La gascromatografia. Richard Laurence Millington Synge. Archer John Porter Martin

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1 La gascromatografia

2 La gascromatografia Nella gascromatografia (Gas Chromatography, GC) la fase mobile è un gas permanente (carrier o gas di trasporto) che fluisce attraverso una colonna in cui è posta la fase stazionaria. All uscita della colonna è posto il rivelatore che, connesso ad un sistema di registrazione, fornisce il gascromatogramma. La GC nasce nel 1941 da un idea di Martin e Synge (premio Nobel nel 1952) e poi sviluppata da James e Martin (1952). Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge

3 Prerequisiti fondamentali Perché si possa effettuare un analisi gascromatografica, devono essere soddisfatti i seguenti criteri: In GC è fondamentale che gli analiti possano essere vaporizzati per via termica e a pressione ambiente (principale limite). I componenti della miscela, una volta vaporizzati, sono separati per effetto della ripartizione tra una fase gassosa mobile e una fase stazionaria. La fase mobile non interagisce con l analita e funge esclusivamente da carrier. La separazione dipende quindi dalle caratteristiche chimico-fisiche della fase stazionaria e dalla temperatura.

4 Bombola gas Iniettore Il gascromatografo Gas di eluizione Regolazione flusso Flussimetro Iniettore Colonna Sistema termostatato Rivelatore Colonna Calcolatore Rivelatore Sistema termostatato Registratore Flussimetro

5 Classificazione delle tecniche gascromatografiche In base allo stato fisico della fase stazionaria, la gascromatografia può essere classificata in: gas solido; gas liquido. In base alle caratteristiche geometriche essere classificata in: a colonne impaccate; a colonne capillari. della colonna, la gascromatografia può

6 Le colonne impaccate Nelle colonne impaccate, la fase stazionaria è un solido granulare poroso o un liquido depositato su un supporto di particelle inerti. La colonna è costituita da un tubo d acciaio o di vetro lungo da 1 a 6 metri con un diametro interno di 0,75-4 mm. Fase stazionaria Vetro o acciaio 0,75-4 mm Sezione trasversale di una colonna impaccata

7 Le colonne capillari 1 Nelle colonne capillari, la fase stazionaria viene depositata sotto forma di film sottilissimo (0,1 5 µm) sulla parete interna di un capillare con diametro di 0,1 0,75 mm e lungo da 15 a 100 m. Il gas carrier percorre il canale lasciato libero dalla fase stazionaria. Fase stazionaria liquida Supporto solido rivestito di fase stazionaria Particelle di fase stazionaria solida Parete della colonna Colonna tubolare aperta a pareti rivestite (wall-coated, WCOT) Colonna tubolare aperta a supporto rivestito (supportcoated, SCOT) Colonna tubolare aperta a strato poroso (porous-layer, PLOT)

8 Le colonne capillari2

9 Separazione gascromatografica Le prestazioni di una separazione gascromatografica vengono valutate in base a: Selettività: in GC dipende solo dalla fase stazionaria e dalla sua temperatura. Non esistono differenze tra colonne impaccate e capillari. Efficienza: esistono notevoli differenze tra colonne impaccate e capillari. Per le colonne impaccate, il valore di N è 4.000, mentre per quelle capillari N è nell intervallo (la permeabilità è nettamente superiore nelle colonne capillari e questo permette di raggiungere lunghezze fino a 150 m). Per aumentare l efficienza si può agire sulle seguenti variabili: 1. lunghezza della colonna; 2. diametro delle particelle (per le colonne impaccate); 3. liquido di ripartizione: altamente selettivo per l analita e poco viscoso; 4. diametro interno della colonna (sia per le colonne impaccate, sia per quelle capillari). Risoluzione: fissato N, è solitamente maggiore per le colonne capillari rispetto a quelle impaccate; Asimmetria dei picchi.

10 Fase mobile: il gas carrier Il gas carrier deve avere le seguenti caratteristiche: elevata inerzia chimica verso gli analiti e la fase stazionaria (gas nobili e azoto); elevato grado di purezza: devono essere assenti umidità (disattivazione fase stazionaria), ossigeno (ossidazione fase stazionaria) e idrocarburi (aumento linea base); compatibilità con il rivelatore. I gas di trasporto più usati sono: idrogeno; elio e miscele elio/idrogeno; azoto; argon; biossido di carbonio.

