Simposio Educazionale Aspetti Normativi in Citometria a Flusso

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1 Simposio Educazionale Aspetti Normativi in Citometria a Flusso Procedure per il Controllo di Qualità e la Standardizzazione in Citometria Clinica M. Valentini Laboratorio di Patologia Clinica AO San Salvatore PESARO

2 FCM:...evoluzione continua Flow cytometers were developed in the 1970 s primarily for cell sorting and used in research laboratories Late 1980 s: bench top flow cytometers 2000: digital electronics fibre optics and multiple fluorochromes (up to 18 colours) Analyse cells at rates up to 100,000 cells/sec >CD 333

3 Applicazioni della citofluorimetria (1) Sorting cellulare Immunofenotipo (leucemie/linfomi) Monitoraggio del Sistema Immunitario : studio delle sottopopolazioni linfocitarie e studi funzionali su diversi subsets HLA-B27 e trapianti d organo ( cross-match ) Ploidia ( contenuto di DNA ) e studio del ciclo cellulare Analisi della PNH (CD59 e CD55 e..)

4 Applicazioni della citofluorimetria (2) Staminologia (Conta assoluta delle CD34+) e CQ di emocomponenti leucodepleti Apoptosi MRD nelle leucemie Emoglobina Fetale MHC e tecnologia dei Tetrameri

5 Aspetti Tecnici correlati al QC QC strumentale Modalità di prelievo e trasporto dei campioni Preparazione e marcatura dei campioni Acquisizione, analisi e conservazione dei dati Refertazione

6 Obbiettivi Set-up strumentale in Citofluorimetria 1. Ottimale set-up della finestra di analisi per ciascun parametro utilizzato 2. Corretta configurazione degli spettri dei fluorocromi impiegati allo scopo di ottenere la migliore compensazione 3.Tracciabilità di tutte le performances strumentali

7 Controllo di Qualità Strumentale: Procedure ( 1 ) QC Perchè Quando Materiali Iniziale setup strumentale Ottimizzare le condizioni di analisi Nuovi test o nuovo Setup strumentale Vari Allineamento ottico Ottimizzare intensità e variabilità Dopo ogni intervento di manutenzione Beads per l allineamento Posizionamento della finestra di analisi Adjust amplifier gain or PMT such that specimen appear in the range of histogram channels Dopo ogni intervento di manutenzione Attivazione di nuovi test o variaioni nei vari protocolli analitici Cellule o reference beads Verifica della matrice di compensazione tra I diversi fluorocromi Ottenere un modello di compensazione ottimale Dopo ogni intervento di manutenzione Ogni volta che il setting dei PMT viene cambiato Cellule o beads marcate con diversi fluorocromi Validazione della linearità e sensibilità strumentali Verificare linearità sensibilità strumentali Dopo ogni intervento di manutenzione Serie di beads con differenti e predefiniti livelli di FI

8 Classification of fluorescence standards A. Schwartz et al Cytometry 1998 Characteristics Alignment Reference Calibration I-A I-B II-A II-B III-A III-B III-C Smaller than cells X Same size of cells X X X X X X <2% CV X X High intensity X X Reference intensity X X Non-matching spectra X X X X Matching spectra X X X Multiple Intensity levels X X X Binds Antibodies X

9 Verifica dell allineamento strumentale

10 Controllo di Qualità Strumentale: Procedure ( 1 ) QC Perchè Quando Materiali Iniziale setup strumentale Ottimizzare le condizioni di analisi Nuovi test o nuovo Setup strumentale Vari Allineamento ottico Ottimizzare intensità e variabilità Dopo ogni intervento di manutenzione Beads per l allineamento Posizionamento della finestra di analisi Ottimizzare il gain o i PMT in maniera tale che ogni singola fluorescenza sia compresa nel range di misura Dopo ogni intervento di manutenzione Attivazione di nuovi test o variaioni nei vari protocolli analitici Cellule o reference beads Verifica della matrice di compensazione tra I diversi fluorocromi Ottenere un modello di compensazione ottimale Dopo ogni intervento di manutenzione Ogni volta che il setting dei PMT viene cambiato Cellule o beads marcate con diversi fluorocromi Validazione della linearità e sensibilità Verificare linearità sensibilità strumentali Dopo ogni intervento di manutenzione Serie di beads con differenti e

