IL CONTROLLO DELLA CRESCITA MICROBICA

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1 6 IL CTRLL DELLA CRESCITA MICRBICA Popolazione cellulare Tempo FIGURA 6.1 In idonee condizioni di crescita l incremento numerico della popolazione microbica è di tipo esponenziale ITRDUZIE Quando i microrganismi incontrano condizioni ambientali adeguate, possono riprodursi con una capacità proliferativa che, se fosse totalmente espressa, li porterebbe a divenire i dominatori incontrastati della biosfera in tempi brevissimi. In effetti un solo batterio di E. coli, riproducendosi ogni 30 minuti, può dar luogo a 48 generazioni nell arco di una sola giornata e ad un numero complessivo di individui equivalente a 2 48 ; dopo due giorni la popolazione di E. coli raggiungerebbe un numero talmente imponente (equivalente a 2 96 individui), da mettere in crisi qualsiasi sistema biologico (fig. 6.1). elle normali condizioni naturali, sono presenti fattori fisici, chimici e biologici che limitano l attività riproduttiva e determinano uno stato d equilibrio tra la flora microbica e l ambiente circostante. Tra i fattori in grado di controllare la proliferazione microbica, possono essere ricordati: la presenza di competitori, di predatori o di antagonisti, le limitazioni nutrizionali, il ph, la pressione osmotica, il potenziale redox, la temperatura e l accumulo di metaboliti acidi. I microrganismi producono benefici per tutta la biosfera; la grande potenzialità metabolica posseduta permette alle forme autotrofe di introdurre nella biosfera grandi quantità di carbonio organico e, alle forme eterotrofe, di degradare e riciclare immense quantità di sostanza organica; tuttavia in diverse situazioni, riproducendosi, determinano danni alle piante, agli animali, all uomo e ai suoi manufatti in quanto: contaminano e si riproducono sugli alimenti determinando la comparsa di alterazioni chimico-fisiche che li rendono non commestibili o, in alcuni casi, pericolosi per la salute; si introducono negli organismi ( animali e piante) ai quali causano patologie infettive trasmissibili da individuo ad individuo e, di conseguenza, in grado di diffondersi nella popolazione; producono sostanze dannose ( tossine) capaci di causare intossicazioni all uomo e agli animali; contaminano e si riproducono su materiali come opere d arte, libri, affreschi, dipinti. Su questi possono causare alterazioni che ne diminuiscono il valore o ne rendono problematica la conservazione (fig. 6.2). Per i motivi appena evidenziati spesso è necessario attuare misure capaci di limitare o di eliminare i microrganismi presenti in un determinato ambiente. L adozione di metodi antimicrobici richiede la conoscenza approfondita di tutti i fattori che favoriscono o ostacolano la crescita microbica. In questo modo, secondo le necessità che si presentano, è possibile ottenere l inibizione della crescita microbica (effetto microbiostatico) o la morte cellulare (effetto microbicida). La scelta dell agente antimicrobico dipende da una serie di elementi come: gli obiettivi che il trattamento si prefigge; le caratteristiche dei microrganismi; il mezzo in cui si trovano i microrganismi; il meccanismo d azione dell agente antimicrobico. L obiettivo dei trattamenti antimicrobici può essere quanto mai vario. In alcune situazioni può limitarsi a mantenere la popolazione presente bloccandone la crescita, mentre in altre può comportare la riduzione della popolazione presente o la sua eliminazione completa (sterilizzazione). Le caratteristiche dei microrganismi assumono un importanza fondamentale. Il grado di resistenza agli agenti antimicrobici varia notevolmente da specie a specie e dipende dallo stato fisiologico in cui ogni gruppo microbico si trova al momento del trattamento. 1

