Key words: Dorsal root ganglia; Sensory neurons; Ageing; Oryctolagus cuniculus.

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1 Rend. Fis. Acc. Lincei s. 9, v. 12:83-89 (2001) Istologia e citologia. Modificazioni quantitative del condrioma nei neuroni dei gangli spinali di coniglio nel corso dell invecchiamento. Nota di Carla Martinelli, Patrizia Sartori e Maria Ledda, presentata (*) dal Socio E. Pannese. Abstract. Mitochondria of rabbit spinal ganglion neurons. Quantitative changes during ageing. We studied the mitochondria of the neuronal perikaryon in the spinal ganglia of 12, 42 and 79 month-old rabbits. Both the volume of the perikaryon and the total mitochondrial mass within the perikaryon increased significantly passing from young adult to old animals. Hence, there is no net loss of mitochondria in these neurons with age. Since, however, the volume of the perikaryon increased by more than 63% while the total mitochondrial mass within the perikaryon increased by only 18%, the mean percentage of perikaryal volume occupied by mitochondria decreased with age. This decrease is only in very minor part a consequence of lipofuscin accumulation, so that the ratio between the total mitochondrial mass and the functionally active volume of cytoplasm decreased with age. Moreover, while the mitochondrial structure did not change, mitochondrial size increased with age. Finally, in each of the three age groups both the mean percentage volume of mitochondria and the mean mitochondrial size were very similar in large light and in small dark neurons. Key words: Dorsal root ganglia; Sensory neurons; Ageing; Oryctolagus cuniculus. Riassunto. Sono stati studiati i mitocondri nel pericarion dei neuroni dei gangli spinali di conigli di 12, 42 e 79 mesi. Sia il volume del pericarion, sia il volume totale dei mitocondri situati nel pericarion aumentavano significativamente passando dagli animali giovani adulti a quelli vecchi. Nei suddetti neuroni, quindi, non si verifica una perdita di mitocondri con l avanzare dell età. Mentre, però, il volume del pericarion aumentava di oltre il 63%, il volume totale dei mitocondri aumentava del 18%, per cui la percentuale media del volume del pericarion occupato dai mitocondri risultava diminuita negli animali vecchi. Questa riduzione è dovuta solo in minima parte all accumulo di lipofuscina, per cui il rapporto fra il volume totale dei mitocondri e il volume del citoplasma attivo diminuiva con l avanzare dell età. Inoltre, nel corso dell invecchiamento la struttura dei mitocondri rimaneva invariata, mentre le dimensioni di questi organelli aumentavano. Infine, con l avanzare dell età lecaratteristiche dei mitocondri prese in esame andavano incontro alle stesse modificazioni nei neuroni grandi chiari e in quelli piccoli scuri. Introduzione Nell ambito delle ricerche in corso nel nostro laboratorio sulle modificazioni strutturali dei gangli spinali nel corso dell invecchiamento, abbiamo preso in esame i mitocondri dei neuroni di tali gangli anche in considerazione del ruolo che recenti ricerche hanno attribuito a questi organelli nel processo di invecchiamento (rassegne su questo argomento si possono trovare in Miquel et al., 1980; Wallace, 1992; Kadenbach et al., 1995; Ozawa, 1995; Cortopassi e Wong, 1999; Walter et al., 1999). Mentre la struttura dei mitocondri dei neuroni dei gangli spinali nel corso dell invecchiamento è stata oggetto di studi (Vanneste e van den Bosch de Aguilar, 1981; Vega et al., 1993), per quanto ci risulta, nessuno si è occupato delle modificazioni quantitative di tali organelli. Perciò nella presente ricerca abbiamo dedicato particolare attenzione a questo problema. (*) Nella seduta dell 11 maggio 2001.

