Agricoltura. Animali, Malattie di alberi, raccolto, piante, etc

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1 Controllo biologico dei microrganismi Sterilizzazione e disinfezione Giovanni DI BONAVENTURA, PhD Università G. D Annunzio, Chieti-Pescara Controllo biologico dei microrganismi Sanitizzazione delle aree Ambiente Industria Prevenzione di infezioni iatrogene, infezioni chirurgiche, infezioni crociate, diffusione di microrganismi e geni associati MICROBIOTA ad antibiotico-r, etc NORMAL HUMAN MICROBIOTA Agricoltura Malattie di alberi, raccolto, piante, etc Animali Microbiota Animali, capace pollame, di causare (conservazione, malattie nell uomo produzione), etc 1

2 Cosa abbiamo necessità di capire ( e di sapere!) Termini e definizioni Princìpi di base dei processi trattati Sensibilità relativa di differenti microrganismi ai diversi processi Limiti dei processi Quali sono i mezzi a nostra disposizione? Pulizia Disinfezione metodi chimici metodi fisici (talvolta) Sterilizzazione metodi fisici metodi chimici metodi chimico-fisici 2

3 Termini ( o definizioni!) Pulizia Rimozione di materiale organico dalla strumentazione e dalle attrezzature: sciacquare l oggetto con acqua fredda applicare il detergente e rimuovere meccanicamente il materiale organico risciacquare l oggetto con acqua tiepida asciugare l oggetto prima di eseguire la disinfezione/sterilizzazione Termini ( o definizioni!) Decontaminazione Trattamento che rende un oggetto (od una superficie) tale da poter essere maneggiata o toccata senza rischio di contaminazioni Il concetto è relativo, realizzandosi mediante: disinfezione sterilizzazione Scelta dipendente dalla pericolosità e della concentrazione del microrganismo 3

4 Termini ( o definizioni!) Disinfezione Processo che riduce o elimina completamente tutti i microrganismi patogeni allo stato vegetativo (non attiva sulle spore) presenti nell ambiente: Disinfezione: trattamento di superfici o sostanze inanimate (abiotiche) Disinfettante: : agente chimico in grado di uccidere microrganismi; dotato di diversi livelli di efficacia Antisepsi: applicazione topica su mucose, cute od altri tessuti Antisettico: : disinfettante usato su tessuti animati (viventi) Termini ( o definizioni!) Sterilizzazione: Impiego di procedure chimiche, fisiche e/o chimico-fisiche per la completa eliminazione o distruzione di qualsiasi forma di vita microbica, incluse le spore (forme di resistenza). Questo concetto, sebbene assoluto, è relativo alla capacità di rilevare la presenza di microrganismi (ad esempio, una soluzione filtrata non è tecnicamente sterile) 4

5 Termini ( e definizioni!) Are they dead or not? Biocida: composto che uccide tutti i microrganismi viventi (patogeni e non-) incluse le spore Battericida, fungicida, virucida Biostatico: composto che previene la crescita dei microrganismi, non necessariamente uccidendoli Batteriostatico, fungistatico Sepsi: contaminazione batterica Antisepsi: riduzione/inibizione di patogeni Asepsi: assenza di contaminazione batterica Sterilizzazione 5

6 Tecniche di sterilizzazione Murray P et al, Medical Microbiology 3 rd ed., Mosby, 1998 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Onde elettromagnetiche radiazioni UV radiazioni ionizzanti Ultrasuoni 6

7 Sterilizzazione Calore L effetto letale indotto dal calore consiste nella DENATURAZIONE (alterazione strutturale e, quindi, funzionale) di macromolecole (proteine enzimatiche): ossidazione (caldo secco) coagulazione (caldo umido) Esistenza di una temperatura massima di crescita specie/ceppo-specificaspecifica Morte Esponenziale C 60 C 80 C Tempo (min) Letalità = K x Temperatura 7