2 2 Le basi microbiologiche della Biochimica Parete Membrana Area citoplasmatica ucleoide FIGURA 6.2 Le opere d arte sono soggette ad una continua aggressione da parte della flora microbica ambientale. Questo rende necessario un continuo monitoraggio delle diverse componenti e un attento controllo del microclima. Il mezzo che ospita i microrganismi condiziona notevolmente la scelta del metodo impiegato; la presenza di materiale proteico, ad esempio, limita l azione degli acidi e delle basi e richiede un allungamento dei tempi necessari per ottenere un azione antimicrobica efficace. Il meccanismo d azione. Gli agenti antimicrobici sono attivi nei confronti di diverse componenti cellulari come la parete, la membrana cellulare, il citoplasma e il nucleo (fig. 6.3). I danni alla parete espongono i microrganismi alla lisi cellulare, mentre i danni alla membrana alterano la permeabilità cellulare e, nel caso dei procarioti, anche altri processi che si sviluppano in essa. Se i danni sono prodotti a livello degli acidi nucleici, gli effetti possono comportare alterazioni della replicazione del DA o del processo di biosintesi delle proteine, con conseguenze di notevole gravità o addirittura letali. Durante i trattamenti devono essere tenuti in considerazione anche gli effetti prodotti dalle sostanze antimicrobiche sui materiali e sugli organismi viventi sui quali pervengono. In rapporto alle caratteristiche possedute, gli agenti antimicrobici possono essere suddivisi in fisici e chimici AGETI ATIMICRBICI FISICI Com è stato approfondito in precedenza, ogni specie microbica è influenzata, oltre che dai principi nutrizionali presenti nell ambiente di crescita, da una serie di fattori chimico-fisici (temperatura, ph, pressione osmotica, potenziale redox) e biologici (antagonisti, competitori, simbionti, ecc). Se i parametri chimico-fisici sono prossimi ai valori ottimali, l accrescimento e la riproduzione si esprimono con la FIGURA 6.3 L azione antimicrobica è rivolta nei confronti delle varie strutture cellulari come la parete, la membrana, il citoplasma e l area nucleare. massima potenzialità; se al contrario, anche uno solo di tali parametri si allontana dai valori richiesti, la crescita tende a rallentare progressivamente, fino ad annullarsi quando sono raggiunti i valori limite. umerosi trattamenti antimicrobici si basano sull impiego di parametri chimico-fisici, posti al di fuori dell intervallo che consente la normale proliferazione cellulare. Ad esempio, dovendo utilizzare la temperatura come mezzo antimicrobico (fig. 6.4), è necessario conoscere i parametri di crescita del microrganismo oggetto del trattamento: se questo I principali fattori antimicrobici fisici Alte temperature: Essiccamento. pastorizzazione ebollizione Radiazioni ionizzanti: tyndalizzazione radiazione ultravioletta vapore fluente raggi x vapore sotto pressione raggi γ. calore secco incenerimento. Filtrazione. Basse temperature: refrigerazione congelamento surgelamento.

3 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica 3 Velocità di crescita espressa come numero di gen/ora 3,0 2,0 1,0 T. ott. T. disgenesiche T. disgenesiche T. min. T. max FIGURA 6.4 Temperatura in C Curva di crescita di un microrganismo mesofilo. presenta una T. ott. prossima ai C, una T. min. di 17 C e una T. max. di 48 C, dovranno essere forniti valori al di là dei 48 C o inferiori ai 17 C (temperature disgenesiche) Alte temperature I microrganismi presentano una sensibilità alle alte temperature, che dipende dalle caratteristiche possedute e da alcuni fattori ambientali. Tra i primi possono essere ricordati in particolare: l intervallo termico di crescita (rappresenta l intervallo delle temperature al cui interno una specie microbica è in grado di riprodursi; fig. 6.5) e la capacità di produrre spore (conferiscono alla specie una notevole termoresistenza). Valori termici che superano la massima temperatura di crescita (T. max.) comportano profonde alterazioni della conformazione proteica, con conseguente comparsa di fenomeni denaturativi o coagulativi delle proteine strutturali ed enzimatiche. Di conseguenza si modificano la permeabilità cellulare, i processi metabolici citoplasmatici, oltre che la struttura ed il metabolismo degli acidi nucleici. La sensibilità dei microrganismi alle alte temperature è influenzata da numerosi fattori come: la fase biologica in cui si trova la popolazione microbica, la composizione chimica e il ph dell ambiente di crescita, le componenti nutrizionali presenti, il mezzo di trasferimento del calore. Se il veicolo di trasferimento del calore è l acqua o il vapore d acqua, le temperature e i tempi richiesti sono nettamente inferiori rispetto ai trattamenti che prevedono l impiego dell aria. Questo è dovuto al fatto che a una determinata temperatura l acqua, indipendentemente che sia allo stato di vapore o allo stato liquido, è in grado di assorbire una quantità di calore molto più elevata