Le gibberelline sono state scoperte studiando il fungo che causava la malattia della pazzia del riso

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1 Le gibberelline

2 Le gibberelline sono state scoperte studiando il fungo che causava la malattia della pazzia del riso Piante non infettate Pianta infettata e cresciuta in modo anomalo Malattia bakanae (Gibberella fujikuroi) Ingrandimento di pianta infettata Il termine bakanae in giapponese significa plantula impazzita e fu usato dagli agricoltori giapponesi per descrivere una malattia a cui andavano soggette alcune piante di riso. Esse mostravano (vedi figura) un allungamento talmente esagerato da non essere in grado di sostenersi. Inoltre tali piante erano maschio-sterili. Nel 1930 fu scoperto da ricercatori giapponesi che la pazzia delle piante di riso era causata da un fungo patogeno (Gibberella fujikuroi). Attualmente la malattia è presente in tutto il continente asiatico dove causa perdite pari anche al 70% del raccolto. Gibberella fujikuroi

3 Le gibberelline furono isolate prima da estratti fungini e poi dalle piante Nel 1950 fu purificata la prima gibberellina da estratti colturali di Gibberella fujikuroi. Fu chiamata acido gibberellico (Gibberellic Acid = GA). In seguito furono scoperte altre tre gibberelline da filtrati colturali dello stesso fungo. Diverse industrie chimiche cominciarono allora a produrre gibberelline da Gibberella fujikuroi e tali composti iniziarono ad essere usati in agricoltura. Il primo risultato sorprendente ottenuto fu la stimolazione dell allungamento in piante di pisello e di mais nane. Da allora si iniziò a cercare le GA nelle piante, di cui si trovarono livelli molto bassi: ppm (mg/litro di acqua) in semi immaturi, 1-10 ppb (mg/litro di acqua) nei tessuti vegetativi. Pisello wild-type Mais Pisello nano wild type wild type +GA mutante nano mutante nano + GA I celebri piselli di Mendel sono nani e deficienti in gibberelline.

4 Le gibberelline: caratteristiche chimiche e biosintesi

5 Le gibberelline sono una famiglia di composti Le gibberelline (GA = Gibberellic Acid) sono una famiglia di composti. Attualmente sono state identificate circa 136 GAs ( tutte presentanti una simile struttura chimica (ent-gibberellano). Tuttavia sono poche (4) le GAs dotate di attività biologica. NB: La nomenclatura delle GAs è basata su di una numerazione sequenziale temporale relativa alla loro scoperta. *ent-gibberellano (tetraciclo a 20 C) *Il prefisso ent è riferito al fatto che lo scheletro del gibberellano deriva dall ent-kaurene, un idrocarburo tetraciclico enantiomero del kaurene

6 Le gibberelline sono una famiglia di composti GA 4 è la gibberellina più attiva in Arabidopsis Cerchiati in blu i gruppi comuni alle gibberelline, in verde o marrone le differenze strutturali. lattone C4 H H gruppo ossidrilico C3 gruppo carbossilico C7 Solo alcune delle GA risultano biologicamente attive. In figura sono riportate le GAs con attività biologica maggiore. Sono tutte a 19 C, avendo perduto il C in 20.

7 Le gibberelline sono terpenoidi I terpenoidi sono la classe principale di metaboliti secondari delle piante. La maggioranza dei composti di tale classe sono insolubili in acqua. I terpenoidi sono costituiti dall unione di più unità strutturali di base a 5 C, l isoprene. Tale composto si ottiene dalla decomposizione per riscaldamento dei terpenoidi ad alte temperature. I terpenoidi sono classificati in base al numero delle loro unità isopreniche: monoterpeni (C10); es. olii essenziali menta, sesquiterpeni (C15); es. ABA diterpeni (C20); es. fitolo e gibberelline triterpeni (C30); es. steroli tetraterpeni (C40); es. carotenoidi politerpeni ([C5]n dove n >8) isoprene