8 Sterilizzazione mediante calore Parametri caratterizzanti Punto di inattivazione termica (Thermal death point, TDP): la più bassa temperatura alla quale tutti i batteri in coltura liquida vengono uccisi entro 10 minuti Tempo di riduzione decimale (Decimal reduction time, DRT): tempo richiesto per l uccisione, ad una data temperatura, del 90% della popolazione batterica (utile soprattutto nell industria conserviera) Tempo di inattivazione termica (Thermal death time, TDT): tempo richiesto per l uccisione, ad una data temperatura, della totalità dei batteri in coltura liquida Punto di inattivazione termica C 9 60 C 8 80 C Tempo (min) Punto di inattivazione termica (TDP) = 80 C 8

9 Sterilizzazione mediante calore Parametri caratterizzanti Punto di inattivazione termica (Thermal death point, TDP): la più bassa temperatura alla quale tutti i batteri in coltura liquida vengono uccisi entro 10 minuti Tempo di riduzione decimale (Decimal reduction time, DRT): tempo richiesto per l uccisione, ad una data temperatura, del 90% della popolazione batterica (utile soprattutto nell industria conserviera) Tempo di inattivazione termica (Thermal death time, TDT): tempo richiesto per l uccisione, ad una data temperatura, della totalità dei batteri in coltura liquida Tempo di riduzione decimale C 50 C 60 C Tempo (min) DRT 9

10 Killing takes time Riduzione pari ad 1 log 10 Sterilizzazione mediante calore Parametri caratterizzanti Punto di inattivazione termica (Thermal death point, TDP): la più bassa temperatura alla quale tutti i batteri in coltura liquida vengono uccisi entro 10 minuti Tempo di riduzione decimale (Decimal reduction time, DRT): tempo richiesto per l uccisione, ad una data temperatura, del 90% della popolazione batterica (utile soprattutto nell industria conserviera) Tempo di inattivazione termica (Thermal death time, TDT): tempo richiesto per l uccisione, ad una data temperatura, della totalità dei batteri in coltura liquida 10

11 Tempo di inattivazione termica C 50 C 60 C Tempo (min) TDT Sterilizzazione parziale (disinfezione) mediante calore umido Ebollizione (100 C): inattivazione delle forme vegetative e virali entro 10 minuti Pastorizzazione: riduzione della popolazione microbica (Salmonella typhi, Escherichia coli O157:H7, Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp, Coxiella burnetii) nel latte (ed in altri alimenti deperibili) senza alterarne le caratteristiche organolettiche: Pastorizzazione di massa: C, 30 min; Pastorizzazione istantanea (HTST): 71 C, 15 sec; Pastorizzazione ultra-high-temperature (UHT): 140 C, 3 sec; 11

12 Sterilizzazione fisica Calore umido: Autoclave Tecnica di sterilizzazione più comune ed efficiente Adatta per: materiali termostabili, terreni di coltura, rifiuti infettivi Non adatta per: chimici tox e/o volatili, radioisotopi, agenti antineoplastici Camera a pressione che utilizza vapore saturo per ottenere elevate temperature. L aria viene rimossa dalla camera per gravità o tramite prevuoto. Denaturazione proteica per coagulazione Ciclo classico : 121 C, C, 15 min, 1 atm diversi cicli in base alla tipologia di materiale Calore umido - Autoclave 12

13 Autoclave: rimozione d aria per gravità da: : AD Russell et al. Principles & Practice of Disinfection, Preservation & Sterilization, Blackwell,

14 Autoclave Ciclo di sterilizzazione Holding time durata 2x tempo necessario per una riduzione sporale di 6 Log 14

15 Sterilizzazione fisica Calore secco Forno Pasteur, inceneritore, becco Bunsen Distruzione ossidativa delle proteine Meno efficace del calore umido e richiede tempi e temperature maggiori Cicli di sterilizzazione (forno Pasteur): 180 C, 30 min 171 o C, 60 min 121 o C, 12 h Forno Pasteur utilizzato per materiali termolabili, materiali danneggiati dal vapore o ad esso impermeabili Olii, polveri, oggetti taglienti, vetreria, Rifiuti infettivi (alternativa all autoclavaggio) Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Onde elettromagnetiche radiazioni UV radiazioni ionizzanti Ultrasuoni 15