2 84 c. martinelli et al. Materiale e metodi Furono utilizzati 2 conigli (Oryctolagus cuniculus )di 12 mesi (uno maschio e uno femmina, peso corporeo 3,4-3,5 kg), 2 conigli di 42 mesi (uno maschio e uno femmina, peso corporeo 3,6-3,8 kg) e 2 conigli di 79 mesi (uno maschio e uno femmina, peso corporeo 4,0-4,2 kg). Poiché la durata della vita di un coniglio sano è di mesi (Harkness e Wagner, 1983) o di mesi (Weisbroth et al., 1974), i conigli di 12 mesi sono da considerare giovani adulti, quelli di 79 mesi sono da considerare vecchi e conseguentemente quelli di 42 mesi sono da considerare di età intermedia. Inoltre, si ritiene generalmente che l inizio della senescenza corrisponda al termine del periodo fertile. Poiché normalmente i conigli femmina non sono più fecondi dopo il 60 mese di vita, anche da questo punto di vista i conigli di 79 mesi utilizzati per la presente ricerca sono da considerare vecchi. Dopo essere stati anestetizzati con Nembutal (80 mg/kg), gli animali furono perfusi con una soluzione di formaldeide (2%) e glutaraldeide (2%) in tampone sodio cacodilato (0,1 M, ph 7,3). Dopo 3 h di fissazione, i gangli spinali toracici furono prelevati, postfissati in OsO 4 (2%), disidratati e quindi inclusi in una miscela di Epon-Araldite. La qualità della fissazione di ciascun ganglio fu controllata sia al microscopio ottico, sia al microscopio elettronico. Per la presente ricerca furono utilizzati solamente i gangli la cui struttura risultava preservata in modo ottimale e i cui neuroni non mostravano segni di rigonfiamento o di coartazione. In totale furono utilizzati 60 gangli (10 per ciascun animale). Nonostante i neuroni dei gangli spinali non presentino un orientamento preferenziale, la ricerca fu eseguita su sezioni ad orientamento casuale (isotropic uniform random, IUR), ottenute con il procedimento denominato orientator (Mattfeldt et al., 1990). Per ciascun ganglio, una sola sezione sottile IUR (di circa 0;25 0;20 mm) fu fotografata in tutta la sua estensione al microscopio elettronico; i negativi (2500 ) furono stampati ad un ingrandimento finale di Per ciascuna sezione furono utilizzate stampe, che furono giustapposte in modo da riprodurre interamente la sezione; alle stampe così allestite fu sovrapposto un foglio trasparente contenente una serie di punti distanti 1 mm l uno dall altro; alla stampa e al foglio trasparente fu poi sovrapposto un cartoncino provvisto di finestre di dimensioni uniformi (10 5 cm), distribuite in maniera sistematica. In ciascuna sezione, all interno di ogni finestra furono contati tutti i punti che cadevano nel pericarion del neurone (P n )eipunti che cadevano sui mitocondri (P nm ). La percentuale del volume del pericarion occupato dai mitocondri (V vnm )fucalcolata con la seguente formula: V vnm = P nm 100=P n. Per ciascun coniglio fu calcolato il valore medio di V vnm. Per ottenere informazioni sulle dimensioni dei mitocondri, furono contati i punti che cadevano su ciascun mitocondrio situato all interno di ogni finestra. Per ogni animale fu quindi calcolato il numero medio dei punti che cadevano su un mitocondrio, valore che fornisce un indicazione delle dimensioni dei mitocondri. La porzione di ciascun ganglio rimasta dopo l allestimento della sezione sottile IUR fu utilizzata per determinare il volume medio del pericarion dei neuroni. Per ogni ganglio

3 modificazioni quantitative del condrioma ::: 85 fu allestita una serie di sezioni semifini (spessore 1 mm) parallele alla sezione sottile IUR. Ciascuna sezione fu colorata con blu di toluidina e fotografata interamente a 350 ; le stampe (ingrandimento finale 1000 ), montate in modo da ricostruire la sezione in tutta la sua estensione, furono disposte ordinatamente in serie come le corrispondenti sezioni. Queste valutazioni quantitative furono eseguite su 242 neuroni di conigli giovani adulti, 231 neuroni di animali di età intermedia e 235 neuroni di conigli vecchi. Il volume del corpo di ciascun neurone fu determinato misurando, per mezzo di una tavoletta grafica