Transcript

1 Appunti di Tecniche avanzate per il controllo degli alimenti Parte 3 ZEPPA G. BELVISO S. Università degli Studi di Torino

2

3 A seconda della fase stazionaria si parla di Gas solido cromatografia (GSC) (adsorbimento) Zeppa G. Università degli Studi di Torino Gas liquido cromatografia (GLC) (ripartizione)

4 La fase mobile è un gas che fluisce in una colonna in cui è posta la fase stazionaria. La condizione indispensabile per fare un analisi di una miscela al gascromatografo è che essa passi in fase vapore alla temperatura di lavoro. I meccanismi di separazione dei componenti della miscela sono determinati dalla fase stazionaria, poiché quella mobile funziona solo da gas di trasporto. Da colonne impaccate (anni 50) a colonne capillari, più recenti e differenziate come struttura.

5 Schema a blocchi di un gascromatografo - Sistema di alimentazione del carrier (bombola) (1) - Sistema di alimentazione dei gas per il rivelatore (bombola) (2) - Iniettore (3) - Colonna (4); camera termostatica (6); dispositivo per la programmazione della temperatura (7) - Rivelatore (5) - Software raccolta ed elaborazione dati (8)

6 L iniettore E un dispositivo posto prima della colonna. Consente l introduzione del campione nella colonna. Dipende dal tipo di colonna.

7 INIETTORI PER CAPILLARI - TECNICA SPLIT In questo tipo di iniettore il campione viene premiscelato con il gas di trasporto. Di questa miscela solo una parte passa realmente nella colonna, mentre buona parte viene indirizzata verso la valvola regolabile di spurgo.

8 Camera di miscelazione Volumi di 1 microlitro Temperature elevate, C (possibile perdita di composti bassobollenti e anche rischio di degradazione); basso tempo di residenza nell iniettore (1-2 sec) Non tutto il campione va in colonna Per analiti presenti in quantità

9 INIETTORI PER CAPILLARI - TECNICA SPLITLESS Non c è la camera di miscelazione Volumi maggiori (2 microlitri) Temperature minori (220 C), maggior tempo di residenza degli analiti nell iniettore (1 min) L 80% del campione va in colonna Per analiti in tracce

10 INIETTORI PER CAPILLARI TECNICA SPLIT/SPLITLESS La maggior parte degli iniettori è in grado di utilizzare, grazie alla chiusura di alcune valvole, alternativamente le due tecniche.

11 Nella versione split, la valvola di spurgo è aperta durante l iniezione e solo una piccola parte della miscela entra nella colonna.

12 Nella versione splitless, la valvola di spurgo è chiusa durante l iniezione, e la miscela entra in colonna assieme al solvente. Gran parte del solvente, più volatile, tende a rimanere nella camera di vaporizzazione e verrà eliminato quando viene aperta la valvola di spurgo.

13 INIETTORI PER CAPILLARI ON COLUMN Zeppa G. Università degli Studi di Torino Per analiti che si decompongono sopra il loro p eb. No iniettore riscaldato Pochi nanolitri Temperatura iniziale della colonna bassa, condensazione degli analiti in un volume ristretto e poi riscaldamento per avviare la separazione cromatografica.

14 Colonne Capillari Le colonne capillari sono le più diffuse. Hanno una lunghezza di una decina di m ( m) e il diametro si riduce a pochi mm. Si trovano avvolte a spirale su un telaio di protezione. Sono costruite in vetro oppure silice fusa. Se ne individuano anche in rame o in acciaio inox. Grazie alla loro struttura e lunghezza consentono un efficiente separazione dei componenti della miscela.

15 Le colonne capillari possono essere classificate in base al diametro interno in: Narrow bore (0,25 mm) Wide bore (0,53 mm) Mega bore (0,80 mm)

16 Le colonne capillari possono essere classificate in base a come si presenta la fase stazionaria in: colonne capillari aperte (Wall Coated Open Tubular, WCOT) - in cui le pareti sono ricoperte (o legate chimicamente) dalla fase stazionaria liquida colonne capillari aperte con rivestimento supportato (Support Coated Open Tabular, SCOT) - in cui un materiale granulare poroso molto fine, su cui è stato depositato un sottilissimo film di liquido di ripartizione, viene fatto aderire alle pareti della colonna colonne capillari aperte con rivestimento poroso (Porous Layer Open Tubular, PLOT) - in cui la fase stazionaria è costituita solo da particelle porose fatte aderire alle pareti

17 Il supporto su cui viene ancorata la fase stazionaria liquida deve avere i seguenti requisiti: inerzia chimica; resistenza meccanica e termica; buon grado di «bagnabilità» da parte del liquido di ripartizione; bassa resistenza al flusso del gas; disponibilità sotto forma di particelle il più possibile sferiche.