8 Le vie di sintesi dei terpenoidi sono: 1) la via dell acido mevalonico (MVA, citosolica); 2) la via del metileritriolo fosfato (MEP, plastidiale). Nella prima via 3 molecole di acetil-coa sono unite insieme a dare l acido mevalonico, che viene pirofosforilato, decarbossilato e deidratato per dare l isopentenil difosfato (IPP), la forma attivata (fosforilata) dell unità base o isoprene. Nella seconda via l IPP può formarsi da intermedi della glicolisi o del ciclo di Calvin. La gliceraldeide 3-P e due atomi derivanti dal piruvato sono condensati a dare un intermedio a 5C, l 1-deossi-D-xilulosio-5- fosfato. Esso è ridotto a MEP che è convertito in IPP. I terpenoidi sono prodotti attraverso due vie L IPP ed il suo isomero, dimetilallil difosfato (DMAPP) sono le due forme attivate (unità isopreniche di base) che verranno unite enzimaticamente a dare i vari terpeni. isoprene

9 I principali composti derivanti dalla sintesi dei terpenoidi

10 La via di biosintesi delle gibberelline Le gibberelline sono prodotte in differenti compartimenti cellulari attraverso tre stadi: MEP Stadio 1. Avviene nei plastidi e comporta l unione di 4 unità di IPP (derivazione citosolica e plastidiale) a dare un composto C20 il geranilgeranil difosfato (GGPP). Esso è convertito attraverso due reazioni nello scheletro base delle GAs l ent-kaurene. Stadio 2. Avviene nell involucro plastidiale e nel reticolo endoplasmatico (ER). L ent-kaurene è convertito attraverso varie reazioni ossidative nella prima gibberellina prodotta, GA 12. Gli enzimi chiave di questo processo sono l ent-kaurene ossidasi (KO) e l acido ent-kaurenoico ossidasi (KAO). Stadio 3. Avviene nel citoplasma. GA 12 è convertita in GAs biologicamente attive, mediante differenti di idrossilazione. Queste GAs sono ulteriormente metabolizzate ( deattivate ) in altre GAs. MVA = Acido Mevalonico; MEP = metileritrolo fosfato CPS = entcopallil difosfato sintasi; KS = ent-kaurene sintasi; KO = ent-kaurene ossidasi ; KAO = acido ent-kaurenoico ossidasi ; GA20 ox = GA20 ossidasi; GA13ox = GA13 ossidasi; GA3 ox = GA3 ossidasi; GA2ox = GA2ossidasi

11 I mutanti biosintetici di Arabidopsis e riso hanno permesso di capire quali delle circa 136 GAs trovate nelle piante hanno attività biologica e quali sono i geni coinvolti nella loro biosintesi.

12 I primi enzimi biosintetici sono codificati da geni singoli: la perdita della loro funzione origina mutanti nani estremi Mutazioni loss-of-function dei geni codificanti per CPS e KS in riso GGPP CPS CPP KS ent-kaurene Wild-type e mutanti nani (os) di riso (Oryza sativa ) NB. Queste reazioni avvengono nel plastidio. CPS, copallil difosfato sintasi KS, ent-kaurene sintasi oscps-1 osks-1 I mutanti sono talmente piccoli da essere difficilmente visibili. Ingrandimenti sono mostrati in B e in C. WT oscps-1 osks-1

13 I primi enzimi biosintetici sono codificati da geni singoli: la perdita della loro funzione origina mutanti nani estremi Mutazioni loss-of-function dei geni codificanti per KO e KAO in pisello Il gene NA di pisello codifica l enzima acido ent-kaurenoico ossidasi (KAO). entkaurene KO acido entkaureonico Il gene LH di pisello codifica per l enzima entkaurene ossidasi (KO) KAO GA 12 NB. Queste reazioni avvengono nel RE.

14 Gli ultimi enzimi biosintetici sono codificati da geni multipli: la loro mutazione origina mutanti seminani Mutazione del gene/i codificante per GA 20-ossidasi in riso Il riso della varietà semidwarf1 sviluppato durante la Geen Revolution. Il mutante sd1 è mutato in un gene codificante la GA 20-ossidasi. Tale gene è espresso nel fusto, ma non nei tessuti riproduttivi. Pertanto si ha riduzione della taglia ma non della produzione di semi. Ciò ha portato all aumento delle rese del raccolto. GA 13- idrossilasi GA 12 GA 53 Perché la mutazione origina individui seminani e non nani estremi? Essendo la GA 20-ossidasi espressa da geni multipli, la mutazione non porta ad un individuo nano estremo, come nei casi precedenti, ma ad un seminano, poiché gli altri geni compensano in parte per la produzione dell enzima. GA 20-ossidasi (sd1) GA 9 GA 20 GA 3-ossidasi GA GAs 4 GA attive 1 NB. Queste reazioni avvengono nel citoplasma.

