Esercitazione Oncologia Molecolare. Analisi della morte cellulare in linee leucemiche dopo trattamento con farmaci chemoterapici e inibitori di PI3K

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1 Esercitazione Oncologia Molecolare Analisi della morte cellulare in linee leucemiche dopo trattamento con farmaci chemoterapici e inibitori di PI3K

2 LINEA SPERIMENTALE E TRATTAMENTO Linea Jurkat E6.1: linea leucemica linfoblastoide T, TCR + CD3 + CD4 + CD28 + Mutazioni di PTEN inducono un aivazione cosktukva del pathway PI3K/Akt/mTOR (Shan et al. Mol Cell Biol 2000) rendendo la linea resistente a diversi trazamenk chemioterapici tra i quali il cisplakno. Il cisplakno (cis diclorodiamminoplakno(ii) è un chemioterapico ankneoplaskco che lega i residui di purine nel DNA, i parkcolare la G, formando degli addoi che inducono distorsione e rozura del DNA con conseguente aivazione dei processi di riparo (NER) p53 dipendenk (ATM/ATR) che portano alla morte cellulare. Molte cellule tumorali sviluppano resistenza al cisplakno (es. aivazione cosktukva della via della PI3K) richiedendo perciò il trazamento con farmaci diversi o con terapie combinate

3 CROSS-TALK PI3K/AKT E P53

4 LINEA JURKAT - La linea leucemica Jurkat viene coltivata in RPMI 1640 contenente il 10% FBS (fetal bovine serum). RPMI 1640 è un terreno di coltura contenente aminoacidi, sali e glucosio (vedi diapositiva successiva), viene addizionato di glutammina e antibiotici streptomicina e penicillina. Il FBS contiene vitamine, proteine, ormoni fattori di crescita, lattato deidrogenasi etc. che la linea tumorale utilizza per il metabolismo e la crescita in coltura (vedi diapositiva successiva) - La presenza di phenol red (rosso fenolo) permette di controllare il ph in base alla variazione di colore. Quando vira verso il giallo viene acidificato, condizione che si verifica nella cultura delle linee tumorali grazie al rilascio di acido lattico prodotto dalla glicolisi. - In genere le cellule vengono coltivate (giorno 0) ad una concentrazione di /ml e ogni 2 giorni si contano e diluiscono con terreno nuovo (diluizione 1/3-1/5) in modo da fornirgli i fattori di crescita necessari.

5 RPMI 1640

6 FBS

7 Conta cellulare La camera di Neubauer è composta da 4 quadrati grandi (rossi) delimitati da linee triple, ognuno dei quali formato da ulteriori 16 quadrati più piccoli. La conta delle cellule viene effettuata con Trypan Blue, colorante che colora solo le cellule morte. Il volume di Trypan da aggiungere ad ogni soluzione cellulare è di 1:1. Si contano le cellule vive (non blue) contenute nei 4 quadrati grandi. Il numero di cellule totali sarà diviso per 4 Il numero delle cellule sarà moltiplicato per 10 4 per ottenere il numero di cellule per ml presenti nella nostra coltura cellulare PS: se la soluzione cellulare è molto concentrata possono essere fatte delle diluizioni. Il fattore di diluizione dovrà essere poi moltiplicato per il numero di cellule vive contate prima di moltiplicare tutto per 10 4

8 TRATTAMENTO LINEE JURKAT - Le cellule Jurkat vengono contate (diapositiva precedente) e risospese in terreno completo alla concentrazione di 10 6 /ml. - Vengono piastrate in piastre da 24 pozzetti, 10 6 /pozzetto, e viene aggiunto: Ctr CIS 40 µm LY 25 µm CIS LY 1. Cisplatino (CIS) alla concentrazione finale di 40 µm (stock 1,66 mm) 2. LY (pan inhibitor di PI3K, LY) alla concentrazione finale di 25 µm (stock 10 mm) 3. Cisplatino (40 µm) + Ly (25 µm) 4. Poiché Ly è disciolto in DMSO (dimetilsolfossido) alle cellule di controllo (ctr) non trattate si aggiunge la stessa quantità di DMS0 - Le cellule vengono poste per 24 ore in incubatore a 37 C e il giorno dopo sottoposte all analisi della morte cellulare tramite citofluorimetria a flusso.