18 Fasi stazionarie (liquidi di ripartizione) Apolari: idrocarburi o siliconi con sostituenti non polari; esempio: polidimetilsilossano come base variamente sostituito con gruppi fenile, vinile. Polari: polietilenglicole a diversi pesi molecolari.

19 Camera Termostatica In gascromatografia la temperatura della colonna rappresenta un parametro fondamentale per ottenere una buona separazione dei picchi. Le colonne vanno quindi termostatate in apposite camere entro le quali la temperatura resti il più possibile costante. Nel caso contrario la riproducibilità dell analisi viene sensibilmente alterata. Il tipo maggiormente diffuso di camera termostatica è quello a circolazione d aria calda. E un sistema che garantisce la stabilità della temperatura nell ordine di 0,1 C. La temperatura massima raggiungibile è di 400 C. L uniformità della temperatura in ogni punto della camera viene garantita da una ventola posta al di sotto di un fondo forato. Durante la termostatazione la camera non andrebbe mai aperta.

20 Dispositivo per la programmazione della temperatura durante l analisi Normalmente la temperatura della colonna è regolata sul valore corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti della miscela. Per miscele particolarmente complesse con punti di ebollizione troppo distanti tra di loro la scelta della temperatura è problematica.

21 Per tali miscele una temperatura troppo alta consentirebbe una buona separazione dei componenti alto bollenti ma non di quelli più basso bollenti. Al contrario, una temperatura troppo bassa, non consentirebbe di separare quelli alto bollenti.

22 Sui gascromatografi è possibile avere un dispositivo che permette di programmare la temperatura d analisi. La temperatura viene mantenuta bassa durante i primi minuti di analisi (primi picchi) e poi innalzata per consentire la risoluzione delle sostanze alto bollenti. Il tempo di riscaldamento e le diverse temperature vengono trovate per tentativi tenendo presente che è sconveniente usare velocità di riscaldamento maggiori di C/min (sugli strumenti tradizionali).

23 L apparecchio è un timer collegato al dispositivo riscaldante e va a variare ad intervalli di tempo da noi decisi la temperatura all interno della camera termostatica. Nei moderni strumenti la programmazione è di tipo lineare, e prevede le seguenti tappe: 1. ISOTERMIA INIZIALE: indica quanto tempo si rimane a una determinata temperatura. 2. FASE DI RAMPA: si stabilisce la temperatura da raggiungere e con quale velocità. 3. ISOTERMIA FINALE: indica il tempo che si deve restare alla temperatura più alta. 4. RAFFREDDAMENTO: si attua dopo la fine della registrazione del cromatogramma.

24 PROGRAMMATA PER L ANALISI DEGLI ACIDI GRASSI Temperatura iniettore: 250 C Temperatura iniziale del forno: 165 C Rampa: da 165 a 200 C a 3 C/min Temperatura e tempi finali: 200 C per 45 min

25 Il Rivelatore Il rivelatore (o detector) è un dispositivo posto dopo la colonna. Indica la presenza del componente all uscita della colonna. Fornisce la misura della concentrazione del componente nel gas di trasporto.

26 CARATTERISTICHE Zeppa G. Università degli Studi di Torino Segnale-Risposta. Ogni rivelatore traduce in un segnale elettrico, espresso in V o mv, la presenza di una sostanza. Il segnale elettrico, che può essere proporzionale alla concentrazione del componente rivelato o alla sua massa, viene trasformato generalmente in un grafico. Sensibilità. Il più piccolo incremento di SEGNALE dell analita che il rivelatore riesce a registrare rispetto al rumore di fondo.

27 Rumore di fondo. E la fluttuazione del segnale che si ha quando nel gas di trasporto non c è alcun analita. Può essere di origine elettrica o dovuto a impurezze del gas di trasporto. Limite di rivelazione (LOD). E la concentrazione di analita in grado di fornire un segnale pari ad almeno il triplo del rumore di fondo.