15 Gli ultimi enzimi biosintetici sono codificati da geni multipli: la loro mutazione origina mutanti seminani Mutazione del gene/i codificante per GA 3-ossidasi in pisello e in Arabidopsis Pisello Arabidopsis GA 13-idrossilasi GA 12 GA 53 GA 20-ossidasi WT le WT ga4 Il mutante le di pisello studiato da Mendel è mutato nel gene codificante la GA3- ossidasi; stessa cosa per il mutante ga4 di Arabidopsis. GA 9 GA 20 GA 3-ossidasi (le) (ga4) GA 4 GA 1 NB. Queste reazioni avvengono nel citoplasma.

16 Via biosintetica delle GAs Stadio 3 - citoplasma Stadio 1 - proplastidio Active GAs Stadio 2 - endomembrane

17 Le gibberelline: catabolismo

18 Catabolismo delle GAs bioattive Le GAs bioattive possono essere disattivate dalla GA 2-ossidasi GA 4 HO GA 2-ossidasi HO HO

19 Gli enzimi disattivanti riducono la concentrazione di gibberelline bioattive: GA 2-ossidasi Non sono noti fenotipi di mutanti di Arabidopsis per la GA 2-ossidasi. Nei piselli questo enzima è codificato dal gene SLENDER (SLN), così definito poiché dalla sua mutazione si originano plantule più alte o slanciate del wild type. GA 2- oxidase Inactive forms GA 13- hydroxylase GA 12 GA 53 GA 20-oxidase GA 9 GA 20 GA 3-oxidase GA 2- oxidase Inactive forms GA 4 GA 1 Phenotype: Slender Genotype: NA/LE/sin GA1 content: higher than WT Inactive forms GA 2-oxidase Inactive forms Altre forme di inattivazione epossidazione mediante citocromo P450 monoossigenasi metilazione (nel seme) coniugazione con zuccheri

20 La biosintesi delle GAs e la loro disattivazione sono strettamente controllate Questo tipo di regolazione fa sì che il contenuto di GA cambi in funzione di segnali di sviluppo o ambientali. Le mutazioni che causano riduzioni della concentrazione di GA alterano questo tipo di regolazione a feedback positivo o negativo. L auxina stimola l espressione dei geni per la biosintesi delle GAs. Auxina La luce e la temperatura regolano il gene della GA 3ox GA 4 e GA 1 bioattive inibiscono la sintesi delle GAs (inibizione dei geni GA 20ox e GA 3ox) e stimolano la loro disattivazione (stimolazione del gene GA 2ox). La maggioranza dei geni delle GAs sono espressi diversamente (tessuto-specifico). feedback negativo feedback positivo

21 La maggioranza dei geni mutati usati nella Green Revolution influenzano la biosintesi della GA 1 Wild-type Semi-nano Attiva In riso le varietà semi-nane producono meno GA 1 a causa di una mutazione del gene/i codificante per la GA 20-ossidasi. Questo dato è stato confermato nel pisello e nel mais. Conclusioni: da studi di questi mutanti è emerso che la GA 1 è la gibberellina bioattiva che regola l accrescimento del fusto di pisello, mais e riso. Eccezioni sono Arabidopsis, zucca e cetriolo (Cucurbitaceae) dove la GA 4 ha maggiore attività biologica.