9 Citofluorimetria a Flusso La citofluorimetria a flusso o, fluorescence activated cell sorting (FACS) permette di analizzare popolazioni cellulari in sospensione misurandone le caratteristiche fisiche e/o chimiche (volume, granulosita, fluorescenza). 1. La sospensione cellulare viene spinta all interno di una camera a flusso dove le singole cellule vengono separate. Ogni singola cellula viene colpita da un fascio di luce di un raggio laser (sorgente di ioni Argon 488 nm) 2. I segnali passando attraverso un sistema di lenti, filtri e specchi vengono inviati ai rispettivi sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) che ne misurano l intensità 3. I segnali che provengono da ogni singolo sensore sono amplificati e digitalizzati ed inviati ad un analizzatore, che provvede alla loro visualizzazione su monitor, rappresentazione grafica, e definizione statistica.

10 PARAMETRI ANALIZZATI DAL CITOFLUORIMETRO Parametri fisici: quando viene colpita dal fascio di luce emesso dal laser, la cellula emette segnali di luce diffusa in base alle proprie caratteristiche fisiche e morfologiche, per fenomeni di rifrazione, riflessione, e diffrazione. In particolare la luce dispersa in avanti (forward scatter, FSC) e legata alle dimensioni delle cellule, mentre la luce riflessa a 90 (side scatter, SSC) e da attribuire a parametri della morfologia cellulare come la granulosita del citoplasma, il rapporto nucleo/citoplasma, la rugosita di superficie. Citogramma: diagramma bidimensionale ottenuto dalla combinazione di questi due tipi di segnale. Permette di discriminare tra diverse popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche. Segnali di fluorescenza: vengono rilevati segnali fluorescenti generati: 1. dall utilizzo di Abs o sostanze (annexin V) marcati con fluorocromi (FITC, PE, PerCp, APC, ecc) specifici per antigeni o molecole presenti sulla membrana, nel citoplasma, nel nucleo; 2. da fluorocromi che si legano in maniera stechiometrica a determinate sostanze come il DNA (ioduro di propidio, PI) e l RNA. Ogni fluorocromo presenta una caratteristica lunghezza d onda per l eccitazione e l emissione.

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12 517 nm Argon 488 nm 610 nm

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14 PI Colorante sintetico di 668,5 kda in grado di legarsi selettivamente agli acidi nucleici, DNA o con RNA a doppia elica e che anch esso ci permette di analizzare le cellule tramite FACS. Spettro di emissione 610 nm (rosso) perciò può essere misurato nei canali FL2 o FL3. È comunemente usato per studiare il ciclo cellulare tramite quantificazione del DNA, analizzando la distribuzione delle cellule nelle varie fasi, dopo permeabilizzazione dato che il PI non può penetrare le membrane cellulari (delle cellule vive), perciò entra esclusivamente nelle cellule permeabilizzate o morte. PI

15 Annexin-V-FITC Proteina anticoagulante, calcio dipendente, di 35-36κDa che lega la fosfatidilserina la quale è normalmente localizza a livello dello strato citosolico della membrana plasmatica e durante l apoptosi viene trasferita sullo strato esterno tramite un meccanismo chiamato flip-flop. Il fluorocromo FITC ed emeze nello spezro 517 nm (verde brillante). Può essere misurato dal canale FL1

16 Colorazione con Ioduro di Propidio Contare le Jurkat e prenderne per condizione Centrifugare le cellule nei tubini da FACS con 1 ml di PBS-1x (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 8.1 mm Na 2 HPO 4, 1.76 mm KH 2 PO 4, ph 7.4). Jurkat cell line Svuotare i tubini e risospendere in 100 µl di PBS- 1x. Aggiungere 5 µl di PI concentrato 1 mg/ml (finale 50 µg/ml). Lasciare a temperatura ambiente (t.a.), al buio per 15. Leggere al FACS nel canale FL2 o FL3 (emissione 610 nm) Le cellule morte necrotiche permetteranno la diffusione del PI attraverso la membrana che andarà a legarsi al DNA colorando le cellula di rosso

17 RISULTATI COLORAZIONE PI

18 Analisi Morte cellulare con AnnexinV Contare le Jurkat Prendere cellule per condizione Centrifugare le cellule nei tubini da FACS con 1 ml di PBS-1x. Svuotare i tubini e risospendere in 100 µl di Annexin V Buffer (10 mm HEPES, 140 mm NaCl e 2,5 mm CaCl 2 PH 7,4). Aggiungere 5 µl di Annexin V per campione. Vortexare e lasciare 15 a t.a.. Aggiungere 400 µl di buffer. Leggere al FACS nel canale FL1

19 RISULTATI COLORAZIONE ANNEXIN V