11 Fonte del gas carrier La fonte del gas di trasporto può essere rappresentata da bombole di acciaio dotate di un riduttore di pressione (un secondo riduttore di pressione è presente nel gascromatografo). In alternativa, si possono utilizzare dei generatori di gas (per azoto e idrogeno).

12 Fasi stazionarie solide per GC Le fasi stazionarie solide sono di uso più limitato rispetto alle fasi liquide. Il meccanismo di separazione è per adsorbimento (la separazione dipende dalla forza di legame tra le molecole dell analita e i siti attivi della fase stazionaria). Si utilizza questa tecnica per separare gas che non ripartiscono nella fase liquida (azoto, ossigeno, monossido di carbonio) e molecole organiche e in genere composti basso bollenti come metanolo, etanolo e acqua. I materiali più usati come fase stazionaria sono: gel di silice; allumina; carbone attivo (mediamente polare); zeoliti (silicati di alluminio e sodio).

13 Fasi stazionarie liquide per GC Con le fasi stazionarie liquide, le molecole dell analita si sciolgono nella fase stazionaria liquida. Si ha quindi la ripartizione dell analita tra la fase stazionaria (liquido) e la fase gassosa. Nelle colonne impaccate e nelle SCOT, la fase liquida è ancorata su un supporto inerte che deve avere le seguenti caratteristiche: elevata inerzia chimica; elevata resistenza meccanica e termica; buon grado di bagnabilità da parte del liquido di ripartizione; bassa resistenza al flusso di gas; disponibilità sotto forma di particelle sferiche. I materiali più usati sono: Terra di diatomee (scheletri di piante unicellulari): materiale molto poroso con un buon grado di assorbività (fino al 30% del suo peso). I numerosi gruppi idrossilici vengono rimossi per silanizzazione con dimetilclorosilano (DMCS) o esametildisilazano (HMDS). Teflon: poco adsorbenti. Vetro: poco adsorbenti. Nelle colonne WCOT, la fase stazionaria viene depositata sulle superficie interna della colonna di vetro o di silice fusa.

14 Silanizzazione dei gruppi idrossilici + HCl DMCS + NH 3 HDMS DMCS = Dimetilclorosilano HMDS = Esametildisilazano

15 Liquidi di ripartizione per GC Il liquido di ripartizione da depositare sul supporto solido deve soddisfare numerosi requisiti tra cui: bassa tensione di vapore (per minimizzare la perdita di liquido durante le analisi, poiché la tensione di vapore aumenta esponenzialmente all aumentare della temperatura); elevata stabilità termica; elevata inerzia chimica; buon effetto solvente sulla miscela; bassa viscosità per diminuire la resistenza al trasferimento di massa. Sulla base della polarità, i liquidi di ripartizione si possono suddividere nelle seguenti classi: prima classe: apolari (idrocarburi o siliconi con sostituenti non polari); seconda classe: a bassa polarità quali derivati siliconici (polisilossani) con sostituenti polari; terza classe: polari (poliglicoli, polialcol e loro esteri); quarta classe: molto polari (glicoli, glicerina, idrossiacidi).

16 I polissilossani

17 Scelta della fase stazionaria La scelta della fase stazionaria si basa sulla regola il simile scioglie il suo simile. Ad esempio, le colonne apolari sono le migliori per i soluti apolari. Polarità soluti Non polari Polarità medio-bassa Idrocarburi saturi Eteri Idrocarburi olefinici Chetoni Idrocarburi aromatici Aldeidi Idrocarburi alogenati Esteri Mercaptani Ammine terziarie Solfuri Nitro composti (senza atomi di H in a) CS 2 Nitrili (senza atomi di H in a) Polarità medio-alta Fortemente polari Alcoli Poliidrossialcoli Acidi carbossilici Ammino alcoli Fenoli Idrossiacidi Ammine primarie e secondarie Acidi poliprotici Ossime Polifenoli Nitro composti (con atomi di H in a) Nitrili (con atomi di H in a)