rispetto all aria e di liberarla in modo più rapido e con una maggiore capacità di penetrazione nel materiale trattato. Gran parte della flora microbica si riproduce a una temperatura inferiore ai C; sopra tali valori muoiono i virus e gran parte delle forme vegetative dei batteri, dei lieviti e delle muffe. Più resistenti sono le forme sporali dei lieviti e delle muffe che, tuttavia, sono uccise a C in 5-10 minuti. Le forme sporali batteriche sono dotate di una termoresistenza molto più elevata rispetto a tutte le altre forme vegetative e sporali, in quanto per la loro distruzione sono richieste temperature superiori ai 100 C. Pertanto l eliminazione di tutte le forme viventi (sterilizzazione) richiede temperature sopra i 100 C e lunghi intervalli di tempo. Le metodologie maggiormente utilizzate nei trattamenti antimicrobici, sono quelle che impiegano il calore umido ed in particolare: la pastorizzazione, l ebollizione, la tyndalizzazione, il vapore fluente ed il vapore sotto pressione. TABELLA 6.1. Tempi e temperature impiegati nei più comuni trattamenti termici Trattamento Pastorizzazione bassa Temperatura 63 C per 5'-10' Pastorizzazione alta 72 C per 15" Pastorizzazione alta di laboratorio 80 C per 30' Bollitura 100 C per 30' Tyndalizzazione 100 C per 30' 3 volte Vapore fluente 100 C per 30' Vapore sotto pressione Calore secco Calore secco Incenerimento >500 C 121 C per 15'-20' 160 C per 2 ore 180 C per 1 ora

4 4 Le basi microbiologiche della Biochimica Velocità di crescita espressa come numero di gen/ora 3,0 2,0 1,0 Criofili Mesofili Termofili Trattamenti alle basse T. Trattamenti alle alte T Temperatura in C FIGURA 6.5 Curva di crescita dei microrganismi criofili, mesofili e termofili Pastorizzazione È una strategia operativa in cui i materiali destinati al trattamento termico sono portati a temperature inferiori ai 100 C. È stata messa a punto da Louis Pasteur sugli alimenti. Permette l eliminazione di gran parte delle forme vegetative comprese quelle patogene; a differenza degli altri trattamenti termici, evita un eccessiva alterazione dei caratteri nutrizionali degli alimenti. La pastorizzazione può essere ottenuta mediante un trattamento a una temperatura di 63 C per 5-10 minuti (pastorizzazione bassa) o alla temperatura di 72 C per 15 secondi (pastorizzazione alta). È frequentemente impiegata nel risanamento di diversi prodotti alimentari liquidi, come latte e succhi di frutta. Tra i trattamenti più efficaci può essere ricordato anche il metodo HTST (High Temperature Short Time); prevede il mantenimento di temperature superiori agli 80 C, per un tempo limitato a pochi secondi. L impiego negli alimenti di alte temperature per tempi brevi permette un rapido effetto microbicida ed evita, al contempo, una perdita eccessiva di alcuni principi nutrizionali, in particolare delle vitamine. ei laboratori microbiologici è frequentemente impiegata la cosiddetta pastorizzazione alta di laboratorio. Questo trattamento è adottato in particolare, qualora si vogliano eseguire ricerche sui batteri sporigeni da un campione polimicrobico, eliminando al contempo tutte le forme vegetative presenti; prevede un trattamento del campione a 80 C per 30 minuti in bagnomaria termostatico. all ebollizione, può essere impiegato il vapore fluente. In questo caso il materiale da sottoporre al trattamento termico è posizionato in un cestello metallico e posto in pentola di Koch o in autoclave; in quest ultimo caso senza chiusura del coperchio. Il vapore fluente, rispetto all ebollizione, consente una maggiore integrità del materiale trattato, dal punto di vista fisico e chimico Tyndalizzazione Se è necessario procedere a una sterilizzazione senza innalzare le temperature sopra i 100 C, si può procedere ad TABELLA 6.2. Tempo di morte termica di alcune specie microbiche on sporigeni Specie batterica Tempo di morte termica (minuti) Temperatura ( C) Salmonella typhi 4,3 60 Staphylococcus aureus 18,8 60 Escherichia coli Streptococcus thermophilus Ebollizione È basata sull impiego dell acqua alla temperatura d ebollizione (100 C) per un tempo di minuti; permette l eliminazione delle forme vegetative batteriche e delle spore dei funghi. L uccisione delle forme sporali batteriche richiede un trattamento molto lungo (6-7 ore), che è estremamente dannoso se impiegato sui prodotti alimentari. L ebollizione elimina le tossine termolabili (esotossina botulinica, tetanica e difterica), ma è inefficace sulle tossine termoresistenti (enterotossina stafilococcica). In alternativa Sporigeni Lactobacillus bulgaricus Bacillus anthracis 1,7 100 Bacillus subtilis Clostridium botulinum Clostridium calidotolerans