28 Intervallo di linearità; range di concentrazioni compresa tra il limite di rivelabilità e il limite di linearità. Limite di linearità; è la concentrazione massima al di là della quale il segnale non è più proporzionale alla concentrazione (con una tolleranza del 5%). Limite di rivelazione; è la concentrazione minima che dà una risposta tripla rispetto al rumore di fondo Intervallo di risposta dinamico; intervallo di concentrazioni entro il quale il rivelatore risponde, anche se non in maniera lineare.

29 I rivelatori si dividono in: UNIVERSALI INDIVIDUANO TUTTI I TIPI DI COMPOSTI SELETTIVI RILEVANO SOLO PARTICOLARI CATEGORIE DI COMPOSTI

30 Questo è un rivelatore di tipo distruttivo. RIVELATORI A IONIZZAZIONE DI FIAMMA (FLAME IONIZATOR DETECTOR) Gli analiti contenuti nel gas di trasporto vengono bruciati in una miscela di H 2 e aria fra due elettrodi tra i quali è applicata una differenza di potenziale di 300 V. Per effetto della combustione si originano ioni. Tra gli elettrodi si manifesta un passaggio di corrente elettrica di intensità proporzionale alla quantità di analiti. Tale corrente viene amplificata e trasformata in un segnale di tensione di alcuni mv. In presenza del solo carrier la corrente è quasi nulla, dovuta a impurezze presenti nel gas di trasporto o, più spesso, a tracce di fase stazionaria che sono trascinate via. Quando nella fiamma bruciano, oltre all idrogeno, anche altre sostanze, aumenta notevolmente la ionizzazione, e di conseguenza anche la corrente. Questo rivelatore è poco selettivo perché sensibile a tutte le sostanze organiche. Non risponde a H2S, NH3, SO2, CO2, CO, H2O. Può lavorare fino a temperature di 400 C e con qualsiasi gas di trasporto (He). Zeppa G. Università degli Studi di Torino

31 RIVELATORE A CATTURA DI ELETTRONI ECD ( ELECTRON CAPTOR DETECTOR) Zeppa G. Università degli Studi di Torino E un tipo di rivelatore che si basa sulla rilevazione di segnali elettrici in seguito al passaggio di gas ionizzato tra i due elettrodi. Il rivelatore è costituito da un catodo ed un anodo. Il catodo è rivestito da un materiale radioattivo a bassa energia ( 63 Ni attaccato a una lamina d oro). L anodo ha forma tubolare e funge da tubo di ingresso del gas.

32 Il gas di trasporto che esce dalla colonna gascromatografica e attraversa la camera viene ionizzato dai b - emessi dal nichel. Si generano ioni che migrano verso i rispettivi elettrodi creando una corrente di fondo che andrà a rappresentare il valore della linea di fondo. β + N 2 N 2+ + e - +β

33 Se nel gas di trasporto è presente una sostanza elettroaffine. X + e - X - e N X - N 2 X Pertanto si formano molecole neutre che fanno diminuire la corrente di base. Per questo motivo quando il rivelatore vede qualcosa il segnale diminuisce rispetto alla linea di base E molto selettivo. Parametro da controllare: differenza di potenziale usata per accelerare gli elettroni emessi (se sono troppo accelerati non possono essere catturati).

34 Derivatizzazione in GC La derivatizzazione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto (es. altobollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisiche siano compatibili con l analisi GC. La derivatizzazione permette le seguenti modifiche: - aumento volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH) - riduzione volatilità (permette l analisi di composti volatili a basso peso molecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente) - aumenta la stabilità - aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD).

35 Derivatizzazione per silanizzazione La reazione di silanizzazione produce composti volatili e stabili termicamente. In tale reazione l H attivato viene sostituito con un gruppo trimetilsililico L agente silanizzante più semplice è il trimetilclorosilano (CH 3 ) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). -OH -SH -COOH -NH 2 -NH CONH 2 TMS-Cl -OTMS -STMS -COOTMS -NHTMS, N(TMS) 2 -NTMS CONHTMS La reattività del gruppo funzionale verso la silanizzazione è il seguente: Alcoli (primario> secondario>terziario) > fenolo > carbossile > ammina> ammide