22 L altezza delle piante può essere ridotta con approcci tradizionali: le mutazioni e la selezione È un approccio complesso e stocastico, poiché spesso i mutanti sono letali o recano difetti gravi (aumento della dormienza dei semi, fiori anomali ecc.). Un approccio per ottenere mutanti è l irraggiamento di semi o plantule con raggi γ e la selezione. L unico mutante importante ottenuto con tale tecnica in Italia è il grano della varietà Creso ottenuto dalla varietà di grano duro Senatore Cappelli (taglia alta). Il grano Creso è attualmente estesamente coltivato in Italia. Non è tuttavia scomparsa la coltivazione del Cappelli nel Sud Italia (Puglia e Basilicata). L irraggiamento ha causato una mutazione nel gene Rht1 responsabile della trasduzione del segnale da gibberelline: il mutante è insensibile alle gibberelline e quindi semi-nano, ma altamente produttivo

23 L altezza delle piante può essere ridotta con approcci moderni: l ingegneria genetica Nei cereali come grano e riso si cerca di diminuire l altezza per evitare l allettamento ed aumentare la produttività. Sperimentalmente si è alterata l espressione dei geni che sono responsabili della biosintesi di GA 1 (GA20ox o GA3ox) o del gene responsabile del suo catabolismo (GA2ox). Nel primo caso inibendo l espressione genica (costrutti antisenso dei due geni), nel secondo caso sovraesprimendo il gene (inserimento del gene di un altro organismo). In alberi come il pioppo si è invece sovraespresso il gene GA20ox, inserendo l analogo gene di Arabidopsis. Il risultato è l aumento delle fibre del legno e della loro lunghezza, una qualità molto utile nella fabbricazione della carta. Wheat

24 Le gibberelline: trasporto e trasmissione per innesto

25 Diversamente dall auxina, le GAs non sono trasportate in modo polare Orientamento normale Orientamento invertito La stessa quantità di GA si sposta dal blocchetto donatore superiore al blocchetto ricevente inferiore indipendentemente dall orientamento del segmento di fusto. Al contrario, l auxina si muove in modo polare dall apice alla base del fusto.

26 GAs sono trasmissibili attraverso innesti; possono percorrere lunghe distanze WT - d1 Il mutante di pisello na con anomalie nella crescita del fusto è salvato mediante un innesto, a livello della radice, con una pianta non mutata Na. Le plantule di mais sono innestate lateralmente. d1- d1 na na na Na Nel mais, GAs si muovono dalla pianta wild-type alla pianta mutata nana d1 promuovendone la crescita.

27 Le gibberelline: la via di trasduzione del segnale

28 Risposte al GA in Arabidopsis 1) Mutante per la biosintesi 2) Mutante per la risposta Non avviene il signaling di GA 3) Mutante per la risposta La risposta al GA è espressa costitutivamente 1) È caratterizzato da bassissimi livelli di GA per cui la somministrazione dell ormone porta ad un fenotipo normale. 2) È caratterizzato da livelli normali di GA ma assenza di risposta sia all ormone endogeno che alla sua somministrazione. 3) È caratterizzato da livelli bassi di GA, ma altezza elevata, insensibilità alla somministrazione di GA esogeno e alla somministrazione di inibitori della sintesi di gibberelline. NB: questo mutante slender non va confuso con il mutante slender di pisello dove la maggiore altezza è dovuta al ridotto catabolismo di GA per mancata funzione della GA 2 -ossidasi. In conclusione si ipotizza che sia andato perduto con la mutazione l inibitore (DELLA) del signaling del GA (vedi dopo).

29 La classe di mutanti GA-insensitive dwarf1 (gid1) ha permesso di identificare il recettore delle GAs GA-insensitive dwarf1 (gid1) sono mutanti nani insensibili al GA Se si causano nel riso mutazioni che portano alla sostituzioni anche di un solo nucleotide nel gene GID1 si ottengono piante nane e insensibili al GA. Ingrandimento di gid1-1 [ ] CRESCITA Diversamente dai mutanti per la biosintesi, il mutante di riso gid1 non è recuperato per somministrazione di GA: è un mutante gibberellininsensitive. WT gid1-1

30 Se si sovraesprime il gene GID1 si originano piante di riso ipersensibili al GA [ ] CRESCITA Le precedenti osservazioni e queste sono consistenti con il fatto che GID1 è un possibile recettore di GA. Altri studi hanno mostrato che il prodotto del gene GID è una proteina solubile localizzata nel nucleo.