18 Esempio: analisi dell olio essenziale della menta O OH OCOCH 3 b-pinene Limonene Mentone Mentolo Acetato di mentile Colonna apolare Colonna polare (Carbowax)

19 Fase stazionaria legata La fase stazionaria liquida, trascinata dal gas di trasporto, si impoverisce inevitabilmente con il passare del tempo (bleeding). Questo fenomeno comporta l aumento del disturbo del segnale di fondo (noise) in particolare ad elevate temperature. Per ovviare al problema, si lega chimicamente la fase ai gruppi idrossilici della silice di supporto o alle pareti della colonna (fase stazionaria legata). Questo trattamento permette, inoltre, il lavaggio con solvente delle colonne contaminate.

20 Il sistema di iniezione del campione Il campione viene iniettato mediante un opportuna siringa attraverso un setto di gomma o silicone nella camera riscaldata in testa alla colonna. La camera viene generalmente riscaldata a circa 50 C oltre il punto di ebollizione del componente meno volatile. Per le colonne impaccate, il volume del campione varia da 0,1 a 20 µl. Le colonne capillari hanno una portata notevolmente inferiore (di almeno 100 volte) e richiedono un sistema di ripartizione.

21 Iniezione frazionata Le colonne capillari hanno una bassa portata e, pertanto, è necessario che solo una frazione del campione iniettato raggiunga la colonna. Il sistema di ripartizione (split) invia solo una parte del campione alla colonna e la rimanente parte viene scaricata (rapporto di frazionamento da 1:50 a 1:100). Si usa tale tecnica quando gli analiti costituiscono almeno lo 0,1% del campione.

22 Iniezione non frazionata o splitless Per campioni diluiti e cioè per quelli in cui gli analiti costituiscono meno dello 0,01% del campione, si utilizza l iniezione non frazionata (splitless).

23 Temperatura Sistema di termostatazione della colonna La temperatura è cruciale nelle separazioni cromatografiche e, pertanto, la colonna è alloggiata in forni termostatati. L analisi GC può essere effettuata a temperatura costante (isoterma) o a temperatura variabile (gradiente di temperatura). Le rampe di temperatura possono essere lineari o asimmetriche con diverse fasi di plateau. Tempo

24 Effetto della temperatura nella separazione 1 Isoterma (45 C) Isoterma (145 C) Gradiente (da 30 a 180 C)

25 Effetto della temperatura nella separazione 2 Isoterma (150 C) Temperatura programmata ( C, 8 C/min)

26 Effetto della temperatura nella separazione 3 1,5 C/min 16 C/min

27 I rivelatori I rivelatori sono dei dispositivi posti all uscita della colonna che consentono di individuare i componenti di una miscela. Si distinguono in rivelatori universali e rivelatori selettivi. Quest ultimi consentono di individuare solo particolari classi di composti. Il rivelatore ideale, per essere considerato tale, deve avere le seguenti caratteristiche: adeguata sensibilità; buona stabilità e riproducibilità; risposta lineare in un intervallo di parecchi ordini di grandezza; tempo di risposta breve.

28 Il rivelatore a ionizzazione di fiamma Il rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) è molto utilizzato ed è di tipo universale. Anodo Catodo L effluente della colonna viene direzionato in una fiamma alimentata da una miscela aria/idrogeno. La maggior parte dei composti organici quando pirolizzati in tale fiamma producono ioni ed elettroni che generano una corrente elettrica che costituisce il segnale. Vantaggi: buona sensibilità, range dinamico, robusto. Svantaggi: metodo distruttivo, non sensibile a composti non idrocarburici come ad esempio N 2, O 2, CO 2 e NH 3.

29 Il rivelatore a conducibilità termica Il rivelatore a conducibilità termica (TCD), sebbene sia stato uno dei primi ad essere utilizzato, è ancora oggi piuttosto diffuso. E un esempio di rivelatore robusto e universale. Il rivelatore dipende da un elemento riscaldato elettricamente (filamento di tungsteno o platino), la cui temperatura dipende dalla conducibilità termica del gas che lo circonda (ad esempio He e H 2 hanno una buona conducibilità termica). La presenza di analiti (organici e inorganici) riduce la conducibilità termica del gas con conseguente incremento della temperatura filamento e diminuzione della conducibilità elettrica che viene rilevata come segnale. Differenza di potenziale Vantaggi: detector semplice, robusto, universale, range dinamico. Uscita del flusso Svantaggi: bassa sensibilità. Filamento riscaldato Ingresso del flusso