16 Sterilizzazione fisica Filtrazione Rimozione meccanica (filtro dotato di pori) di particelle microscopiche da soluzioni e gas Tipologie di filtri: Filtri a spessore (carta, amianto, lana di vetro) particelle intrappolate nello spessore del filtro generalmente usati come prefiltri (Ø poro = 1.2 µm) per la chiarificazione di sospensioni o per la sterilizzazione dell aria in processi industriali Membrane filtranti (nitrato od acetato di cellulosa) azione simile ad un setaccio (Ø poro = µm) comunemente impiegati in microbiologia Filtro tipo Nucleopore (policarbonato) pori a Ø uniforme e disposti verticalmente nello strato sottile idoneo per studi in microscopia elettronica Filtro a spessore Filtro a membrana Filtro tipo Nucleopore (a traccia di nucleazione) 16

17 Sterilizzazione fisica Filtrazione Applicazioni: Sterilizzazione di terreni e supplementi (enzimi, siero, antibiotici) per colture cellulari Filtri HEPA (cabine biohazard, camere bianche o cleanroom) nel laboratorio biomedico, nell industria alimentare e farmaceutica (farmaci, vaccini) Sterilizzazione delle acque Dispositivi per la filtrazione di liquidi Filtrazione di piccoli volumi Filtrazione di grandi volumi Filtrazione per conta cellulare vitale 17

18 Filtrazione su membrana Nucleopore Enterococcus spp. Batteri acquatici ed alghe 18

19 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Onde elettromagnetiche Radiazioni UV Radiazioni ionizzanti Ultrasuoni Radiazioni elettromagnetiche 19

20 Sterilizzazione fisica Radiazione ultravioletta (U.V.) Onde elettromagnetiche (λ= nm) prodotte dal passaggio di corrente elettrica attraverso vapori a bassa pressione di Hg contenuti all interno di speciali tubi in vetro Assorbiti dagli acidi nucleici (assorbimento max=269 nm) e dalle proteine (ass. max=280 nm) Danno cellulare (letale) dovuto alla formazione di dimeri pirimidinici (T-T) T) che interferiscono con la replicazione del DNA (effetto mutageno) Max effetto letale a 260 nm Sterilizzazione fisica Radiazione ultravioletta (U.V.) Fattori critici: Scarsa penetrazione (non penetra carta, vetro, indumenti) Distanza sorgente UV - materiale trattato Intensità della luce (sostituzione ogni h) Umidità relativa Specie microbica Mutagena per l uomo (cute, occhi) Applicazioni: decontaminazione di superfici, aria, acqua limita la quantità di amplificati (PCR) sulle superfici disinfezione di ambienti confinati sterilizzazione a freddo di composti chimici, materiali plastici per uso farmaceutico, siero per colture cellulari 20

21 Radiazione U.V. Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Radiazioni UV Radiazioni ionizzanti Ultrasuoni 21

22 Sterilizzazione fisica Radiazioni ionizzanti Radiazioni elettromagnetiche a corta λ (alta energia): microonde, raggi γ,, raggi X, elettroni Effetto letale risultante da un azione ionizzante (dislocazione di elettroni dagli atomi) sulla molecola bersaglio: Diretta: trasferimento di energia a biopolimeri (DNA, ptoteine), causandone la rottura Indiretta: diffusione di radicali liberi (OH, e-, H ) Sensibilità alle radiazioni di alcuni microrganismi e funzioni biologiche Specie/funzioni Tipologia D10 (Gy) Clostridium botulinum Gram+, sporigeno Salmonella typhimurium Gram- 200 Aspergillus niger Muffa 500 Saccharomyces cerevisiae Lievito 500 Afta Virus Inattivazione enzimatica D10: quantità di radiazioni necessaria per ridurre di 10 volte la popolazione (o l attività) iniziale. Gray (Gy): dose di radiazione assorbita (1 Gy = 100 rad), dove: 1 rad = 100 erg/g. Dose letale = 12 x D10 22

23 Sterilizzazione fisica Radiazioni ionizzanti Applicazioni: Limitate, causa costi elevati, a processi industriali e Centri specializzati: Sterilizzazione/decontaminazione di strumenti e dispositivi (articoli monouso, siringhe, terreni di coltura, suture, strumentazione chirurgica) medicali: 40%, raggi γ (prodotti da Cobalto-60) 10%, fascio elettronico Industria alimentare: carne fresca (OMS), carne tritata (FDA) Industria farmaceutica: antibiotici, vaccini, pomate Trapianti di tessuto (valvola cardiaca, tendine, pelle) Sterilizzazione di rifiuti sanitari (fascio elettronico) Sterilizzazione fisica Radiazioni ionizzanti Svantaggi: Costi elevati Penetrano nei tessuti Mutagene per l uomo 23