31 Arabidopsis ha tre geni ortologhi* a GID1 di riso Sono stati identificati tre geni GID in Arabidopsis: GID1a, GID1b e GID1c. Questa ridondanza genica fa si che ogni gene sia capace a codificare per un recettore di GA, come dimostrato dalla tripla mutazione di GID. Il possesso di più recettori è vantaggioso: ad ogni concentrazione ormonale più molecole di ormone saranno legate ai recettori scatenando il signaling e quindi maggiore risposta. A mutante triplo Come per il riso, il mutante privo di GID è insensibile al GA. WT gid1a-1 gid1b-1 gid1c-1 gid1a-1 gid1b-1 Mutanti singoli gid1c-1 *Ortologhi = geni di specie diverse che, essendosi evoluti da un gene ancestrale comune, sono evolutivamente affini.

32 Caratteristiche strutturali del recettore GID La struttura terziaria del prodotto del gene GID1 (riso) e GID1a (Arabidopsis) è stata di recente determinata. Questa proteina si lega a GA 3 o GA 4 in Arabidopsis e a GA 4 in riso. In entrambi i casi l ormone si lega col C-6 in una tasca di GID1 (presente nel core della proteina) attraverso legami ad H con due residui di serina della proteina e molecole di acqua ad essa legate. Nella parte superiore il GA reagisce con la porzione N-terminale ad elica di GID1 che forma una specie di coperchio (lid) di chiusura del recettore, seppellendo il GA all interno di GID1. Questa porzione ad elica può a sua volta interagire con altre proteine come DELLA. Tuttavia non c è contatto diretto tra GA e DELLA. INIBITORE tasca

33 Come funziona GID1? GA è considerato un attivatore allosterico di GID1. A seguito del legame dell ormone con GID1 è causato un cambiamento conformazionale nel dominio DELLA (porzione N-terminale della proteina DELLA) che si lega a GID1. Questo cambiamento induce anche un altro cambiamento conformazionale nell altro dominio, detto GRAS, della proteina DELLA. Le proteine DELLA sono in realtà una sottoclasse della famiglia dei fattori di regolazione della trascrizione GRAS. Le proteine DELLA hanno due domini: 1) il dominio N-terminale in cui i primi 5 aminoacidi sono acido aspartico (D), acido glutammico (E), leucina (L), leucina (L) e alanina (A) (acronimo DELLA); 2) il dominio C-terminale, denominato GRAS [(acronimo derivante dalle iniziali dei primi tre membri della famiglia scoperti GA-INSENSITIVE (GAI), REPRESSOR OF ga1-3 (RGA) e SCARECROW (SCR)]. Lid chiuso Lid aperto Legame con GID1

34 Le proteine DELLA sono inibitori della risposta al GA Cambiamento conformazionale di DELLA Legame di F-box Le proteine DELLA sono considerate inibitori della risposta al GA: la loro degradazione proteolitica determina perciò la risposta biologica all ormone. Il cambiamento conformazionale di GRAS faciliterebbe il legame del componente F-box del complesso SCF. La proteina F-box legherebbe l ubiquitina al dominio GRAS della proteina DELLA che sarebbe così avviata alla degradazione sul proteasoma. A seguito della degradazione di DELLA si verifica la risposta biologica. Degradazione di DELLA RISPOSTA BIOLOGICA

35 Modello della via di signaling delle gibberelline GA assente GA presente Le proteine DELLA inibiscono la crescita attraverso il blocco della trascrizione. Il GA scatena la proteolisi delle proteine DELLA e quindi promuove la crescita. Reprinted from Davière, J.-M., de Lucas, M., and Prat, S. (2008) Transcription factor interaction: a central step in DELLA function. Curr. Opin. Genet. Devel. 18: with permission from Elsevier

36 Un sistema modello per lo studio del GA: lo strato di aleurone di cereali

37 Germinazione e mobilizzazione delle riserve in semi di cereali Cellule dell aleurone α-amilasi (e indirettamente β- amilasi) PSV = protein storage vescicole; N = nucleo; G = globoide di fitina Nei semi di cereali la degradazione delle riserve dipende dalla presenza dell embrione. L embrione produce GA 3 ; in semi privati di embrione, esso può essere sostituito dall applicazione di GA 3 o GA 1. L ormone diffonde nell endosperma (aleurone) promuovendo la trascrizione di geni codificanti per l α-amilasi (idrolisi dell amido) e per le proteasi (idrolisi delle proteine di riserva).

