Oxidative stress in prostate cancer: changing research concepts towards a novel paradigm for prevention and therapeutics -

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1 L ossigeno è essenziale per la vita a causa del suo ruolo nella produzione di ATP e la sua partecipazione in processi di biosintesi e di detossicazione Tale processo può danneggiare DNA, proteine e lipidi con conseguenti mutazioni e modifiche strutturali che favoriscono la carcinogenesi Sono tanti i fattori intrinseci ed estrinseci che contribuiscono alla formazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) L'aumento di ROS è legato all invecchiamento ed alle malattie connesse come cancro, aterosclerosi, diabete e patologie degenerative come Parkinson e Alzheimer Oxidative stress in prostate cancer: changing research concepts towards a novel paradigm for prevention and therapeutics - Prostate Cancer Prostatic Dis Sep;16(3): doi: /pcan Paschos et al.

2 H 2 esiste come molecola biatomica Y mol = c 1 Y 1 c 2 Y 2 He non esiste come molecola biatomica

3 La molecola di O 2 ha due elettroni spaiati ed è paramagnetica L ossigeno naturale si trova in questa configurazione Nelle reazioni redox può quindi accettare solo un solo elettrone per volta Ossigeno tripletto Ossigeno singoletto Esiste anche un altro tipo di molecola di O 2 che è diamagnetica ed estremamente reattiva e si trova nella configurazione sopra riportata

4 Nelle reazioni redox l ossigeno può accettare solo un solo elettrone per volta O 2 + e - O 2 *- radicale superossido O 2 *- + e - H 2 O 2 perossido di idrogeno H 2 O 2 + e - OH - + * OH radicale idrossile * OH + e - OH -

5 Sistemi di difesa dai ROS non enzimatici GSH vitamina C enzimatici Catalasi: 2H₂O₂ => 2H₂O + O₂ Perossidasi: ROOH + X rid = ROH + X ox OH Superossido dismutasi: 2O₂ H+ = H₂O₂ + O₂ vitamina E β-carotene Glutatione perossidasi: 2GSH + H₂O₂ = GSSG + 2H₂O Glutatione reduttasi: 2GSH + NADP + = GSSH + NADPH + H +

6 CITOSOL GLUCOSIO (6C) glicolisi due molecole di acido piruvico (3C) O 2 respirazione CO 2 e H 2 O MITOCONDRIO

7 Membrana esterna Membrana interna Spazio intermembrana Cresta Matrice Produzione di energia Mantenimento dell omeostasi cellulare Protezione del resto della cellula dalle Specie Reattive dell Ossigeno (ROS) Necrosi e apoptosi importanti per sviluppo e patologie

8 Nella matrice mitocondriale avviene il ciclo di Krebs che genera elettroni ad alta energia nelle molecole di NADH+H + (coenzima) e di FADH 2 (gruppo prostetico)

9 Nelle creste mitocondriali si trovano le catene respiratorie, formate ciascuna da tre grandi complessi enzimatici di membrana (I, III, IV), connessi dal lipide ubiquinone e dal citocromo C. Il complesso II è un enzima del ciclo di Krebs, l unico che non è solubile.

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11 Nel funzionamento della catena respiratoria, gli ioni H+ (protoni) sono trasferiti nello spazio intermembrana, accumulando quindi energia come gradiente di protoni Il gradiente di protoni genera un campo elettrico nella membrana mitocondriale interna Il ph nello spazio intermembrana è di oltre una unità inferiore a quello nella matrice Il potenziale di membrana è 140 mv, con la parte positiva nella faccia rivolta allo spazio intermembrana Forza proton motrice = DV + DpH

12 L energia per la sintesi di ATP è la forza proton motrice del gradiente di protoni che aziona le ATP sintasi (Pompe di tipo V, reversibili)

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15 La regolazione degli scambi citosol / mitocondrio è un altra funzione importante che è permessa dalla forza proton motrice generata dal gradiente di protoni

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18 I mitocondri sono organuli responsabili della produzione di energia cellulare sotto forma di calore e di ATP, ma sono anche i principali responsabili dell attivazione del programma genetico di apoptosi mediato dal rilascio di numerose proteine dello spazio intermembrana (citocromo c, Smac/ Diablo, ). Il destino della cellula è determinato dalla presenza nelle membrane mitocondriali di proteine della famiglia Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) o Bax. Molte cellule tumorali mostrano livelli anormali di proteina Bcl-2 che si traducono in impossibilità di attivare l apoptosi. Recenti evidenze indicano che diverse proteine pro-apoptotiche localizzate nei mitocondri, così come le proteine delle famiglie Bcl-2 e Bax, sono in grado di influenzare la funzione bioenergetica dei mitocondri. Central roles of apoptotic proteins in mitochondrial function - Oncogene May 30;32(22): doi: /onc Kilbride SM, Prehn JH.

