Principi di Citofluorimetria di flusso

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1 Principi di Citofluorimetria di flusso

2 Il citofluorimetro è un microscopio modificato

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4 Definizioni Flow Cytometry (Citofluorimetria di Flusso) Misurazione delle proprietà di cellule in flusso Flow Sorting (separazione cellulare mediante citofluorimetria) Separare (sorting) le cellule basandosi su proprietà misurate in citofluorimetria di flusso, altrimenti detto Fluorescence-Activated Cell Sorting

5 Fondamentali di Citofluorimetria Cellule in sospensione Fluidic a flusso in singola-fila attraverso uno spazio illuminato in cui Ottica diffrangono la luce ed emettono fluorescenza che sono raccolte, filtrate e Elettronic a convertite a valori digitali che sono immagazzinati su di un computer

6 A cytometer consists of: Electronics Fluidics Light detectors FL3 PerCP, Cy5 FL2 PE Computer FL1 FITC Laser Light 488nm SSC FSC

7 Rack elettronico MoFlo Ottica, Fluidica Summit WorkStation

8 Fluidica Necessità di avere cellule in sospensione che fluiscono in una singola fila attraverso un volume illuminato Nella maggior parte degli strumenti ciò si ottiene iniettando un campione in un liquido di scorrimento (sheath fluid) mentre passa attraverso un piccolo orifizio ( µm) Quando le condizioni sono ottimali, il campione fluisce in una zona centrale senza mescolarsi al liquido di scorrimento (Flusso laminare)

9 Fluidica - Flusso Laminare Si può determinare se un flusso sia laminare tramite il numero di Reynolds Se R e < 2300, il flusso è laminare Se R e > 2300, il flusso è turbolento

10 Fluidica Il termine Focalizzazione Idrodinamica indica l introduzione di un ampio volume di fluido all interno di un volume più piccolo in maniera tale che il primo venga focalizzato nell asse di scorrimento

11 Fluidica Come si ottengono l iniezione del compione e la regolazione della velocità di flusso del campione? Pressione Differenziale Iniezione Volumetrica

12 Pressione differenziale

13 La pressione del liquido di scorrimento determinerà quale volume di liquido di scorrimento passa attraverso il nozzle per unità di tempo (assumendo che il flusso del campione sia trascurabile) La differenza di pressione tra liquido di scorrimento e campione controllerà quale volume di campione passa attraverso il nozzle per unità di tempo Il controllo non è assoluto in quanto cambiamenti nei coefficienti di attrito fra i due componenti influenzano il secondo parametro

14 Sistema di Iniezione Volumetrica Pressurizzazione tramite gas per regolare il volume di liquido di scorrimento che passa nell unità di tempo Uso di una pompa connessa ad una siringa per iniettare il campione => volume di campione che passa attraverso il nozzle per unità di tempo può essere variato cambiando la velocità del motore Il controllo è assoluto

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16 Fluidica - Orientamento e Deformazione delle Cellule La focalizzazione idrodinamica fa sì che le cellule siano sottoposte a differenti forze deformanti in punti distinti della loro superficie => cellule vengono allineate lungo asse di scorrimento e deformate

17 Fluidica - Flow Chambers La Flow Chamber definisce asse e dimensioni dello scorrimento del liquido e del campione definisce il punto di ottimo focus idrodinamico può servire come punto di interrogazione (volume di illuminazione)

18 Jet-in-air (ottimo per sorting, proprietà ottiche inferiori)

19 Flow-through cuvette (eccellenti properietà ottiche, può essere usato per sorting)

20 Closed cross flow (eccellenti properietà ottiche, NON può essere usato per sorting)

21 Ottica Sorgente luminosa che deve essere focalizzata nel punto di illuminazione Due sorgenti luminose Laser Lampade ad arco

22 Ottica: Sorgenti luminose Lasers possono fornire una luce dotata di un unica lunghezza d onda (laser line) Potenza da milliwatt a watt Più economici raffreddati ad aria e più costosi raffreddati ad acqua fornisce un fascio di luce coerente

23 Ottica: Cammini ottici Un cammino ottico è il percorso che segue la luce dal volume di illuminazione al detettore Elementi ottici separano i canali e selezionano le lunghezze d onda

24 Ottica: Canale del Forward Scatter Quando si usa una sorgente laser l ammontare di luce diffratta in direzione frontale (lungo lo stesso asse in cui procede il raggio laser) viene rilevato dal canale del forward scatter L intensità del forward scatter è proporzinale a dimensioni, forma ed omogeneità ottica delle celllule