collegata con un calcolatore, l area di ognuno dei suoi profili contenuti nella serie di sezioni, moltiplicando questo valore per lo spessore della sezione e sommando tutti i risultati così ottenuti. Lo stesso procedimento fu usato per determinare il volume del nucleo. Il volume del pericarion fu ottenuto sottraendo il volume del nucleo da quello del corrispondente corpo neuronale. Per ciascun animale fu quindi calcolato il volume medio del pericarion. In base al volume medio del pericarion e alla percentuale di tale volume occupato dai mitocondri fu infine calcolato, per ogni coniglio, il volume totale medio dei mitocondri situati nel pericarion. I valori ottenuti per i conigli appartenenti a ciascuna classe di età furono confrontati per stabilire se fra loro esistessero o non differenze significative. Furono infine confrontati i valori medi delle tre classi di età. I confronti furono effettuati con il test t di Student (limiti di confidenza al 95%), utilizzando un programma di statistica (Statgraphics software STSC) inserito in un calcolatore. Risultati e discussione Struttura dei mitocondri. La struttura dei mitocondri dei neuroni da noi studiati corrispondeva a quella descritta in letteratura (per es., si veda Pannese, 1994) e non risultava diversa nelle tre classi di età. In particolare, i mitocondri non presentavano segni di rigonfiamento o di degenerazione. Percentuale del volume del pericarion occupato dai mitocondri nei conigli giovani adulti. Nei neuroni dei gangli spinali dei soggetti giovani adulti i mitocondri occupavano il 10,6% del volume del pericarion (tab. I). Questa percentuale è simile a quelle riportate per altre regioni del sistema nervoso: nucleo del nervo ipoglosso di coniglio (Hudson et al., 1961), nucleo sopraottico di ratto (Eneström e Hamberger, 1968), bulbo olfattivo di ratto (Hinds e McNelly, 1979) e ganglio cervicale superiore di pecora (Gabella et al., 1988). Valori nettamente maggiori sono stati trovati invece nelle cellule piramidali della corteccia uditiva di ratto (Peters e Vaughan, 1981) e nei neuroni delle corna ventrali del midollo spinale di ratto (Ishihara et al., 1997). Non si conoscono le ragioni di queste differenze. Percentuale del volume del pericarion occupato dai mitocondri : modificazioni con l età. Nei neuroni da noi studiati, la percentuale del volume del pericarion occupato dai mitocondri diminuiva in misura significativa con l avanzare dell età (tab. I). Un risultato simile è stato ottenuto nei neuroni del ganglio vestibolare di ratto (Lyon e King, 1997) e in tessuti non nervosi (Tauchi e Sato, 1968; Herbener, 1976). Risultati diversi da quelli

4 86 c. martinelli et al. Tabella I. Percentuale media del volume del pericarion occupato dai mitocondri e dimensioni medie dei mitocondri. Coniglio Età Numero Numero Numero Percentuale Numero (mesi) di gangli totale di di punti che media (±DS) medio (±DS) esaminati punti che cadono sui del volume del di punti cadono sul mitocondri pericarion che cadono pericarion occupato dai su un mitocondri mitocondrio P n P nm V vnm Valori per ciascun coniglio ;35 ± 1;34 2;98 ± 0; ;83 ± 1;92 2;99 ± 0; ;72 ± 2;14 3;28 ± 0; ;71 ± 0;69 3;26 ± 0; ;80 ± 1;46 3;59 ± 0; ;48 ± 1;39 3;60 ± 0;73 Valori per ciascuna classe di età Giovani adulti ;61 ± 1;67 a 2;99 ± 0;47 a Intermedi ;71 ± 1;59 b 3;27 ± 0;45 b Vecchi ;65 ± 1;43 c 3;60 ± 0;77 c Le differenze fra a e b, fra b e c e fra a e c sono significative (p <0;05). suddetti sono stati ottenuti in altre regioni del sistema nervoso; per esempio, nelle cellule piramidali della corteccia uditiva di ratto (Peters e Vaughan, 1981) e nel nervo laringeo superiore di ratto (Rosenberg et al., 1989) la percentuale del volume del citoplasma occupato dai mitocondri rimaneva costante con l età enelle cellule mitrali del bulbo olfattivo di ratto (Hinds e McNelly, 1979) tale percentuale aumentava passando da 27 a30mesi. Volume totale dei mitocondri : modificazioni con l età. Noi abbiamo osservato che, passando dai conigli giovani adulti a quelli vecchi, il volume