time RT-PCR ha rivelato un espressione dei trascritti di mr per il VGF, significativamente più elevata nella parete arteriosa di tutti i pazienti CP rispetto ai controlli sani. pazienti diabetici contribuiscono in maniera importante a creare questa differenza. VGF circolante dati ottenuti dal saggio LS hanno evidenziato un aumento statisticamente significativo dei valori medi di concentrazione sierica del VGF, in tutti i pazienti CP correlati con i controlli sani senza mostrare alcuna differenza tra diabetici e non diabetici: P=0.039

19 CCLUS n questo studio è stato documentato, sia dalla valutazione istopatologica che dall analisi citofluorimetrica, un significativo danneggiamento della parete arteriosa in tutti i pazienti con arteriopatia ostruttiva cronica periferica ed ischemia critica degli arti inferiori. l prolungato insulto endoteliale, imputabile per lo più alla condizione di iperglicemia cronica indotta dal diabete (e protraentesi nei pazienti diabetici nonostante le terapie ipoglicemizzanti) è responsabile dello slaminamento della parete vasale che rilascia così in circolo cellule endoteliali mature (CC) CD146+ della rottura di quell equilibrio vascolare che in condizioni fisiologiche l endotelio assicura, con conseguente insorgenza e progressione delle placche aterosclerotiche. Ciò spiega la coerenza del dato citofluorimetrico con quello istopatologico: - il significativo aumento delle CC nel sangue periferico di tutti i pazienti CP, avendo i soggetti diabetici i valori più alti in assoluto - la più alta prevalenza di lesioni avanzate nella parete arteriosa dei pazienti CP diabetici rispetto ai non diabetici. D P R T L Pertanto, il numero di CC nel sangue periferico rappresenta un buon indice dello stato di salute della parete arteriosa e per questa ragione potrebbe essere utilizzato come biomarker nell CP associata al diabete.

20 CCLUS La stenosi dei vasi arteriosi periferici, dovuta alla presenza di lesioni aterosclerotiche avanzate, conduce ad una graduale diminuzione del flusso ematico nei distretti da essi perfusi e, quando l apporto di sangue diviene inferiore a quello necessario per mantenere la vitalità dei tessuti, all instaurarsi di un quadro clinico di ischemia critica responsabile della comparsa di una sintomatologia estremamente invalidante. n accordo con alcune evidenze in letteratura da cui si evince che in risposta all ischemia dei tessuti gli organi bersaglio mostrano un incremento nei livelli di trascritto e proteici del VGF, in questo studio è stato rivelato un significativo aumento sia della concentrazione sierica del VGF che dell espressione in situ nella parete arteriosa dei trascritti di mr per il VGF, in tutti i pazienti CP rispetto ai controlli. V G F Ciò rappresenta un tentativo da parte delle cellule endoteliali residenti di sopperire al mancato apporto ematico di ossigeno e nutrienti ai tessuti, mediante il rilascio di un fattore (il VGF) quale maggior mediatore della neoangiogenesi parietale.

21 CCLUS B MRRW VGF SCHMC STS BLD VSSLS GRWTH PC DBTS, CP VGF FUCTL MPRMT UMRC DPLT el presente studio è stato evidenziato un significativo aumento della neoangiogenesi avventiziale, CD34+ e vwf+, in tutti i pazienti CP senza alcuna relazione con la presenza di diabete. Pertanto crediamo che, nel contesto clinico da noi considerato, il contributo dei progenitori di origine midollare alla neoangiogenesi della parete arteriosa sia di limitata importanza. G G S

22 CCLUS L analisi immunoistochimica ha mostrato un denso network di capillari che esprimono intensamente il vwf. l network vascolare si estende dalla porzione più esterna della media attraverso la tonaca avventizia: la localizzazione anatomica e la morfologia suggeriscono fortemente una risposta neoangiogenica del sistema dei vasa vasorum. Una zona vasculogenica, dove risiedono progenitori endoteliali (PC) di origine parietale, è stata identificata nei vasi sanguigni di medio e grosso calibro, proprio al confine tra media ed avventizia: questa zona, ritenuta una risorsa di progenitori nella vasculogenesi postnatale, corrisponde anatomicamente alla localizzazione dei vasa vasorum. L analisi immunoistochimica non ha rivelato alcuna differenza statisticamente significativa, tra pazienti diabetici e non diabetici, nella neoangiogenesi avventiziale sia vwf+ che CD34+. ella tonaca media invece, dove peraltro il CD34 è risultato significativamente più espresso rispetto al vwf in tutti i pazienti CP, il numero dei capillari positivi al CD34 è risultato significativamente ridotto nei pazienti diabetici rispetto ai non diabetici. G G S

23 CCLUS Questi risultati suggeriscono che in ambiente diabetico i vasa vasorum sono incapaci di portare avanti un efficace neoangiogenesi guidata dal VGF questa alterazione nella formazione di nuovi vasi sanguigni potrebbe determinare una ridotta perfusione della parete arteriosa con conseguente aumento del danno parietale e del contributo all accelerata progressione dell aterosclerosi nel diabete. G G S

24 GRZ!