5 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica 5 ebollizioni prolungate per 30 minuti, ripetute per 3 volte successive ed intervallate da incubazioni a 37 C per 24 ore. In questo processo, dopo il primo trattamento termico, sono eliminate solo le forme vegetative; le spore che resistono alla prima ebollizione germinano durante la successiva incubazione a 37 C per 24 ore, ma sono eliminate da un secondo trattamento termico. Una seconda incubazione a 37 C per 24 ore, seguita da una terza ebollizione, permette di innalzare l efficacia del processo. La tyndalizzazione è impiegata nella sterilizzazione dei terreni di coltura, contenenti composti termolabili. È consigliata nei trattamenti domestici di conservazione degli alimenti Vapore sotto pressione La temperatura d ebollizione dell acqua a livello del mare è di 100 C; quando si raggiunge questo valore, la tensione di vapore dell acqua eguaglia la pressione atmosferica, corrispondente a 760 mm di Hg (101 kpa). e consegue che la temperatura d ebollizione può essere innalzata solo ponendo l acqua in un ambiente in cui è possibile ottenere livelli di pressione molto elevati. Tutto ciò è ottenuto all interno di recipienti metallici a chiusura ermetica (autoclavi, fig. 6.6). In esse il vapore prodotto dall acqua distillata, riscaldato da una resistenza elettrica, si concentra determinando un progressivo aumento della pressione (P). Aumentando la pressione, il livello della temperatura (T) cresce secondo la seguente relazion: risulta pertanto che: Pressione (atm.) P V = K T K T P =. V A volume (V) costante V/K = costante (K 1 ) e quindi P = K 1 T Ciò significa che, a volume costante, come all interno di un autoclave, l aumento della pressione comporta un proporzionale aumento della temperatura (tab. 6.3). In poco tempo possono essere raggiunti valori tali da comportare sicuri effetti microbicidi nei confronti di tutte le forme microbiche, comprese le spore batteriche. La sterilizzazione in autoclave (a condizione che i volumi impiegati siano inferiori al litro) di norma è ottenuta a 121 C in un tempo di TABELLA 6.3. Relazione tra temperatura e pressione all interno dell autoclave Temperatura ( C) 0, , , , , , FIGURA 6.6 All interno dell autoclave è sistemato il cestello per l alloggiamento degli strumenti e dei materiali. Sul fondo è presente una resistenza elettrica immersa nell acqua distillata minuti. Per volumi superiori il tempo del ciclo di sterilizzazione, naturalmente, deve essere aumentato. Il vapore sotto pressione è impiegato nella sterilizzazione dei terreni di coltura, della vetreria e degli strumenti metallici. Affinché il processo sia efficace, è necessario che prima del trattamento sia eliminata tutta l aria contenuta nell autoclave. Durante la preparazione dei materiali da sterilizzare, occorre seguire alcuni accorgimenti (come la parziale apertura dei tappi) per evitare che durante il ciclo di sterilizzazione si producano anomalie nella pressione interna dei contenitori, che potrebbero comportarne l implosione o l esplosione Calore secco Utilizza come mezzo di trasferimento del calore l aria; è impiegato soprattutto per la sterilizzazione di strumenti e materiali non deteriorabili e non disidratabili come oggetti in vetro, in porcellana o in metallo. In questo modo possono essere sterilizzati: siringhe, aghi, vetreria e strumenti chirurgici. L ap pa rec chia tu ra che permette questo trattamento è la stufa a secco di Pasteur (fig. 6.7), nella quale il riscaldamento è prodotto da una resistenza elettrica. La sterilizzazione a secco prevede trattamenti a 180 C per 60 minuti o a 160 C per 120 minuti Incenerimento Un ulteriore trattamento termico è l incenerimento; con esso si possono raggiungere temperature superiori ai 500 C o più; è impiegato per la distruzione di materiale infetto e di medicazione, cadaveri, rifiuti; in laboratorio con questa finalità può essere impiegato il calore della fiamma diretta del becco Bunsen, con cui è possibile arroventare l ansa di platino o flambare l apertura dei recipienti (fig. 6.8).