30 Il rivelatore a cattura di elettroni Il rivelatore a cattura di elettroni (ECD), risponde in modo selettivo a composti organici contenenti alogeni: Il gas che entra nel rivelatore viene ionizzato da elettroni ad alta energia (radiazioni b) emessi da una lamina contenente 63 Ni radioattivo. La ionizzazione del gas di trasporto (solitamente N 2 ) genera un flusso di elettroni attratti dall anodo (corrente stazionaria). Quando le molecole dell analita ad elevata affinità elettronica entrano nel rivelatore, catturano gli elettroni riducendo la corrente. Anodo (+) Dalla colonna Catodo (-) Emettitore b Vantaggi: sensibilità elevata per composti alogenati. Svantaggi: non sensibile alle ammine, alcoli e idrocarburi.

31 La derivatizzazione La derivatizzazione è un processo che permette di modificare chimicamente un composto (ad esempio alto bollente) al fine di ottenere un nuovo composto le cui proprietà chimico-fisiche sono compatibili con l analisi GC. La derivatizzazione permette le seguenti modifiche: aumento la volatilità (elimina la presenza di gruppi polari come OH, SH, NH); riduzione volatilità (permette l analisi di composti volatili a basso peso molecolare difficili da maneggiare e che coeluiscono con il solvente); aumenta la stabilità; aumenta la sensibilità (inserimento di gruppi alogenati per ECD). Le principali reazioni di derivatizzazione sono: silanizzazione; alchilazione; acilazione.

32 Derivatizzazione mediante silanizzazione 1 La reazione di silanizzazione produce composti volatili e stabili termicamente. In tale reazione, l H attivato viene sostituito con un gruppo trimetilsililico mediante una reazione di attacco nucleofilo (S N 2; la reazione è guidata dal gruppo uscente). L agente silanizzante più semplice è il trimetilclorosilano (CH 3 ) 3 -Si-Cl (TMS-Cl). -OH -SH -COOH -NH 2 -NH -CONH 2 TMS-Cl -OTMS -STMS -COOTMS -NHTMS, N(TMS) 2 -NTMS -CONHTMS La reattività del gruppo funzionale verso la silanizzazione è la seguente: Alcoli (primario > secondario > terziario) > fenolo > carbossile > ammina > ammide

33 Derivatizzazione mediante silanizzazione 2 Dato che i reattivi di silanizzazione reagiscono con H 2 O, è necessario usare solventi anidri come la piridina che è il solvente più utilizzato. Le colonne caratterizzate da idrogeni attivi (CARBOWAX) non sono compatibili con questi agenti derivatizzanti. I principali agenti silanizzanti sono: (CH3) 3 -Si-Cl TMS-Cl (Trimetilclorosilano) (CH 3 ) 3 Si-imidazolo TMSIM (Trimetilsililimidazolo) N.B.: selettivo per OH, non reagisce con ammine (CH 3 ) 3 -Si-O-C(CH 3 )=N-Si(CH 3 ) 3 BSA (N,O-bis-trimetilsilil-acetamide) (CH 3 ) 3 -Si-N(C 2 H 5 ) 2 TMS-DEA (N-trimetilsilil-dietilamina)

34 Derivatizzazione mediante alchilazione La derivatizzazione mediante alchilazione riduce la polarità di molecole sostituendo idrogeni attivi con gruppi alchilici. La reazione si effettua con alogenuri alchilici o arilici e diazoalcani secondo le reazioni: R-NH Cl-R R-NR + 2 HCl R-COOH + CH 2 N 2 RCOO-CH 3 + N 2 R-OH R-SH R-COOH R-NH 2 R-NH 2 R-CONH 2 R-OR R-SR R-COOR R-NHR R-NR 2 R-COONR 2 Tra i principali agenti alchilanti vanno annoverati: BF 3 (trifluoruro di boro, è un acido di Lewis) in MeOH, dialchilacetali, pentafluorobenzilbromuri.