24 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Onde elettromagnetiche radiazioni UV radiazioni ionizzanti Ultrasuoni Sterilizzazione fisica Ultrasuoni Energia ultrasonica a bassa frequenza ed energia in grado di inattivare per cavitazione i microrganismi in sospensioni acquose I sonicatori non vengono considerati alla stregua di sterilizzatori, tuttavia: Combinazione ultrasuoni + trattamento chimico può avere effetto letale 24

25 Sterilizzazione Tecniche CHIMICHE Acido peracetico Glutaraldeide Sterilizzazione chimica Acido peracetico, glutaraldeide Acido peracetico: agente ossidante immersione (0.2% per 20 - acqua sterile - aria sterile) micronizzato: industria alimentare, strumenti chirurgici efficace in presenza di materiale organico e produce prodotti finali non tox (acido acetico + O 2 ) Glutaraldeide: agente alchilante immersione (soluzione al 2%), tempi lunghi (ore) impiegata per materiale medico-chirurgico e preparazione di vaccini il suo impiego è associato a rischio occupazionale (irritazione mucose respiratorie, dermatite allergiche da contatto) 25

26 Sterilizzazione Tecniche CHIMICO-FISICHE Ossido di etilene (ETO) Formaldeide (vapori) Plasma-gas Sterilizzazione chimico-fisica Ossido di etlilene (ETO) Alchilazione di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, fenolici, idrossilici) Sterilizzazione di materiale di laboratorio termosensibile (plastica) 12% ETO + 88% Freon (oppure CO 2, N 2 ) L utilizzo deve essere regolamentato: ETO è carcinogeno e mutageno 26

27 Sterilizzazione Tecniche CHIMICO-FISICHE Ossido di etilene (ETO) Formaldeide (vapori) Plasma-gas Sterilizzazione chimico-fisica Formaldeide (vapori) Agente alchilante Vaporizzazione 2-5% formaldeide in presenza di vapor acqueo a C Impiegata per sterilizzare filtri HEPA Formaldeide è carcinogena Tracce residue in materiale polimerico (cellulosa, gomma) 27

28 Sterilizzazione Tecniche CHIMICO-FISICHE Ossido di etilene (ETO) Formaldeide (vapori) Plasma-gas Sterilizzazione chimico-fisica Plasma gas La produzione di radicali liberi causa inattivazione microbica Recentemente applicata ad apparecchiature mediche (quando calore o ETO non appropriati) Iniezione e vaporizzazione di H 2 O 2 nella camera di sterilizzazione. Applicazione di energia (radio- frequenza) alla camera per generare gas plasma. Necessita di un accurata pulizia del materiale da trattare La temperatura non eccede i 40 C, C, ma la la necessità di vuoto può deformare la superficie del materiale Effetto neutralizzato dai materiali in cellulosa Non efficace su metalli o plastiche 28

29 Scelta della tecnica di sterilizzazione Attività: battericida, tubercolicida, fungicida, sporicida, virucida Rapidità di azione: sterilizzazione raggiunta in breve tempo Penetrazione: capacità di penetrare nel materiale (o nella confezione in cui esso è contenuto) trattato Compatibilità: non causa rilevanti cambiamenti strutturali o funzionali del materiale in seguito a ripetuti trattamenti Atossicità: sicuro per l operatore e l ambiente Resistenza a materiale organico: efficacia invariata in presenza di materiale organico Costo-efficacia: costi ragionevoli per attrezzatura, installazione ed utilizzo in altre parole: non esiste una tecnica di sterilizzazione IDEALE! 29