11 Corretto posizionamento della finestra di analisi PMT = 450 V

12 Corretto posizionamento della finestra di analisi PMT = 810 V

13 Corretto posizionamento della finestra di analisi PMT = 560 V

14 Controllo di Qualità Strumentale: Procedure ( 1 ) QC Perchè Quando Materiali Iniziale setup strumentale Ottimizzare le condizioni di analisi Nuovi test o nuovo Setup strumentale Vari Allineamento ottico Ottimizzare intensità e variabilità Dopo ogni intervento di manutenzione Beads per l allineamento Posizionamento della finestra di analisi Adjust amplifier gain or PMT such that specimen appear in the range of histogram channels Dopo ogni intervento di manutenzione Attivazione di nuovi test o variaioni nei vari protocolli analitici Cellule o reference beads Verifica della matrice di compensazione tra I diversi fluorocromi Ottenere un modello di compensazione ottimale Dopo ogni intervento di manutenzione Ogni volta che il setting dei PMT viene cambiato Cellule o beads marcate con diversi fluorocromi Validazione della linearità e sensibilità strumentali Verificare linearità sensibilità strumentali Dopo ogni intervento di manutenzione Serie di beads con differenti e predefiniti livelli di FI

15 Fluorocromi Le scelte dei fluorocromi sono dipendenti dagli assetti strumentali in materia di laser(s) Sistemi a Laser singolo 488 nm Sistemi a Laser multipli 488 nm, 635 nm, violetto e UV

16 Fluorocromi Piccole Molecole Organiche FITC, Texas Red, Cy5, Cy5.5, Cy7 Proteine Fluorescenti Ficoeritrina (PE), Alloficocianina (APC), Peridinin Clorofilla Protein (PerCP) Tandems PE-Texas Red (PE-TR), PE-Cy5, PE-Cy7, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7

17 Fluoresce nza 42 CONGRESSO NAZIONALE SIBIOC Spettri di emissione dei più comuni fluorocromi ( eccitazione 488 nm ) 1000 FITC PE PE-TR PerCP PerCP- PI 7-AAD PE-Cy5 Cy nm) Lunghezza d onda (nm)

18 Setting per la compensazione con beads o linfociti con marcatura singola

19 Setting per compensazione con beads o linfociti con marcatura multipla Compensazione errata

20 Setting per compensazione con beads o linfociti con marcatura multipla Compensazione corretta

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23 Controllo di Qualità Strumentale: Procedure ( 1 ) QC Perchè Quando Materiali Iniziale setup strumentale Ottimizzare le condizioni di analisi Nuovi test o nuovo Setup strumentale Vari Allineamento ottico Ottimizzare intensità e variabilità Dopo ogni intervento di manutenzione Beads per l allineamento Posizionamento della finestra di analisi Adjust amplifier gain or PMT such that specimen appear in the range of histogram channels Dopo ogni intervento di manutenzione Attivazione di nuovi test o variaioni nei vari protocolli analitici Cellule o reference beads Verifica della matrice di compensazione tra I diversi fluorocromi Ottenere un modello di compensazione ottimale Dopo ogni intervento di manutenzione Ogni volta che il setting dei PMT viene cambiato Cellule o beads marcate con diversi fluorocromi Validazione della linearità e sensibilità strumentali Verificare linearità sensibilità strumentali Dopo ogni intervento di manutenzione Serie di beads con differenti e predefiniti livelli di FI