19 In presenza di Bax si ha la formazione e l apertura di un poro (MOMP) con rilascio dei fattori pro-apoptotici (Citocromo c, Smac/Diablo, ) che inducono l'apoptosi attraverso l'attivazione delle caspasi e la successiva frammentazione del DNA nucelare. La presenza di Bcl2 impedisce invece la formazione di MOMP. La perdita di citocromo c dallo spazio intermembrana (i) impedisce il funzionamento della catena respiratoria con crollo del Δψm, (ii) ma allo stesso tempo aumenta la produzione di ROS a causa della fuga di elettroni dalla catena respiratoria. Lo stress ossidativo causato dall aumento dei ROS può contribuire alla morte delle cellule a causa della liberazione di ioni Ca 2 +, contribuendo all apertura del poro. Central roles of apoptotic proteins in mitochondrial function - Oncogene May 30;32(22): doi: /onc Kilbride SM, Prehn JH.

20 Comunicazione nucleo/mitocondrio: per costruire un mitocondrio, il nucleo deve in qualche modo essere informato della necessità di attivare geni mitocondriali nel genoma nucleare, quando attivarli e quali attivare, perché specifici tessuti hanno mitocondri molto differenti nella composizione in proteine. Ageing: Beneficial miscommunication - Nature May 23;497(7450): doi: /497442a - Wolff S, Dillin A.

21 Sett 2014 Durante la divisione cellulare, è fondamentale ripartire correttamente gli organelli nelle due cellule figlie, usando anche il citoscheletro. A causa delle loro caratteristiche uniche, un proprio genoma ed una modalità di trasmissione nella linea germinale femminile, la ripartizione dei mitocondri richiede un processo particolare che si è evoluto per regolare la segregazione mitocondriale durante la divisione cellulare, oogenesi, fecondazione e sviluppo embrionale/fetale, per garantire l'integrità di questi organelli e del loro DNA, compresa la dinamica fusione-fissione, il trasporto degli organelli, la mitofagia e la selezione genetica dei genomi funzionali. Difetti in questi processi possono portare a patologie di cellule e tessuti.

22 Meccanismi cellulari coinvolti nella segregazione, trasporto e degradazione dei mitocondri: (a) Controllo della morfologia mitocondriale per fusione e fissione. (b) Dinamiche dei mitocondri durante il ciclo cellulare. La morfologia mitocondriale è coordinata con il ciclo cellulare e garantisce una equa segregazione dei mitocondri

23 (c) I mitocondri si possono associare con filamenti del citoscheletro ed essere trasportati da motori molecolari. Nelle cellule di mammifero i mitocondri sono trasportati sui microtubili dai motori molecolari kinesina e dineina. Milton agisce come adattatore per collegare il motore molecolare alla GTPasi mitocondriale Rho (Miro) che si trova sulla superficie mitocondriale. In presenza di elevate concentrazioni di ioni calcio (a destra), la kinesina si stacca dal complesso Milton-Miro e si lega alla sintafilina (SNPH) che inibisce l'attività di ATPasi della kinesina e porta all'immobilizzazione dei mitocondri.

24 (d) Mitofagia nelle cellule di mammifero: i mitocondri disfunzionali (a destra) reclutano Parkin (una ubiquitina ligasi E3), si ha quindi poliubiquitinazione di proteine della membrana mitocondriale esterna e conseguente degradazione da proteasoma; nelle cellule eritroidi (a sinistra), la rimozione dei mitocondri richiede la proteina NIX della membrana esterna NIP3 come X (NIX), che interagisce con il complesso GABARAP-L1; nella mitofagia indotta da ipossia (al centro), la defosforilazione di FUNDC1 consente di reclutare LC3 per inglobare i mitocondri nell autofagosoma.