36 Dato che i reattivi reagiscono con H 2 O, è necessario usare solventi anidri (la piridina è il solvente più utilizzato) Le colonne caratterizzate da idrogeni attivi (CARBOWAX) non sono compatibili con questi derivatizzanti Principali agenti silanizzanti (CH3) 3 -Si-Cl (TMS-Cl) TMS-Cl TRIMETILCLOROSILANO (CH 3 ) 3 Si-imidazolo TMSIM (trimetilsililimidazolo) selettivo per OH, non reagisce con ammine (CH 3 ) 3 -Si-O-C(CH 3 )=N-Si(CH 3 ) 3 (CH 3 ) 3 -Si-N(C 2 H 5 ) 2 BSA (N,O-bis-trimetilsilil-acetamide) TMS-DEA (N-trimetilsilil-dietilamina)

37 Transesterificazione (analisi acidi grassi) Zeppa G. Università degli Studi di Torino

38 Fast GC e ULTRA FAST GC 1) Diminuzione del tempo di analisi (da 3 a 10 volte) 2) Aumento della risoluzione dovuto ad un aumento dell efficienza 3) Aumento della sensibilità 4) Accuratezza elevata Caratteristiche strumentali GC convenzionale Fast GC/Ultra fast GC Diametro interno colonne 0,25-0,32 mm 0,10-0,18 mm (Fast GC) 0,050 mm (Ultra fast GC) Lunghezza delle colonne m 5-15 m Spessore fase stazionaria 0,25-5 μm 0,05-0,40 μm Tempi di analisi min 2-30 min Gas di trasporto Elio, idrogeno Idrogeno

39 La riduzione del diametro interno comporta: a) un incremento della contropressione del sistema (aumento della velocità del gas di trasporto, espressa come velocità lineare) che aumenta all aumentare della lunghezza della colonna Pressione in testa alla colonna

40 Le colonne narrow-bore consentono di operare a velocità lineari maggiori ū: velocità lineare (cm/sec) alla quale il gas di trasporto si muove in colonna. ū opt : velocità lineare ottimale alla quale l efficienza della colonna è massima. ū < ū opt : elevata risoluzione, tempi di analisi elevati, picchi allargati. ū > ū opt : tempi di analisi ridotti, picchi distorti, risoluzione inadeguata. Per ottenere tempi di analisi ridotti senza perdere in efficienza si deve adottare una velocità lineare la più elevata possibile, che fornisca prestazioni analoghe a quelle ottenute con ū opt. HETP (altezza equivalente a un piatto teorico): lunghezza della colonna in cui si verifica la ripartizione dell analita tra fase stazionaria e fase mobile. HETP è una misura dell efficienza della colonna. Curve di Golay: HETP vs. ū

41 Perché come gasditrasportovieneusatol H 2? La curva di Golay dell idrogeno è relativamente piatta intorno al punto di minimo: posso operare ad elevate velocità lineari senza una significativa perdita di efficienza

42 l aumento della velocità del gas comporta un aumento della velocità della rampa di temperatura il detector deve essere in grado di rivelare velocemente i segnali degli analiti (elevata velocità di acquisizione dati) L utilizzo di film di fase stazionaria più sottili comporta: l iniezione di una quantità di campione ridotta (utilizzo di elevati rapporti di splittaggio) (la sensibilità del sistema cromatografico viene garantita dalla formazione di picchi più stretti)

43 Tecniche separative: gascromatografia Zeppa G. Università degli Studi di Torino APPLICAZIONE È possibile effettuare la fast GC sulla maggiore parte dei GC convenzionali.

44 Modulo ULTRAFAST Zeppa G. Università degli Studi di Torino Il modulo Ultra-Fast GC è installato nel forno di un GC La colonna è montata in una scatola di metallo. Il sensore della temperatura e l elemento riscaldante avvolgono la colonna e sono inclusi nel modulo. Elemento riscaldante Colonna capillare Il riscaldamento della colonna avviene per contatto diretto con l elemento riscaldante (aumenta velocità rampa); la ventola del forno viene utilizzata solo nella fase di raffreddamento (1 min). Assemblaggio della colonna Fibra ceramica Sensore di temperatura

45 APPLICAZIONI 1 Esteri metilici in olio di oliva Col.: MEGAWAX 5m x 0,1mm, 0,2um FT Programmata di T: 150 C (10 s), 1,7 C/s, 250 (20 s) Conventional GC (20 min.) time (min) 1) Palmitic (C16:0) 5) Stearic (C18:0) 9) Arachidic (C20:0) 13) Lignoceric (C24:0) 2) Palmitoleic (C16:1) 6) Oleic (C18:1n9c) 10) Eicosenoic (C20:1) 14) Nervonic (C24:1) 3) Heptadecanoic (C17:0) 7) Linoleic (C18:2n6c) 11) Behenic (C22:0) 4) Heptadecenoic (C17:1) 8) Linolenic (C18:3n6) 12) Tricosanoic (C23:0)