25 Forward Angle Light Scatter Laser FALS Sensor Purdue University Cytometry Laboratories

26 Ottica: Canale del Side Scatter Quando si usa una sorgente laser l ammontare di luce diffratta in direzione laterale (perpendicolarmente rispetto all asse in cui procede il raggio laser) viene rilevato dal canale del side scatter L intensità del canale è proporzionale a dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule

27 90 Degree Light Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor Purdue University Cytometry Laboratories

28 Ottica: Diffrazione della Luce Forward scatter più sensibile alle proprietà di superficie delle particelle può essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Side scatter tende ad essere più sensibile agli inclusi intracellulari distingue cellule granulate da non granulate

29 Ottica: Canali di Fluorescenza La fluorescenza emessa viene convogliata in specifici canali di fluorescenza La specificità di tali canali è controllata dalla selettività della lunghezza d onda di specchi e filtri

30 Fluorescence Detectors Laser FALS Sensor Fluorescenc e Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories

31 Ottica: Proprietà dei Filtri Long pass filters trasmettono lunghezze d onda al di sopra di una specifica lunghezza cut-on Short pass filters trasmettono lunghezze d onda al di sotto di una specifica lunghezza cut-off Band pass filters trasmettono lunghezze d onda in un range piuttosto stretto (band width) attorno ad una specifica lunghezza d onda

32 Standard Long Pass Filters Light Source 520 nm Long Pass Transmitted Filter Light >520 nm Light Standard Short Pass Filters Light Source 575 nm Short Transmitted Pass Filter Light <575 nm Light Purdue University Cytometry Laboratories

33 Standard Band Pass Filters 630 nm BandPass Filter White Light Source Transmitted Light nm Light Purdue University Cytometry Laboratories

34 Ottica: Proprietà dei Filtri Quando un filtro è posto a 45 dalla sorgente luminosa ed è costituito in maniera tale che la luce che verrebbe bloccata viene in realtà riflessa si parla di specchio dicroico

35 Dichroic Filter/Mirror Filter placed at 45 o Light Source Transmitted Light original from Purdue University Reflected light Cytometry Laboratories;

36 Common Laser nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Lines PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-parinaric acid Purdue University Cytometry Laboratories

37 Cy7APC PE-Cy5 LASER (488) APC D T PE-TxRed SHUTTE R PI Cy7PE Hoechst PE FITC SSC FS C I T U T

38 Ottica: Detettori Due tipi Fotodiodi Per segnali molto forrti (quando la saturazione è un potenziale problema: forward scatter) Fotomoltiplicatori più sensibile, ma può essere distrutto dall esposizione ad una quantità di luce eccessiva

39 Analisi: Istogrammi vs Dot Plot Sample 2 Sample FL1-H: CD # Cells FSC-H: Forward Scatter FL1-H: CD8.8

40 Analisi: Parametri Fisici Sample SSC-H: Side Scatter FSC-H: Forward Scatter

41 Analisi: Compensazione No Compensation FL4-% FL-3 Side Scatter CD56 APC CD56 APC Forward Scatter CD3 PerCP CD3 PerCP

42 Analisi: Gating 258: HL15P3 HOECST + PI 258: HL15P3 HOECST + PI Pulse Width, FSC subset FSC SSC Pulse Width 258: HL15P3 HOECST + PI FSC, SSC subset FSC 258: HL15P3 HOECST + PI FL3 subset # Cells 96.6 FL FL FL5

43 APPLICAZIONI

44 Apoptosis Increased uptake or release of dyes Decrease in antigen expression Phosphatidyl serine exposure

45 Dendritic Cells untreated Dendritic Cells treated

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48 UV 5.6% 9.4% 0.5% 16.7% PI FL % 6.7% 41.9% 40.9% Annexin V FL 1 Nick Kassouf

49 The Cell Cycle G 1 G 0 S G1: Gap 1 S: Synthetic G2: Gap 2 M: Mitosis G0: cells that cease division M G 2

50 In an ideal world. # of Events Increase in Fluorescence Intensity

51 In the real world. # of Events CV: SD/mean x 100. Increase in Fluorescence Intensity

52 Typical dual parameter plot Anti-BrdU FITC S Phase G1 G2/ M Propidium Iodide

53 Flow FISH sui Telomeri

54 Flow Karyotyping

55 Cytokine secretion