BD FACSCalibur flow cytometer. FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)

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1 BD FACSCalibur flow cytometer FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)

2 Un citometro a flusso è essenzialmente costituito di: Sistema fluidico per il trasporto del campione e la sua focalizzazione idrodinamica Sistema ottico Circuito di rilevazione Elettronica per l acquisizione, elaborazione e presentazione dei dati.

3 Filter The fluidic system Air filter Air pump Sheat pressure regulator Flow chamber Sheat fluid Sample pressure regulator waste Sample

4 Hydrodynamic focusing Low pressure High pressure Low sample flow rate 12µl/min High sample flow rate 60µl/min Laminar Flow Laminar Flow Sample core Sheath Sample Sheath Sheath Sample Sheath

5

6 LIGHT SCATTER Rifrazione e Riflessione proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità. Rilevate a 90 rispetto la luce incidente SSC LASER Incident light source FSC Diffrazione Proporzionale all area della cellula. Rilevata lungo l asse della luce incidente 0.

7 Discrimination of different cell populations in blood based on light scattering human granulocytes Lysed whole blood Side Scatter Forward Scatter lymphocytes monocytes

8 Characterization of unstained cells using light scatter

9 The fluorescence phenomenon E il fenomeno per cui una molecola colpita da una radiazione luminosa di definita lunghezza d onda (λ) ne emette un altra a λ maggiore e ad energia inferiore.

10 FLUOROCROMI Molecole fluorescenti che assorbono energia dal laser e rilasciano l energia assorbita per: - Vibrazione e dissipazione del calore - Emissione di fotoni di una lunghezza d onda più lunga. Sono coniugate a ligandi o anticorpi monoclonali specifici per molecole biologiche con significato antigenico o recettoriale posizionate sulla membrana cellulare, nel nucleo o nel citosol; altri colorano direttamente altre sostanze (DNA, RNA, proteine, ioni citoplasmatici). Anche le cellule non marcate con alcun fluorocromo presentano una debole fluorescenza di fondo, l autofluorescenza, misurabile.

11 Absorption and emission spectra of a fluorochrome (Stokes shift) Ogni fluorocromo presenta una caratteristica banda di λ per l eccitazione e per l emissione

12 I fluorocromi attualmente più usati in citofluorimetria sono: FITC PE Fluorocromi tandem APC PI (Propidium Iodide) PerCP Ciascun fluorocromo è caratterizzato da una particolare BRILLANTEZZA.

13 Absorption and emission spectra of different fluorochromes Absorption spectra Emission spectra 1000 PerCP FITC PI RPE APC FITC RPE PI APC PerCP Wavelenght (nm)

14 Tandem fluorochromes PerCP-Cy PE-Cy5 (Cy-chrome) APC-Cy7 (PharRed) Composti fluorescenti costruiti unendo fra loro molecole con proprietà fotofisiche complementari, atte a sfruttare il principio di trasferimento dell energia.

15 Correlation between number of binding sites and fluorescence intensity FITC FITC FITC FITC FITC Number of events FITC FITC FITC FITC FITC Fluorescence intensity Emitted fluorescence intensity binding sites

16 Staining of cells with fluorochrome conjugated antibobies specific for surface antigens anti-a Antibody fluorochromes Antigen A anti-b Antibody Antigen B

17 Single and three colours staining Incubation washing acquisitio n Incubation washing acquisitio n

18 Indirect staining Second antibody Goat Anti-Mouse Ig FITC First unconjugated mouse antibody Acquisition and Analysis Incubation washing Incubation washing

19 Optic system of a flow cytometer SSC FITC PE / PI PerCP 7-AAD PE-Cy5 FSC

20 Optical filters Longpass Shortpass Bandpass LP 500 SP 500 BP500/50

21 Optic system of a BD FACSCalibur flow cytometer, equipped with two lasers I segnali di fluorescenza emessi dalla cellula vengono raccolti da lenti poste ortogonalmente al fascio di eccitazione, selezionati con opportuni specchi separatori di fascio, specchi dicroici e filtri ottici e portati ciascuno ad un diverso PMT. FL4 FL2 SSC 661/16 585/42 670LP 488/10 DM 640LP Half Mirror FL1 530/30 90/10 Beam Splitter DM 560SP Fluorescence Collection Lens FL3 Beam Combiner. Focusing Lens Flow Cell 488/10 FSC Diode

22 FLUORESCENCE MEASUREMENTS

23 Generation of an electrical pulse Sensori denominati PMT o detectors trasformano i segnali ottici in intensità di corrente elettrica, oltre ad amplificare lo stesso segnale in maniera lineare o logaritmica. Voltage Voltage Time Time Voltage Time