6 6 Le basi microbiologiche della Biochimica Riscaldano in pochi minuti gli alimenti e le sostanze organiche irradiate. Sono riflesse dalle strutture metalliche; non scaldano l aria, la carta, il legno, la porcellana e i materiali plastici. Il riscaldamento prodotto dalle microonde è conseguente alla intensa vibrazione delle molecole d acqua contenute all interno dei prodotti trattati. Più alto è il contenuto d acqua, più rapido è il riscaldamento. Le sostanze isolanti prive d acqua si riscaldano esclusivamente per conduzione. Le microonde sono utilizzate in laboratorio nella preparazione dei terreni di coltura solidi, in quanto permettono di sciogliere rapidamente l agar-agar. La cottura dei cibi con le microonde, a differenza di quella tradizionale, presenta un inferiore capacità microbicida. FIGURA 6.7 Stufa a secco di Pasteur Basse temperature Se le temperature sono portate a livelli inferiori della temperatura minima, cessa la riproduzione microbica. A basse temperature sono inibite le attività enzimatiche, ma l azione microbicida è piuttosto modesta e limitata ai danni cellulari conseguenti alla formazione di cristalli di ghiaccio, che comportano la lisi cellulare. In laboratorio i trattamenti alle basse temperature hanno come finalità soprattutto quella di permettere una conservazione di prodotti facilmente deteriorabili; sono impiegati per la conservazione dei terreni di coltura, dei reattivi e dei ceppi microbici. I trattamenti alle basse temperature sono diversi e comprendono, in particolare: la refrigerazione, il congelamento e il surgelamento Refrigerazione È un trattamento che prevede il mantenimento del prodotto a una temperatura compresa tra 0 e 8 C (fig. 6.9). È in gra Microonde FIGURA 6.8 Passaggio sulla fiamma dell apertura di una provetta prima del trapianto di una brodocoltura. FIGURA 6.9 el laboratorio microbiologico la cella refrigerante è utilizzata per la conservazione di molti prodotti e dei microrganismi per un limitato periodo di tempo.

7 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica 7 do di rallentare la riproduzione degli psicrofili (criofili) e di inibire la riproduzione microbica dei mesofili e dei termofili (effetto batteriostatico), tuttavia specie patogene mesofile, come lo Sta phy lo coc cus aureus o il Clostridium botulinum, hanno dimostrato la capacità di crescere, anche se lentamente, a questi valori. In laboratorio un tale trattamento è impiegato nella conservazione di molti reattivi, dei terreni di coltura pronti all uso e delle colture microbiche Congelamento el congelamento la temperatura è abbassata sotto il punto di solidificazione dell acqua e, quindi, in modo da trasformare l acqua contenuta in ghiaccio; inibisce la moltiplicazione microbica. La temperatura di formazione dei cristalli di ghiaccio è in rapporto alla concentrazione dei sali disciolti. Con il diminuire della temperatura, aumenta la formazione del ghiaccio e si abbassa la quantità d acqua residua; per la carne questa quota a 5 C è il 26%, mentre a 18 C è il 14%. el congelamento rapido si porta l alimento tra i 18 e i 40 C. Il vantaggio del congelamento rapido consiste nella formazione di cristalli di ghiaccio con dimensioni inferiori al normale congelamento. È in grado di permettere una migliore conservazione del prodotto e per tempi più lunghi. Del resto in queste condizioni è meglio conservata la flora microbica, in quanto subisce meno danni a livello cellulare; una volta riportata la temperatura a valori idonei, si ha una rapida riattivazione delle attività metaboliche e la ripresa della proliferazione cellulare Surgelamento Con il surgelamento il prodotto è portato in tempi rapidi (<4 ore) a 20 C ed è mantenuto a una temperatura intorno ai 18 C. Inibisce le attività metaboliche microbiche e garantisce una migliore conservazione di quanto trattato. elle carni l azzeramento delle attività metaboliche avviene intorno a 8 C per i batteri, a 10 C per i lieviti e a 12 C per le muffe. La sopravvivenza dei microrganismi mantenuti a temperature di 20 C è molto più alta rispetto a quelli conservati a 2 C, in quanto vi è una maggiore integrità delle strutture