Scelta della matrice e prelievo del campione. Laboratorio. Preparazione del campione. Separazione delle sostanze in esame. Trattamento pre-analisi
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- Flaviano Cirillo
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1 Scelta della matrice e prelievo del campione Laboratorio Preparazione del campione Separazione delle sostanze in esame Trattamento pre-analisi Analisi strumentale Valutazione critica del risultato
2 aggiunta S.I. digestione della matrice idrolisi correzione del ph solubilizzazione in opportuno solvente Preparazione del campione deproteinizzazione omogenizzazione filtrazione e/o centrifugazione
3 estrazione liquido-liquido isolamento sostanze in esame estrazione in fase solida (SPE) filtrazione su appositi filtri Micro Extraction by Packed Sorbent (MEPS) SPE su cartuccia Dispersive SPE (D-SPE) Molecular Imprinted Polymers (MIPs) Solid Phase MicroExtraction (SPME)
4 Estrazione liquido-liquido
5 Solid Phase Extraction (SPE)
6 Solid Phase Extraction
7 ESEMPI DI FASE STAZIONARIA C-18 fase diretta fenile scambio anionico scambio cationico ammino
8 Like Dissolves Like Opposites Attract
9 Solid Phase MicroExtraction (SPME)
10 Solid Phase MicroExtraction (SPME)
11 Solid Phase MicroExtraction (SPME)
12 Solid Phase MicroExtraction (SPME)
13 Meccanismi di estrazione dell analita mediante la fibra L absorbimento è tipico dei rivestimenti a fase liquida quali il polidimetilsilossano (PDMS) ed il poliacrilato (PA). Le molecole degli analiti si ripartiscono nella fase della fibra fino ad occuparne l intero volume. Nell adsorbimento che si ottiene nei substrati solidi come il Carboxen, la struttura porosa del rivestimento permette di fissare l analita nei pori della fase solida.
14 Molecular Imprinted Polymers (MIPs)
15 SupelMIP SPE Binding Site
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24 CROMATOGRAFIA SU FASE DIRETTA
25 CROMATOGRAFIA SU FASE INVERSA
26 CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE (GEL FILTRAZIONE)
27 CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO
28 Cromatografia planare Thin Layer Chromatography (TLC) Cromatografia su colonna a bassa pressione (Low Pressure Chromatography-LPC) a media pressione (MPLC) cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC) cromatografia in fase gassosa (GC)
29 Thin Layer Chromatography (TLC)
30 GAS CROMATOGRAFIA
31 Colonne capillari: la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo (0.1-5µm) sulla parete interna di un capillare con diametro mm e lungo da 15 a 100 m. Il carrier percorre il canale lasciato libero dalla fase stazionaria
32 Sistema di iniezione del campione Il campione viene iniettato (mediante opportuna siringa) attraverso un setto di gomma o silicone nella camera riscaldata in testa alla colonna La camera viene generalmente riscaldata circa 50 C oltre il p.e. del componente meno volatile. Per le colonne impaccate il volume del campione varia da 0.1 a 20 µl. Per le colonne capillari la portata è notevolmente inferiore (almeno un fattore di 100) e richiedono un sistema di ripartizione
33 Setto Septum purge Carrier gas Splitting
34 Iniezione frazionata (split) Le colonne capillari hanno una bassa portata: è quindi necessario che solo una frazione del campione iniettato raggiunga la colonna. Il sistema di ripartizione (split) invia solo una parte del campione alla colonna e la rimanente parte viene scaricata (rapporto di frazionamento da 1:50 a 1:100). Si usa tale tecnica quando gli analiti costituiscono almeno lo 0.1% del campione
35 Iniezione non frazionata (splitless) del campione Per campioni diluiti (gli analiti costituiscono meno dello 0.01% del campione) si utilizza la iniezione non frazionata (splitless)
36 Rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID): E ampiamente utilizzato e di tipo universale. anodo L effluente della colonna viene direzionato in una fiamma aria/idrogeno. La maggior parte dei composti organici quando pirolizzati in tale fiamma producono ioni ed elettroni che generano una corrente elettrica (segnale) catodo Vantaggi: buona sensibilità, range dinamico, robusto Svantaggi: metodo distruttivo; non sensibile a composti non idrocarburici come ad es. N 2, O 2, CO 2, NH 3
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38 Rivelatori a cattura di elettroni (ECD): Risponde in maniera selettiva a composti organici contenenti alogeni. Il gas che entra nel rivelatore viene ionizzato da elettroni ad alta energia (radiazioni ) emessi da una lamina contenente 63 Ni radioattivo. La ionizzazione del gas di trasporto (solitamente N 2 ) genera un flusso di elettroni attratti dall anodo (corrente stazionaria). Quando le molecole dell analita ad elevata affinità elettronica entrano nel rivelatore, catturano gli elettroni riducendo la corrente Vantaggi: sensibilità elevata per composti alogenati Svantaggi: non sensibile per ammine, alcoli e idrocarburi
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40 Derivatizzazione in GC La derivatizazzione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto (es. altobollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisiche sono compatibili con l analisi GC La derivatizzazione permette le seguenti modifiche: - aumento la volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH) - riduzione volatilità (permette l analisi di composti volatili a basso peso molecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente) - aumenta la stabilità - aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD) Le principali reazioni di derivatizzazione sono: Silanizzazione Alchilazione acilazione
41 DERIVATIZZAZIONE
42 Reattivi per derivatizzazione Silylation Reagents BSA MSTFA BSTFA HMDS MTBSTFA TMCS TMSI Deriva-Sil Hydrox-Sil Alkylation Reagents 3N HCl in Butanol Acylation Reagents PFPA anidride pentafluoro propionica HFBA anidride eptafluoro butirrica TFAA anidride trifluoroacetica MBTFA HFBI PFPOH pentafluoro propanolo GC Chiral Derivatization TPC MCF
43 Reazioni di silanizzazione BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
44 Reazioni di acilazione es. pentafluoropropionic anhydride (PFPA)
45 Analisi quantitativa 1) Standard esterno 2) Standard interno 3) Metodo dell aggiunta Calcolo fattore di risposta (fa): Ss = area o altezza del picco dell analita da determinare Ssi = area o altezza dello standard interno Csi = concentrazione dello standard interno Cs = concentrazione dell analita da determinare
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SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO. He, Ar, N 2, H 2
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