del pericarion e il volume totale dei mitocondri situati nel pericarion aumentavano in misura significativa (tab. II). Mentre, però, il volume del pericarion del neurone aumentava di oltre il 63%, il volume totale dei mitocondri aumentava del 18%, per cui la percentuale del volume del pericarion occupato dai mitocondri risultava diminuita negli animali vecchi. Nei neuroni dei gangli spinali di coniglio, la percentuale del volume del pericarion occupato dalla lipofuscina, pur aumentando con l età (0,36% a 12 mesi e 2,55% a 79 mesi), è sempre molto bassa (Ledda et al., 1999). Quindi, la diminuzione della percentuale del volume del pericarion occupato dai mitocondri, che noi abbiamo osservato negli animali vecchi, dipende solo in minima parte dall accumulo di lipofuscina. Si può pertanto concludere che nei neuroni da noi studiati il rapporto fra il volume totale dei mitocondri e il volume del citoplasma attivo diminuisce nell età avanzata. Tale riduzione potrebbe essere una conseguenza della diminuita richiesta di energia da parte del neurone, oppure potrebbe dipendere dall incapacità dei mitocondri di adeguare il loro volume totale al volume del citoplasma attivo. Poiché lacapacità dirispondere a richieste energetiche elevate si riduce nei neuroni degli animali vecchi (si vedano Sylvia

5 modificazioni quantitative del condrioma ::: 87 Tabella II. Volume totale dei mitocondri situati nel pericarion. Coniglio Età Numero di Volume medio Volume totale medio (mesi) gangli del pericarion dei mitocondri situati esaminati nel pericarion (mm 3 ) (mm 3 ) Valori per ciascun coniglio ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;89 Valori per ciascuna classe di età Giovani adulti ;12 a 1496;87 d Intermedi ;63 b 1667;06 e Vecchi ;01 c 1767;84 f Le differenze fra a e b, fra b e c e fra a e c sono significative (p <0;05). Le differenze fra d e e e fra e e f non sono significative, mentre è significativa (p <0;05) la differenza fra d e f. e Rosenthal, 1979), la seconda ipotesi sembra più verosimile. Se prendessimo in considerazione solamente il fatto che la percentuale del volume del pericarion occupato dai mitocondri diminuisce con l età, saremmo indotti a ritenere che, con l avanzare dell età, in questi neuroni la degradazione dei mitocondri prevalga sulla produzione di nuovi mitocondri. Poiché, però, passando dai conigli giovani adulti a quelli vecchi, il volume totale dei mitocondri situati nel pericarion aumenta, sia pure in misura modesta (18%), possiamo concludere che anche in età avanzata la produzione di questi organelli riesce a prevalere sulla loro degradazione. Dimensioni dei mitocondri. Noi abbiamo osservato che il numero medio di punti che cadono su un mitocondrio aumentava significativamente con l età. Dal momento che i mitocondri non apparivano rigonfiati in nessuna classe di età, noi possiamo concludere che le dimensioni dei mitocondri aumentano con l età. Risultati simili sono stati ottenuti nei glomeruli sinaptici del cervelletto (Bertoni-Freddari et al., 1993) e nelle cellule epatiche (Tauchi e Sato, 1968; Wilson e Franks, 1975). Secondo Tauchi e Sato (1968), l aumento di volume dei mitocondri potrebbe dipendere dalla riduzione della capacità di duplicarsi di questi organelli. Tuttavia, l aumento di volume dei mitocondri con l età non sembra essere un fenomeno generale, dal momento che Herbener (1976) ha osservato che nel miocardio e nell epitelio ghiandolare epatico di topo le dimensioni dei mitocondri si mantengono costanti per tutta la durata della vita. Confronto fra neuroni grandi chiari e piccoli scuri. Noi abbiamo osservato che in ciascuna delle tre classi di età: (1) la percentuale media del volume del pericarion occupato dai mitocondri era molto simile nei neuroni grandi chiari e in quelli piccoli scuri; (2) il volume medio dei mitocondri era molto simile nelle due classi di neuroni. Quindi, con l avanzare dell età, le suddette caratteristiche dei mitocondri vanno incontro alle stesse modificazioni nelle due classi di neuroni dei gangli spinali.