cellulari e delle componenti enzimatiche. Per questo motivo i ceppi microbici sono conservati alla temperatura dell azoto liquido ( 196 C) anche per tempi lunghissimi Essiccamento L acqua è alla base di tutti i processi biologici. È impiegata come solvente o come reagente in molte reazioni: infatti, rappresenta il donatore del potere riducente nella fotosintesi, oltre ad essere impiegata nelle reazioni idrolitiche. I microrganismi richiedono un continuo e adeguato apporto di questo composto. L acqua è richiesta in modo diverso, ma sempre a concentrazioni molto elevate. La forma con cui deve essere fornita è quella libera. Il parametro che esprime la concentrazione di acqua libera di una soluzione è l attività dell acqua o Aw (Activity water); indica, com è già stato ricordato in precedenza, il rapporto tra la tensione di valore della soluzione esaminata e la tensione di vapore dell acqua distillata. Di conseguenza, per l acqua distillata il valore dell Aw è uguale a 1. In una soluzione, l Aw diminuisce con l aumentare della concentrazione dei soluti disciolti. Se una cellula microbica, ad esempio batterica, è introdotta in un ambiente a bassa Aw, come una soluzione ad Membrana Parete FIGURA 6.10 La plasmolisi batterica comporta il distacco della membrana plasmatica dalla parete cellulare, per il richiamo dell acqua dall interno verso l esterno. alta concentrazione salina o zuccherina, viene richiamata acqua dall interno della cellula; in queste condizioni diminuisce il volume cellulare, mentre la parete rigida mantiene la sua conformazione. La membrana cellulare, richiamata dalla diminuzione del volume citoplasmatico, si distacca dalla parete, dando luogo al fenomeno della plasmolisi (fig. 6.10). In Staphylococcus aureus quando l Aw passa da 0,99 a 0,95 si ha la perdita di circa il 50% di acqua intracellulare, con inevitabile alterazione delle attività metaboliche. Sotto tali valori si ha prima un rallentamento della crescita e in seguito, quando sono raggiunti i valori limite, l arresto dell attività riproduttiva. In definitiva una specie microbica si riproduce all interno di un limitato intervallo di Aw. I batteri prediligono un Aw superiore a 0,90; la maggior parte dei lieviti si riproduce a un Aw superiore a 0,85 e la maggior Aw = P è la tensione di vapore della soluzione. P 0 è la tensione di vapore dell acqua distillata. P P 0

8 8 Le basi microbiologiche della Biochimica TABELLA 6.4. Livelli minimi di Aw richiesti da alcuni microrganismi Valori di Aw 0,62 Saccharomyces rouxi 0,71 Aspergillus chevalieri 0,78 Aspergillus ochraceus Microrganismi 0,79 Penicillium verrucosum 0,80 Aspergillus flavus 0,83 Staphylococcus aureus 0,87 Fusarium moniliforme TABELLA 6.5. Lunghezze d onda orientative delle radiazioni elettromagnetiche Radiazione Lunghezza d onda (nm) γ Da 10 5 a 10 2 X Da 10 2 a 20 Ultravioletta Da 20 a 400 Visibile Da 400 a 800 Infrarossi Da 400 a Microonde Da a 10 9 nde radio Da 10 9 a ,90 Saccharomyces cerevisiae 0,92 Bacillus cereus 0,93 Clostridium botulinum (proteolitico) 0,93 Escherichia coli 0,95 Salmonella typhi 0,97 Clostridium botulinum (non proteolitico) parte delle muffe a un Aw superiore a 0,80. Se alcune specie possono resistere anche a valori inferiori e prossimi a 0,60, sotto questo valore le capacità riproduttive dei microrganismi sono di fatto impossibili (tab. 6.4). L allontanamento dell acqua da un determinato substrato o l aggiunta di sale o di zucchero comporta la diminuzione della Aw; questo principio è alla base di molti metodi antimicrobici, impiegati nella conservazione degli alimenti. L allontanamento dell acqua può essere ottenuto mediante un trattamento che prevede il riscaldamento e la ventilazione del prodotto, così come ottenuto in numerose tecniche tradizionali. ella liofilizzazione il prodotto è inizialmente congelato e, in seguito, posto sotto vuoto per permettere la sublimazione dell acqua. I prodotti liofilizzati mantengono gran parte delle caratteristiche nutrizionali e organolettiche originarie, ma conservano intatta la carica microbica, seppure fortemente inibita dalla carenza d acqua libera; devono essere mantenuti in