35 Derivatizzazione mediante acilazione La reazione di acilazione riduce la polarità di gruppi amminici, idrossilici, tiolici e inserisce gruppi funzionali alogenati per ECD. La reazione di acilazione si utilizza per composti altamente polari come carboidrati e amino acidi. I reattivi utilizzati sono solitamente anidridi e alogenuri acilici. I principali agenti derivatizzanti sono anidridi fluorinate come l anidirde pentafluoropropionica e l anidride eptafluorobutirrica. O O O O CF 3 CF 2 O CF 2 CF 3 CF 3 CF 2 CF 2 O CF 2 CF 2CF3 Andidride pentafluoropropionica Andidride eptafluorobutirrica

36 Esempio di derivatizzazione mediante acilazione NH OH Efedrina Tailing Anidride trifluoroacetica O O CF 3 O CF 3

37 Esempio di derivatizzazione Analisi della composizione in acidi grassi di trigliceridi mediante transesterificazione.

38 Applicazioni della gascromatografia La gascromatografia può trovare i seguenti utilizzi: Gascromatografia Analisi qualitativa Analisi quantitativa Conferma della presenza o dell assenza di un composto in una data miscela (è richiesto l uso di uno standard). Dosaggio di una sostanza anche in miscela

39 Analisi quantitativa con la gascromatografia 1 La gascromatografia è ampiamente usata per l analisi quantitativa; infatti, l altezza o l area dei picchi è proporzionale alla quantità dei diversi componenti presenti nella miscela analizzata. Esistono diversi metodi di misura della concentrazione tra cui si possono annoverare: Metodo dello standard esterno: consente di determinare la concentrazione di uno o più componenti utilizzando uno standard e allestendo una curva di calibrazione. Metodo dello standard interno: aggiunta singola o multipla con curva di calibrazione. Normalizzazione: è il metodo usato per determinare la composizione percentuale quando tutti i componenti della miscela sono rappresentati nel cromatogramma.

40 Analisi quantitativa con la gascromatografia 2 Generalmente, in GC si preferisce usare uno standard interno che consente analisi quantitative più accurate. Tale tecnica consiste nell aggiunta di una quantità nota di una molecola alla miscela da analizzare preparata a diverse diluizioni. Nel preparare la curva di calibrazione, bisogna tener conto del fatto che l asse delle y non si riferisce all area del picco dell analita, ma al rapporto tra l area del picco dell analita e quella dello standard interno. Lo standard interno deve soddisfare i seguenti requisiti: non deve essere presente nella miscela da analizzare; il suo picco deve essere ben risolto rispetto agli altri componenti; deve avere un tempo di ritenzione simile a quello dell analita; deve avere una concentrazione simile a quella dell analita; deve essere privo di impurezze; non deve reagire col campione.

41 Esempio d uso dello standard interno Analita (ng/ml) Area analita Area std interno Rapporto aree 2,5 74, , , , , , ,55 Senza standard interno Con standard interno Area y = 38,943x + 35,646 R 2 = 0, Rapporto aree analita/standard 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 y = 0,0889x - 0,0099 R 2 = Concentrazione (ng/ml) Concentrazione (ng/ml)

42 Applicazioni della GC nella Farmacopea Europea Le principali applicazioni della gascromatografia riportate nella Farmacopea Europea possono essere così riassunte: determinazione titolo; identificazione e analisi quantitativa di droghe; determinazione quantitativa e semiquantitativa di impurezze; determinazione della presenza di solventi residui; determinazione della presenza di pesticidi (per es. nelle droghe vegetali).

43 Cholesterol 1 Cholesterolum C 27 H 46 O Mr DEFINITION Cholesterol contains not less than 95.0 per cent of cholest-5-en-3β-ol and not less than 97.0 per cent and not more than per cent of total sterols, calculated with reference to the dried substance. ASSAY Examine by gas chromatography (2.2.28), using pregnenolone isobutyrate CRS as the internal standard. Internal standard solution. Dissolve g of pregnenolone isobutyrate CRS in heptane R and dilute to ml with the same solvent. Test solution. Dissolve 25.0 mg of the substance to be examined in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution. Reference solution. Dissolve 25.0 mg of cholesterol CRS in the internal standard solution and dilute to 25.0 ml with the same solution.