24 Conversion of electrical pulses in digital values I segnali provenienti dai PMT sono impulsi analogici, ossia proporzionali in maniera continua alle dimensioni del parametro misurato. Un convertitore spezzetta i valori continui rendendoli discreti a seconda del numero di canali a disposizione. Volts Pulse height Pulse area FL2 FL1 SSC FSC Analog to digital converter 0 Channel s 1000 FL3 0 pulse width 40 Time (µsec)

25 Histogram plot Il diagramma ad istogrammi rappresenta graficamente la misura di un singolo parametro. Gli eventi che si accumulano nei vari canali vanno a costruire un diagramma di distribuzione. Numero di Cells Incremento di intensità

26 Histogram analysis La statistica si basa sulla impostazione di cursori che definiscono le aree di interesse calcolando gli eventi che cadono al loro interno. Unstained sample Stained sample marker events events 10 1 FL FL-1 Background fluorescence Antibody - cells Antibody + cells

27 HISTOGRAM

28 Dot plot Il diagramma di dispersione a punti o dot plot rappresenta la correlazione fra due parametri, in cui ogni punto rappresenta un singolo evento dotato di un particolare valore per ciascuno dei due parametri FL FL FL FL

29 Dot plot analysis quadrants Upper Left Single positive Upper Right Double positive CD4 PE UL UR Low Left Low Right Double negative Single positive UL CD3-/CD4+ LL LR UR LL CD3+/CD4+ CD3-/CD4- CD3 FITC LR CD3+/CD4-

30 DOT PLOT

31 Isolation of PBMC by ficoll gradient centrifugation stratification blood Ficoll centrifuge Plasma + platelets PBMC Ficoll erytrocytes + granulocytes Peripheral Blood Mononuclear Cells = PBMC

32 Immunophenotyping technique for determining % of CD4 and CD8 T cells CD4 APC SSC CD3 FITC CD45 PerCp CD8 PE CD3 FITC

33 SPT-specimen processing 50 µl whole blood (EDTA) 20 µl Antibody mix Tube with beads Vortex 15 Room Temperature, dark 450 µl FACS Lysing buffer (1x) Vortex 15 Room Temperature, dark Acquisition and Analysis

34 SPT-sample analysis Microfluorosphere Granulocytes Side Scatter Monocytes Lymphocytes CD4 PE Microfluorosphere CD45 PerCP CD3 FITC No. of events in the bright CD45 region No. of events in the microfluorosphere region X Total no. of microfluorospheres added Volume of blood added = Absolute no. of CD4

35 ELISpot PBMC MoAbAnti-IFN-γ Antigens PBMC Antigen IFN-γ Enzymatic reaction

36 ELISpot Chromogen Substrate insoluble coulored product Enzyme conjugated to the detection antibody CYTOKINE Detection anti-cytokine antibody Capture anti-cytokine antibody

37 ELISpot

38 Simultaneous phenotypic (naive/memory phenotype) and functional (IFN-γ production) characterization of antigen stimulated CD8 T lymphocytes IFNγ-positive cells (R1) IFNγ-negative cells (R2) R1 IFN-gamma R2 CCR7 CD8 CD45RA Memory CD45RA-CCR7+ Naive CD45RA+CCR7+ CCR7 Pre-Effector CD45RA-CCR7- Effector CTL CD45RA+CCR7- CD45RA

39 Simultaneous phenotypic and functional (IFN-γ production and cytotoxic potential) characterization of antigen stimulated T lymphocytes Lymphocytes (R1) CD3+ CD8+ Lymphocytes (R1 and R2) 1,11% 0,05% 69,27% 29,56 % Side Scatter CD8 PerCP IFN-gamma PE Forward Scatter CD3 APC Perforin FITC

40 Class I MHC Tetramer

41 Analysis of proliferation by CFSE labelling

42 Analysis of the proliferation of PHA stimulated CD8 T lymphocytes by CFSE labelling No CFSE CFSE Not stimulated CFSE PHA 0,5 µg/ml CFSE PHA 1 µg/ml

43 Analysis of the proliferation of PHA stimulated CD4 T lymphocytes Not stimulated Stimulated with PHA CD4 CFSE (Fluorescence intensity FL1) Proliferation (cell division)

44 Analisi del ciclo cellulare A B

45 Analisi del ciclo cellulare

46 Analisi dell apoptosi (Ioduro di Propidio)

47 Analisi dell apoptosi (Ioduro di Propidio + Annessina V)

48 Analisi dell apoptosi (Ioduro di Propidio + Annessina V)

49

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