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25 Controllo di Qualità Strumentale: Procedure ( 2 ) QC Perchè Quando Materiali Monitoraggio del setup strumentale Assicurare il mantenimento di performances strumentali ottimali Ad ogni seduta analitica Reference beads o cellule Monitoraggio della della intensità e della sensibilità strumentale Verifica della riproducibilià delle prestazioni Ad ogni seduta analitica e/o ad ogni malfunzionamento strumentale Reference beads Calibration of instrument response to fluorescent signals Standardizzare le misure di Fl Ogni volta che si esegue una FCM quantitativa Bead(s) o cellule con predefinita intensità di fluorescenza

26 Calibration of the instrument's response to FL signals Calibrating each FL parameter using a series of beads with at least 4 different predefined levels of Fl intensity, including nonfluorescent beads

27 Curve di Calibrazione di due Citofluorimetri

28 Preanalitica: raccolta dei campioni Campioni biologici: sangue periferico, mieloaspirato, tessuti, liquidi cavitari e agoaspirati Anticoagulanti: EDTA, ACD, Eparina Liquidi di trasporto : PBS, terreni di coltura Trasporto: Temperatura ambiente ( C) Vitalità : una vitalità <70% comporta una concreta diminuzione della affidabilità del dato analitico

29 Conservazione dei campioni SP e MO prelevati in eparina possono essere processati fino ad un massimo di 48 h : SP e MO prelevati in EDTA sono considerati processabili fino a 24 h ; ACD può essere utilizzato per SP da processare non oltre 48 h ma non è indicato per MO ( può ridurre sensibilmente la vitalità cellulare per piccoli volumi di MO in seguito a variazioni del ph).

30 Criteri di non conformità dei prelievi Campioni intensamente emolizzati e con presenza di coaguli dovrebbero essere SEMPRE RIFIUTATI Campioni biologici con dubbia etichettatura devono esere SEMPRE RIFIUTATI Campioni tissutali congelati o fissati devono essere SEMPRE RIFIUTATI

31 Trattamento dei campioni La lisi dei campioni di sangue periferico non frazionato è il metodo più comunemente utilizzato poichè consente di eliminare le emazie senza perdere alcun subset leucocitario ( si ritiene che tutti i subset siano egualmente resistenti alla lisi ). L incubazione con anticorpi monoclonali può essere effettuata sia prima che dopo la lisi delle emazie Il frazionamento su gradiente di densità è indicato solamente nei casi in cui sia necessario un arricchimento cellulare ( es. Mononucleate ) Tessuti : la dissociazione meccanica è preferibile a quella enzimatica La Vitalità può essere valutata con : 7AAD, trypan blue o PI.

32 Pannelli anticorpali L analisi Citofluorimetrica Multiparametrica ( o policromatica ) rappresenta il gold standard I diversi pannelli dovrebbero consentire la individuazione e caratterizzazione di cellule normali ( controllo interno ) e patologiche I fluorocromi con maggior efficienza quantica (eg, PE) dovrebbero essere sempre impiegati per identificare antigeni debolmente espressi

33 The WHO CLASSIFICATION of HEMATOLYMPHOID TUMOURS

34 FCM Consensus Conferences and Guidelines Bethesda International Consensus Conference on Flow Cytometric Immunophenotyping on Hematolymphoid Neoplasia, 2006 Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic Hematolymphoid Cells; Approved Guideline- Second Edition. CLSI document H43-A2, 2007 Enumeration of Immunologically Defined Cell Populations by Flow Cytometry CLSI document H-42, 2007 EuroFlow antibody panels for standardized. JJM van Dongen et al On behalf of the EuroFlow Consortium Flow Cytometry on the web ISAC (International Society For Analytical Cytology) Salk Institute Purdue University Scripps Research Institute Cancer Research UK CytonetUK:

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36 Consensus sui reagenti da impiegare in Oncoematologia

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45 Refertazione Ogni referto relativo ad una indagine citofluorimetrica dovrebbe riportare un commento descrittivo che, in aggiunta alla dedfinizione del fenotipo, delle percentuali delle popolazioni cellulari studiate e delle modalità di spressione dei diversi antigeni, definisca/suggerisca al clinico un orientamento diagnostico.

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