44 Cholesterol 2 The chromatographic procedure may be carried out using: a fused-silica column 30 m long and 0.25 mm in internal diameter coated with poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm), helium for chromatography R as the carrier gas with a split ratio of 1:25 at a flow rate of 2 ml/min, a flame-ionisation detector, maintaining the temperature of the column at 275 C, that of the injection port at 285 C and that of the detector at 300 C. Inject 1.0 µl of each solution. The assay is not valid unless the resolution between the peaks due to pregnenolone isobutyrate and cholest-5-en-3β-ol in the chromatogram obtained with the reference solution is at least Calculate the percentage content of cholest-5-en-3β-ol, using the declared content of cholest- 5-en-3β-ol in cholesterol CRS. Calculate the percentage content of total sterols by adding together the contents of cholest-5-en-3β-ol and other substances with a retention time less than or equal to 1.5 times the retention time of cholest-5-en-3β-ol. Disregard the peaks due to the internal standard and the solvent.

45 RRR-α-Tocopherol 1 RRR-α-Tocopherolum C 29 H 50 O 2 Mr DEFINITION (2R)-2,5,7,8-Tetramethyl-2-[(4R,8R)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-6-ol. Content: 94.5 per cent to per cent. ASSAY Related substances. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Internal standard solution. Dissolve 1.0 g of squalane R in cyclohexane R and dilute to ml with the same solvent. Test solution (a). Dissolve g of the substance to be examined in 10.0 ml of the internal standard solution. Test solution (b). Dissolve g of the substance to be examined in 10.0 ml of cyclohexane R. Reference solution (a). Dissolve g of α-tocopherol CRS in 10.0 ml of the internal standard solution.

46 RRR-α-Tocopherol 2 Reference solution (b). Dissolve 10 mg of α-tocopherol R and 10 mg of α-tocopheryl acetate R in cyclohexane R and dilute to ml with the same solvent. Column: material: fused silica; size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm; stationary phase: poly(dimethyl)siloxane R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1 ml/min. Split ratio: 1:100. Time (min) Temperature ( C) Column Injection port 290 Detector 290 Detection: flame ionisation. Injection: 1 µl of test solution (b) and reference solution (b). System suitability: reference solution (b): resolution: minimum 3.5 between the peaks due to α-tocopherol and α-tocopheryl acetate. Limits: maximum 4.0 per cent

47 Star anise oil 1 Anisi stellati aetheroleum DEFINITION Essential oil obtained by steam distillation from the dry ripe fruits of Illicium verum Hook. fil. TESTS Chromatographic profile. Gas chromatography (2.2.28): use the normalisation procedure. Test solution. Dissolve 200 µl of the substance to be examined in 1.0 ml of hexane R. Reference solution. To 1.0 ml of hexane R, add 20 µl of linalol R, 20 µl of estragole R, 20 µl of α-terpineol R, 60 µl of anethole R and 30 µl of anisaldehyde R. Column: material: fused silica, size: l = 30 m, Ø = 0.25 mm, stationary phase: macrogol R (film thickness 0.25 µm). Carrier gas: helium for chromatography R. Flow rate: 1.0 ml/min. Split ratio: 1:100. Detection: flame ionisation. Injection: 0.2 µl.

48 Star anise oil 2 resolution: minimum 1.5 between the peaks due to estragole and α-terpineol. Using the retention times determined from the chromatogram obtained with the reference solution, locate the components of the reference solution in the chromatogram obtained with the test solution and locate cis-anethole and foeniculin using the chromatogram shown in Figure (disregard any peak due to hexane). Determine the percentage content of these components. The percentages are within the following ranges: linalol: 0.2 per cent to 2.5 per cent, estragole: 0.5 per cent to 6.0 per cent, α-terpineol: less than 0.3 per cent, cis-anethole: 0.1 per cent to 0.5 per cent, trans-anethole: 86 per cent to 93 per cent, anisaldehyde: 0.1 per cent to 0.5 per cent, foeniculin: 0.1 per cent to 3.0 per cent.

49 Star anise oil 3 1. linalol 3. α-terpineol 5. trans-anethole 7. foeniculin 2. estragole 4. cis-anethole 6. anisaldehyde