38 Rilascio stimolato dalla gibberellina di α-amilasi da semi dimezzati di orzo I semi, tagliati a metà per rimuovere l embrione, erano incubati per 48 ore sulla superficie di un gel di agar in cui era incluso amido. Il gel era successivamente lavato con tintura di iodio, che reagisce con l amido formando un colore blunero. I cerchi bianchi intorno ai semi dimezzati mostrano che l amido è stato digerito, indicando così la presenza di attività α-amilasica. La piastra B conteneva 10 nmoli di GA. Il controllo A mostrava nulla o scarsa produzione di α- amilasi in assenza del trattamento ormonale. A B Attività α-amilasica

39 in isolated aleuron cells GA 3 stimola la trascrizione del gene dell α-amilasi GA 3 regola la trascrizione di geni dell α-amilasi presenti nelle cellule dell aleurone. Sono stati sequenziati sia i geni strutturali dell enzima che le sequenze facenti parte dei geni promotori. Una di queste, denominata GARE (GA Response Element), è essenziale per la trascrizione del gene α-amilasi ed è presente in tutti i cereali. La sequenza GARE (TAACAAA) del promotore assomiglia alla sequenza a cui si legano le proteine MYB (fattori di trascrizione). Nell orzo le proteine MYB implicate nel signaling della gibberellina sono dette GAMYB. Esse funzionerebbero come regolatori positivi della trascrizione del gene dell α-amilasi. A conferma di ciò la sintesi dello mrna delle proteine GAMYB inizia dopo 1 ora dal trattamento con GA degli aleuroni isolati, mentre lo mrna per l α-amilasi aumenta successivamente. Inoltre mutazioni di GARE impediscono il legame di MYB e la sintesi di α-amilasi.

40 Trasduzione del segnale della GA in aleuroni isolati di cereali

41 Le gibberelline: effetti fisiologici

42 Effetti delle gibberelline sulla crescita e sullo sviluppo Stimolano la germinazione dei semi Stimolano la crescita di fusti e radici Regolano il passaggio dalla fase giovanile alla fase adulta Determinano il sesso in alcune specie Promuovono la crescita del frutto e la partenocarpia GA 4

43 GAs sono necessarie per la germinazione dei semi Molti semi ed in particolare quelli di piante spontanee, non germinano subito dopo che sono dispersi dalla pianta madre (dormienza). Spesso tali semi contengono l acido abscissico (ABA), un inibitore della germinazione antagonista di GA. La germinazione richiede l eliminazione di ABA e la sintesi di GA. La luce o il trattamento a freddo (stratificazione) dei semi dormienti porta a ridurre l ABA e ad aumentare il GA. Trattando i semi con GA spesso si possono omettere I trattamenti con luce o freddo. germinazione Mobilizzazione delle riserve Crescita per distensione ABA GA

44 GAs sono indispensabili per lo sviluppo del seme Aborto di semi in un mutante di pisello GA-deficente. Lh = wild type; lhi = mutante.

45 Le gibberelline stimolano la crescita del fusto Mentre la somministrazione di GA non produce effetti vistosi in piante già alte, promuove un enorme accrescimento in piante nane (geneticamente mutate) e in piante a rosetta come lo spinacio (Spinacia oleracea; Chenopodiaceae in figura) ed il cavolo (Brassicaceae) (vedi dopo). SD = short days; LD = long days wild type wild type +GA mutante nano mutante nano + GA

46 -GA +GA GAs e allungamento del fusto nelle Brassicaceae Effetto di ripetuti trattamenti con gibberellina di piante di cavolo con fusto a rosetta. Tali piante sono biennali e fioriscono naturalmente dopo esposizione ad un periodo di giorno lungo-notte breve (LDP).

47 Le GAs stimolano la divisione in gemme apicali di piante a rosetta Sezioni longitudinali di apice caulinare di una pianta a rosetta al tempo 0 (controllo) e dopo applicazione di GA1. Ogni punto indica un evento mitotico

48 Nelle Graminacee le GAs agiscono sui meristemi intercalari del fusto Le GA stimolano sia la divisione cellulare che la distensione dei meristemi intercalari, determinando l allungamento del fusto.