30 Disinfezione Tecniche di disinfezione From: PR Murray et al Medical Microbiology 3rd edition, Mosby,

31 DISINFETTANTI Aldeidi Formaldeide e glutaraldeide sono dotate di rilevante attività disinfettante Alchilazione dei gruppi polari funzionali (amminici, idrossilici, fenolici) delle proteine Formaldeide: 37% (formalina), come sterilizzante: preserva campioni biologici e preparazione di vaccini 3-8%, come disinfettante Irrita le mucose, cancerogeno, forte odore DISINFETTANTI Aldeidi Glutaraldeide 2% (Cydex) battericida, tubercolicida, fungicida, virucida (10 minuti) sporicida (3-10 ore) Meno irritante e più efficace della formaldeide Disinfezione strumentazione ospedaliera 31

32 DISINFETTANTI Agenti ossidanti Perossido d idrogeno (H 2 O 2 ), acido peracetico Formazione di radicali ossidrilici (OH ) in grado di ossidare sistemi enzimatici critici per il microrganismo Battericidi, fungicidi, virucidi, sporicidi Acido peracetico (come sterilizzante di strumentazione e matrici alimentari): battericida e fungicida (5 min), virucida e sporicida (30 min) H 2 O 2 (come antisettico, non per ferite aperte) DISINFETTANTI Alcooli Etanolo, isopropanolo (60-85%) Danneggiano membrana citoplasmatica: denaturazione (coagulazione) delle proteine solubilizzazione dei lipidi Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi Attività influenzata dalla presenza di materiale organico Isopropanolo più efficace dell etanolo Antisettici (non per ferite aperte) Disinfettanti (sol. acquosa): superfici ben ventilate e lontane da fiamme 32

33 DISINFETTANTI Fenoli e derivati fenolici DISINFETTANTI Fenoli e derivati fenolici Fenolo (Lister): tossico, corrosivo, carcinogenico Derivati fenolici con gruppo funzionale (cloro, bromo, alchil, benzil, phenyl, amil) a sostituzione di un H dell anello aromatico Distruzione m. plasmatica, denaturazione proteica Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi 2-5% (0.5%, HIV; 2%, funghi) Attività persistente e non influenzata dalla presenza di materiale organico O-phenylphenol (Lysol), Irgasan Esaclorofene (Phisohex) Elevata efficacia vs cocchi Gram+ Strumenti chirurgici 33

34 DISINFETTANTI Alogeni loduri, Cloruri, Bromuri, Fluoruri Eliminazione di gruppi S-H per: Ossidazione: formazione di ponti di-sulfidrilici inattivi Combinazione: ione metallico sottrae SH liberi Battericidi, fungicidi, virucidi, sono combinati (Na, metalli) per ridurre tossicità, instabilità e corrosività Ioduri: Soluzione alcolica: Tintura di iodio Iodofori: PVP-J (Betadine) per uso cutaneo e chirurgico Cloruri: Disinfezione di acqua, piscine, acque di scarico Cl + p-toluene-sulfonamide (cloramina T) 1:10 sodio-ipoclorito (NaOCl) 5.25% per rischio ematogeni DISINFETTANTI Composti ammonio quaternario Detergenti cationici, derivati da modificazioni di NH 4 + Distruzione membrana cellulare, inattivazione enzimatica, denaturazione (coagulazione) proteica Batteriostatico (-cida ad elevate concentrazioni), sporostatico, fungistatico, virustatico Scarsamenta attivi vs Gram-: frequenti infezioni da Pseudomonas spp QUATs-resistenti Neutralizzati da materiale organico, saponi e detergenti anionici Non corrosivi, non tossici, stabili, inodori Zephiran (benzalconio cloruro), cetrimide, clorexidina 34

35 DISINFETTANTI Metalli pesanti Eliminazione di gruppi S-H (vedi alogeni) L impiego è fortemente limitato per tossicità ed inquinamento ambientale: 1% nitrato di Argento (preparati oftalmici) Composti organici del Mercurio: mercurocromo, mertiolato (disinfezione cutanea) Selenio: vs fungi e spore fungine Zinco: cloruro- (collutori per la disinfezione del cavo orale) e ossido- (antifungino) ANTISETTICI Alcooli (isopropanolo, etanolo): azione veloce ed efficace (spettro esteso) disidratano la pelle Clorexidina gluconata: solo attività battericida ridotta efficacia in presenza di acqua calcarea o di alcuni saponi Iodofori: esteso spettro di azione colorano ed irritano la cute Triclosan: attivo solo su Gram+ e Gram- (tranne Pseudomonas spp) 35