6 88 c. martinelli et al. Ringraziamenti Gli autori ringraziano il Sig. F. Redaelli per l eccellente collaborazione tecnica. Bibliografia Bertoni-Freddari C., Fattoretti P., Casoli T., Spagna C., Meier-Ruge W., Ulrich J., Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Res., 628: Cortopassi G.A., Wong A., Mitochondria in cellular aging and degeneration. In: E. Cadenas, L. Packer (eds.), Understanding the Process of Aging. The Roles of Mitochondria, Free Radicals, and Antioxidants. Marcel Dekker, New York - Basel: Eneström S., Hamberger A., Respiration and mitochondrial content in single neurons of the supraoptic nucleus. A correlative study in osmotic stress. J.Cell Biol., 38: Gabella G., Trigg P., McPhail H., Quantitative cytology of ganglion neurons and satellite glial cells in the superior cervical ganglion of the sheep. Relationship with ganglion neuron size. J. Neurocytol., 17: Harkness J.E., Wagner J.E., The Biology and Medicine of Rabbits and Rodents. 2nd ed. Lea and Febiger, Philadelphia. Herbener G.H., A morphometric study of age-dependent changes in mitochondrial populations of mouse liver and heart.j.gerontol., 31: Hinds J.W., McNelly N.A., Aging in the rat olfactory bulb: quantitative changes in mitral cell organelles and somato-dendritic synapses. J.Comp. Neurol., 184: Hudson G., Lazarow A., Hartmann J.F., A quantitative electron microscopic study of mitochondria in motor neurones following axonal section. Exp. Cell Res., 24: Ishihara A., Hayashi S., Roy R.R., Tamada Y., Yokoyama C., Ohira Y., Edgerton V.R., Ibata Y., Mitochondrial density of ventral horn neurons in the rat spinal cord. Acta Anat., 160: Kadenbach B., Münscher C., Frank V., Müller-Höcker J., Napiwotzki J., Human aging is associated with stochastic somatic mutations of mitochondrial DNA. Mutation Res., 338: Ledda M., Barni L., Altieri L., Pannese E., Amount and distribution of lipofuscin in nerve and satellite cells from spinal ganglia of young adult and aged rabbits. J.Submicrosc. Cytol. Pathol., 31: Lyon M.J., King J.M., Aging rat vestibular ganglion: II. Quantitative electron microscopic evaluation. Ann. Otol., Rhinol., Laryngol., 106: Mattfeldt T., Mall G., Gharehbaghi H., Möller P., Estimation of surface area and length with the orientator.j.microsc., 159: Miquel J., Economos A.C., Fleming J., Johnson J.E. Jr., Mitochondrial role in cell aging. Exp. Gerontol., 15: Ozawa T., Mitochondrial DNA mutations associated with aging and degenerative diseases. Exp. Gerontol., 30: Pannese E., Neurocytology. Fine Structure of Neurons, Nerve Processes, and Neuroglial Cells. Georg Thieme Verlag, Stuttgart - New York. Peters A., Vaughan D.W., Central nervous system. In: J.E. Jr. Johnson (ed.), Aging and cell structure. Vol. 1. Plenum Press, New York - London: Rosenberg S.I., Malmgren L.T., Woo P., Age-related changes in the internal branch of the rat superior laryngeal nerve. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 115: Sylvia A.L., Rosenthal M., Effects of age on brain oxidative metabolism in vivo. Brain Res., 165: Tauchi H., Sato T., Age changes in size and number of mitochondria of human hepatic cells. J. Gerontol., 23: Vanneste J., van den Bosch de Aguilar Ph., Mitochondrial alterations in the spinal ganglion neurons in ageing rats. Acta Neuropathol., 54: Vega J.A., Calzada B., Del Valle M.E., Age-induced changes in the mammalian autonomic and sensory ganglia. In: F. Amenta (ed.), Aging of the Autonomic Nervous System. CRC Press, Boca Raton: Wallace D.C., Diseases of the mitochondrial DNA. Annu. Rev. Biochem., 61:

7 modificazioni quantitative del condrioma ::: 89 Walter P.B., Beckman K.B., Ames B.N., The role of iron and mitochondria in aging. In: E. Cadenas, L. Packer (eds.), Understanding the Process of Aging. The Roles of Mitochondria, Free Radicals, and Antioxidants. Marcel Dekker, New York - Basel: Weisbroth S.H., Flatt R.E., Kraus A.L., The Biology of the Laboratory Rabbit. Academic Press, New York - San Francisco - London. Wilson P., Franks L.M., The effect of age on mitochondrial ultrastructure. Gerontologia, 21: Pervenuta il 9 febbraio 2001, in forma definitiva il 10 aprile Istituto di Istologia, Embriologia e Neurocitologia Università degli Studi di Milano Via L. Mangiagalli, Milano carla.martinelli@unimi.it