46 2 Analisi di oli essenziali limonene cis-b-ocimene trans-b-ocimene linalool linalyl acetate a-terpineol neryl acetate geranyl acetate b-cariophyllene d-germacrene bicycle d-germacrene Salvia 100 sec Colonna: 5m x 0,1mm i.d., 0,1µm OV1 Programma di temperatura: 50 C (0,1 ), 150 C/min a 250 C (1 ) sclareol b-pinene a-pinene limonene myrcene g-terpinene linalool linalyl acetate Bergamotto 50 sec

47 Gascromatografia bidimensionale (2DGC; GCXGC) Zeppa G. Università degli Studi di Torino A volte le matrici naturali, di varia complessità, mostrano dei tracciati gascromatografici talmente complicati che diventa necessario un livello molto elevato di efficienza per ottenere la completa risoluzione dei componenti. Di conseguenza, l impiego di una singola colonna capillare può essere insufficiente. I metodi bidimensionali utilizzano due colonne aumentando di molto il potere risolutivo rispetto alla GC tradizionale. Le due colonne sono connesse in serie mediante un modulatore di flusso capillare. La funzione del modulatore di flusso (jet flow modulator o differential flow modulator) è quella di raccogliere le frazioni che eluiscono dalla prima colonna (conventional capillary, 30 m x 0,25 mm i.d., f.t. 0,25 mm, non polare) e trasferirle in una seconda colonna più corta (shortnarrowbore, 5m x 0,25 mm i.d., f.t. 0,15 mm, polare).

48 Schema del Sistema GCxGC Iniettore capillare convenzionale Focalizzazione pulsata di 10 ms e re-iniezione Rivelatore veloce Sampling rate 100 Hz Colonna capillare convenzionale 50 volte più veloce della 1 st colonna

49 Affinchè la separazione nella prima dimensione venga conservata, la banda introdotta nella seconda colonna deve eluire prima dell introduzione della banda successiva. I dati cromatografici bidimensionali possono essere visualizzati in un cromatogramma bidimensionale nel quale ad ogni componente corrisponde un picco definito dai due tempi di ritenzione (uno nella coordinata x, l altro in quella y). in un grafico tridimensionale La sovrapposizione di due soluti diversi è statisticamente improbabile perché richiederebbe due tempi di eluizione uguali in due colonne aventi fasi stazionarie diverse.

50 Separazione 2D-GC 1 Dimensione 2 Dimensione Polarità Punto di ebollizione

51 AnalisideiVOCs EPA Dim 1 chlorobenzene 2 1,1,1,2-tetrachloroetane 3 ethylbenzene 4 p/m-xylene 5 bromoform 6 styrene 7 o-xylene 8 1,1,2,2-tetrachloroethane 9 1,2,3-tricholoropropane 10 isopropylbenzene 11 bromobenzene 12 2-chlorotoluene 13 n-propylbenzene 14 4-chlorotoluene 15 impurity 16 1,3,5-trimethylbenzene 17 tert-butylbenzene 18 1,2,4-trimethylbenzene 19 1,3-dichlorobenzene 20 sec-butylbenzene 21 1,4-dichlorobenzene 22 p-isopropyltoluene 23 1,2-dichlorobenzene 24 n-butylbenzene

52 Vantaggi della tecnica 2D GC 36 Zeppa G. Università degli Studi di Torino - Il potere di separazione della 2D GC estesa è notevolmente più alto della GC capillare convenzionale. - 2D GC estesa offre una migliore efficienza rispetto alla GC convenzionale: la forma dei picchi è decisimente più stretta. - 2D GC estesa permette una migliore identificazione dei picchi se confrontata con la GC convenzionale: l eluizione dei picchi è caratterizzata da due tempi di ritenzione. - 2D GC estesa è compatibile con tutti i sistemi di iniezione e tecniche di campionamento usate in GC convenzionale ad una sola dimensione. - 2D GC estesa riduce la necessità di manipolazione di campioni complessi: la capacità separativa è così grande da isolare le interferenze critiche che normalmente sono presenti nella GC convenzionale

53 TRACE 2DGC Modulatore Dual Jet CO2 jet CO2 jet J.Beens et al., Journal of Chromatography A, 919 (2002)