36 SURFATTANTI Saponi e detergenti Utilizzati in associazione con gli antisettici L azione dei surfattanti si espleta attraverso: degradazione della pellicola idrolipidica sopracutanea (emulsificazione) rimozione meccanica dei microrganismi (flora transitoria: Gram-, 80%) per sfregamento Disinfezione - Sensibilità relativa - Limitazioni 36

37 Efficacia di differenti disinfettanti Applicazione delle tecniche di disinfezione Un approccio conveniente è quello suggerito da Spaulding, applicato nelle linee-guida U.S. Gli oggetti sono classificati, sulla base del loro impiego, come: critici semi-critici non critici I relativi livelli di disinfezione sono: Alto livello (High Level of Disinfection, HLD) Livello Intermedio (Intermediate Level of Disinfection, ILD) Basso livello (Low Level of Disinfection, LLD) 37

38 Trattamento di oggetti critici Oggetti critici A contatto con tessuti viventi od inseriti nel sistema vascolare (strumentazione chirurgica, cateteri, artroscopi, etc) Obiettivo: Inattivazione forme vegetative e sporali (sterilità) Metodo: Vapore, gas plasma, sterilizzazione chimica (glutaraldeide, perossido di idrogeno, acido peracetico) Trattamento di oggetti semi-critici Oggetti semi-critici A contatto con mucose o con la cute non integra (endoscopi, termometri, attrezzatura per terapia inalatoria) Obiettivo: Inattivazione delle forme vegetative Metodo: High Level of Disinfection (HLD): glutaraldeide, perossido di idrogeno, perossido di idrogeno+acido peracetico 38

39 Trattamento di oggetti non critici Oggetti non critici Non vengono a contatto con mucose o con la cute non integra (superfici di strumentazioni mediche e superfici ambientali) Obiettivo: Basso grado di contaminazione Metodo: Intermediate and Low Level of Disinfection (ILD, LLD): Alcool etilico, ioduri, composti dell ammonio quaternario, fenoli Spaulding s scheme elevata S bassa S Alto livello di disinfezione Livello intermedio di disinfezione Basso livello di disinfezione 39

40 DISINFEZIONE Fattori critici (1 di 2) Ambiente: temperatura Optimum: C. Una diminuzione della temperatura riduce l efficacia. Un aumento pari a 10 C determina un au mento 2x della velocità di azione ph del mezzo in cui deve agire il disinfettante Materiale: natura del materiale (porosità) presenza di materiale organico (sangue, pus, vomito, feci) inattivazione principio attivo rivestimento della superficie batterica adsorbimento (eliminazione) del principio attivo Disinfettante: concentrazione del principio attivo tempo di applicazione (contatto con materiale) qualità acqua per diluizione disinfettante DISINFEZIONE Fattori critici (2 di 2) Microrganismo: tipologia I batteri Gram-negativi (presenza della membrana esterna) sono generalmente più resistenti dei Gram-positivi ai disinfettanti ed antisettici Micobatteri, endospore e cisti protozoarie sono molto resistenti ai disinfettanti ed antisettici I virus sprovvisti di envelope sono generalmente più resistenti a disinfettanti ed antisettici rispetto ai virus con envelope carica microbica organizzazione Presenza di biofilm: comunità cellulare multistratificata sessile in cui gli elementi cellulari sono immersi in una matrice polisaccaridica (slime) di derivazione batterica. La matrice potrebbe influenzare l attività del disinfettante o inattivandolo interagendo chimicamente con esso o rallentandone la diffusione attraverso gli strati cellulari più profondi 40

41 Caratteristiche ideali di un disinfettante Attività: esteso spettro di azione (battericida, fungicida, sporicida, tubercolicida, viricida) Rapidità di azione: breve tempo minimo di applicazione : minuti Atossicità: non irritante per occhi, mucose, cute Non deve possedere capacità tintoriali Non corrosivo Stabilità: per diluizioni e tempi consigliati (anche in presenza di materiale organico) Buona capacità di penetrazione e detersione Costi: ragionevoli (economicità) in altre parole: non esiste il disinfettante IDEALE! 41