25 Nella cellula, i mitocondri si localizzano vicini ai siti dove c è un elevato consumo di ATP I mitocondri crescono e si dividono per produrre nuovi mitocondri. I mitocondri non funzionanti vengono digeriti dai lisosomi.

26 I Mitocondri sono strettamente imparentati con i procarioti, in particolare con i batteri. Geni di Eubatteri e geni di Archea sono sempre presenti nel genoma degli Eucarioti. Esistono sia Eucarioti che non hanno mitocondri (es. il protozoo Giardia) che Eucarioti che usano batteri come mitocondri (es. l ameba Pelomixa) Il genoma mitocondriale è circolare, è organizzato in operon e codifica per mrna, rrna e trna. La maggior parte dei geni mitocondriali sono stati in qualche modo trasferiti nel nucleo. La duplicazione del DNA mitocondriale è autonoma e la proliferazione dei mitocondri non è in fase con la cellula. DNA MITOCONDRIALE 5-10 molecole circolari/mitocondrio; presenza di ribosio e di uracile; dimensione molto variabile fino a milioni di nucleotidi; nell uomo è bp presenza di 2 operon, H ed L, che codificano per 37 geni, tra cui 13 proteine sono presenti eccezioni al codice genetico:(uga stop -> Trp; AGA/AGG arg -> stop; AUA/AUU ile -> met) mrna incompleti (editing) anomala duplicazione del DNA trasmissione materna tendenza alla ETEROPLASMIA

27 Il DNA mitocondriale può essere riparato in modo simile a quello nucleare Mag 2014 LC3, light chain 3; Ub, ubiquitin

28 Si riteneva il mitocondrio non disponesse di sistemi per riparare il suo mtdna. È noto adesso che il mitocondrio dispone di percorsi multipli per la riparazione del DNA che sono mediati da enzimi simili a quelli che operano nel nucleo e, in tutti i casi identificati finora nei mammiferi, sono codificati da geni nucleari. Il fatto che i mitocondri siano i maggiori siti di produzione di ROS (specie reattive dell'ossigeno) non sembra richiedere soluzioni uniche per la riparazione del mtdna. Questo potrebbe essere perché i mitocondri hanno sistemi completi in atto per neutralizzare i ROS, ed è solo quando questi falliscono o sono assenti che il danno da ROS compromette la funzione mitocondriale in modi che vanno ben al di là del mtdna. La DNA polimerasi mitocondriale, DNA polimerasi γ (Pol γ), è in grado di operare la correzione delle bozze durante la sintesi di DNA. Durante la sintesi del DNA, il filamento in ritardo è ibridato con un RNA di origine ancora sconosciuta. Qualunque sia la sua origine, le molecole di RNA legate al DNA impediscono l'inizio della trascrizione del DNA in corso di replicazione, riducendo il numero di collisioni tra i complessi di trascrizione e replicazione. La presenza di lunghi tratti di RNA in prossimità di DNA aumenta anche la possibilità che L RNA possa essere usato riparare eventuali danni al DNA. Attualmente è noto che il macchinario di replicazione del mtdna include la DNA polimerasi - γ (Pol γ, composta da Pol γ1 e Pol γ2, l elicasi Twinkle (nota anche come C2ORF10) e una ssbp1 mitocondriale. Si ritiene che possa essere la stessa RNA polimerasi mitocondriale a generare i due primer di RNA nei mitocondri. Minimizing the damage: repair pathways keep mitochondrial DNA intact - Nat Rev Mol Cell Biol Oct;13(10): doi: /nrm Kazak et al.

29 Tutti i mitocondri dello zigote vengono forniti dalla cellula uovo: eredità materna e trasmissione materna dell eteroplasmia Ipotesi del collo di bottiglia n 1 Una restrizione o collo di bottiglia avviene precocemente nei primi stadi di sviluppo embrionale: solo uno (o comunque pochi e sani) mitocondri avranno la capacità di proliferare e colonizzeranno le cellule dell embrione. Il numero e la variabilità dei genomi mitocondriali presenti si riduce quindi drasticamente e con essi il grado di eteroplasmia

30 Segregazione del DNA mitocondriale durante la trasmissione materna e l'inizio dell embriogenesi: (a) selezione purificatrice di oociti con mutazioni al mtdna (b) genetic bottleneck (collo di bottiglia genetico) del DNA mitocondriale, per riduzione copie o amplificazione mtdna (c) secondo bottleneck all inizio dell embriogenesi

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