49 Meccanismi fisiologici della crescita indotta da GAs GA promuove la crescita attraverso divisione cellulare e distensione Nel riso è stato dimostrato che la divisione mitotica dei meristemi intercalari è concomitante con l induzione dell espressione di geni codificanti per proteina chinasi (A, B e D) dipendenti da ciclina (proteina che si associa alla chinasi ed è fosforilata). Le cicline D regolano il passaggio da G1 a S, le A regolano S e le B regolano il passaggio da G2 a M. Le GA regolerebbe la trascrizione dei geni delle cicline che soprattutto controllano il passaggio da G1 a S e da G2 a M. GA induce l espressione delle cicline, proteine che regolano il ciclo cellulare. distensione cellulare divisione cellulare distensione cellulare GA promuove la distensione indebolendo la parete cellulare e stabilizzando l orientamento dei microtubuli corticali, che aiutano la crescita diretta.

50 Meccanismi fisiologici della crescita indotta da GAs GA promuove la distensione regolando l orientamento dei microtubuli corticali Mentre IAA promuove la distensione per acidificazione della parete cellulare, un simile meccanismo non è mai stato dimostrato per le GAs. Tuttavia GAs è sempre presente nei tessuti insieme ad IAA per cui l effetto di GAs sulla crescita potrebbe dipendere da acidificazione della parete IAA indotta. Tuttavia il tempo di stimolazione della distensione da parte di GAs è più lungo di quello di IAA: 40 minuti nel riso di acqua profonda e 2-3 ore nei piselli. Ciò porta ad ipotizzare che GAs agisca con un meccanismo distinto da IAA. Una possibile ipotesi di azione di GAs è riportata sotto. Un altra ipotesi implica il coinvolgimento di un enzima di parete lo xiloglucano endotransglucosilasi/idrolasi, che taglia delle piccole porzioni dello xiloglucano (emicellulosa) e le riattacca su di un altra catena facilitando in questo modo la penetrazione delle espansine e l allentamento della parete. Controllo Uniconazolo Uniconazolo + GA I microtubuli corticali disposti a cerchio contribuiscono a promuovere la crescita per distensione. L inibizione della biosintesi di GA distrugge i microtubuli corticali, mentre l aggiunta di GA riforma tali microtubuli. Uniconazolo = inibitore della sintesi di GA

51 GA promuove l allungamento ed evita la sommersione delle piante Control Submerged Come il livello dell acqua aumenta durante gli allagamenti stagionali, il GA promuove il rapido allungamento del fusto per mantenere la porzione superiore del fusto sopra la linea d acqua. Due giorni di sommersione inducono un tremendo allungamento degli internodi.

52 Quando l acqua sale rapidamente, il riso può crescere altrettanto rapidamente Questa risposta alla sommersione è considerata controproducente nel riso da raccolto poiché causa il rapido consumo di nutrienti che sarebbero stati indirizzati al seme. Talvolta questa veloce crescita comporta anche la morte della pianta.

53 Talvolta è meglio limitare la crescita in condizioni di stress da sommersione Pertanto sono state selezionate cultivar di riso più tolleranti la sommersione. Il gene responsabile di questa risposta attenuata è Sub1A, la cui espressione porta all accumulo della proteina DELLA e della proteina correlata GRAS. Lento aumento dell acqua è evitata la sommersione con la crescita GA indotta. Veloce aumento dell acqua la pianta mantiene i nutrienti a causa dell inibizione della crescita mediata da DELLA.

54 Il riso transgenico che porta il gene Sub1A può sopravvivere alla sommersione senza crescere L introduzione del riso OGM, esprimente il gene Sub1A, potrebbe ridurre le perdite dei raccolti di riso a seguito di alluvioni nelle coltivazioni asiatiche. Come per le cultivar di grano a taglia seminana che furono selezionate per ridurre l allettamento, questo riso OGM potrebbe portare ad una analoga Green Revolution. Controllo Sub1A Controllo Sub1A Sommersione

55 Le GAs regolano il passaggio dalla fase giovanile a quella adulta Di norma molte piante legnose perenni non fanno fiori e frutti fino al raggiungimento della maturità sessuale. La fase che precede la maturità sessuale è detta giovanile, mentre dal momento dell acquisizione della maturità sessuale si parla di fase adulta. È stato dimostrato che alcune conifere, le quali hanno una fase giovanile di circa 20 anni, possono ridurla se trattate con GA. Se si innestano rametti di abete bianco (Picea glauca) di piante trattate con GA nella stagione precedente (Figg. A e B) si sviluppano coni femminili. In C è mostrata una piantina di sequoia (Sequoiadendron giganteum) spruzzata con GA: dopo 8 settimane sviluppa un cono femminile. A B C

56 Le GAs influiscono sull inizio della fioritura Si è visto prima che la somministrazione di GA a piante a rosetta può sostituire l esposizione a LD. Qui vediamo altri esempi. Lolium temulentum zizzania, pianta spontanea annuale di zone temperate SI Beta vulgaris barbabietola, biennial SI Malus domestica melo, perenne No Arabidopsis thaliana annuale SI

57 In alcune piante GA permette di superare la richiesta di LD per fiorire Controllo Gibberellina In alcune piante che richiedono long days per fiorire, GA può promuovere la fioritura anche in short days. Samolus parviflorus cresciuto in short-days trattato e non con GA

58 GA è essenziale per il normale sviluppo e fertilità dei fiori Mutanti nani di Arabidopsis e riso hanno bloccato lo sviluppo delle antere e la formazione del polline e quindi sono maschio sterili. Tale situazione è superata dalla somministrazione di GA. Nei mutanti GAinsensitive, invece, il trattamento con GA non ha alcun effetto e restano maschi sterili. Nei mutanti di riso gamyb la mutazione ha causato la perdita di funzione del gene GAMYB producendo anomalie nello sviluppo delle antere, più o meno pronunciate a seconda del mutante considerato.

59 Lo sviluppo e la maturazione dei frutti sono sotto il controllo ormonale A seguito dell impollinazione inizia la senescenza dei petali, seguita dalla crescita del frutto per divisione cellulare e distensione. A questo punto il frutto inizia a maturare.

60 L Auxina e le GA promuovono la divisione cellulare e la crescita dei frutti La somministrazione di GA permette di stimolare l iniziazione della crescita del frutto a seguito dell impollinazione (fruit set) e la crescita di alcuni frutti come la pera e l uva. GA può indurre il fruit set in assenza di impollinazione (partenocarpia) permettendo di ottenere frutti privi di semi. Questa azione di GA può essere usata commercialmente. Auxina + GA pomodoro GA uva Auxina fragola

61 Alcuni usi commerciali delle GAs e degli inibitori della loro biosintesi

62 L Auxina e le GAs promuovono la divisione cellulare e la crescita dei frutti In alcune varietà di uva, naturalmente prive di semi che abortiscono durante la maturazione, il trattamento con GA permette di ottenere acini più grandi e distanziati. Un altro beneficio è la riduzione delle infezioni fungine. + GA

63 GA è usato industrialmente per promuovere la germinazione dell orzo La degradazione dell amido nell endosperma di orzo è iniziata dal GA prodotto naturalmente dall endosperma oppure aggiunto dall esterno durante il processo di maltificazione. La maltificazione consiste in: 1) lavaggio ed imbibizione dell orzo in acqua per 40 ore; 2) germinazione per 5 giorni. In questo modo l amido è degradato a zuccheri solubili e fermentabili dal lievito.

64 I ritardanti la crescita o antigibberelline Ancemidolo Fosfon D AMO-1618 CCC Alar Paclobutrazolo I ritardanti sono usati in agricoltura e floricoltura per inibire la biosintesi delle GA e quindi ridurre la crescita.

65 Il paclobutrazolo inibisce la sintesi di GAs 0 M PAC 1 M PAC 5 M PAC 25 M PAC Piante di Arabidopsis trattate con crescenti concentrazioni di paclobutrazolo (PAC). I ritardanti sono spruzzati in campo o in serra sulle piante per ottenere i seguenti effetti: 1. Prevenire la crescita dei rami in alberi da frutto; 2. Ridurre la crescita degli internodi in fiori (gigli e crisantemi); 3. Ridurre la crescita degli internodi in cereali per prevenire l allettamento.