involucri protettivi in quanto, per il basso contenuto d acqua (compreso tra il 2 ed il 5%), sono fortemente igroscopici. c = λ f Pertanto maggiore è la lunghezza d onda, minore è la frequenza. Le radiazioni elettromagnetiche possiedono un contenuto energetico tanto più alto quanto più elevata è la frequenza; in base a quest ultimo parametro possono essere suddivise in γ, x, ultraviolette, visibili, infrarosse e onde radio. Le radiazioni elettromagnetiche più importanti per i loro effetti antimicrobici sono le ultraviolette, le x e le γ nm Raggi Raggi x Raggi ultravioletti Raggi infrarossi 400 nm 500 nm Radiazioni elettromagnetiche Le radiazioni elettromagnetiche (fig. 6.11) sono forme d energia prodotte dalla materia ed emesse nello spazio alla velocità della luce. Presentano alcuni caratteri tipici dei fenomeni ondulatori e, come tutte le onde, possono essere descritte in base alla lunghezza d onda e alla frequenza possedute. Tra la frequenza e la lunghezza d onda esiste la seguente relazione: V = λ f Microonde nde radio 600 nm dove λ rappresenta la lunghezza d onda, mentre f rappresenta la frequenza, cioè il numero di periodi prodotti dall onda nell unità di tempo. Dal momento che per la radiazione elettromagnetica la velocità (V) è costante e corrisponde alla velocità della luce (c), risulta che: nm FIGURA 6.11 Lunghezze d onda orientative delle radiazioni elettromagnetiche espresse in nanometri (10 9 metri).

9 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica Radiazioni ultraviolette Le radiazioni ultraviolette hanno una lunghezza d onda di poco inferiore alle radiazioni visibili. Il campo dell ultravioletto si suddivide in due sottocampi: il lontano (UVB), che dai limiti dei raggi x ( 20 nm) si estende fino a 200 nm; il vicino, che dai 200 nm giunge fino a 400 nm (UVA). Quelle dotate del maggiore effetto microbicida possiedono una lunghezza d onda intorno ai 260 nm. A questa lunghezza, gli acidi nucleici presentano un elevato assorbimento a livello delle basi pirimidiniche e in particolare della timina. Le conseguenze maggiori riguardano il DA, in quanto la timina è contenuta esclusivamente in questa molecola. Le basi azotate, eccitate dalla radiazione ultravioletta, presentano una maggiore reattività con le basi azotate poste in vicinanza. In particolare la timina può interagire con una timina adiacente, con conseguente formazione di un dimero timina-timina. Le alterazioni comportano distorsioni della conformazione molecolare del DA che, se non correttamente riparate, producono alterazioni nella trascrizione degli RA e nella fase replicativa del DA stesso. Le radiazioni ultraviolette presentano scarsa capacità penetrativa; sono assorbite da sottili strati d acqua e vetro e per questo motivo sono impiegate nei trattamenti antimicrobici delle superfici. Sono prodotte naturalmente o artificialmente. Le radiazioni ultraviolette naturali provengono dal sole, ma per la maggior parte sono assorbite dall ozono ( 3 ) presente negli strati superiori dell atmosfera (ozonosfera). Quelle che raggiungono la superficie terrestre possiedono una lunghezza d onda prossima al visibile ed hanno uno scarso potere microbicida. Le radiazioni ultraviolette che producono i maggiori danni ai microrganismi sono ottenute artificialmente attraverso lampade a vapori di mercurio. Sono utilizzate soprattutto nel trattamento delle superfici e dei locali in cui deve essere garantito un contenuto microbico estremamente basso o del tutto assente. In particolare sono impiegate nelle sale operatorie, negli ambienti destinati alla preparazione dei terreni di coltura e dei farmaci. I gruppi microbici più sensibili alle radiazioni ultraviolette sono le forme vegetative dei batteri e dei micromiceti. Anche i virus sono piuttosto sensibili; in particolare i DAvirus presentano FIGURA 6.13 Il materiale monouso in polistirene, impiegato in microbiologia, è commercializzato in contenitori sigillati dopo la sterilizzazione con i raggi γ. una maggiore sensibilità a 265 nm, mentre gli RAvirus dimostrano una maggiore sensibilità a 230 nm. Durante l impiego delle radiazioni ultraviolette, a causa dei gravi fatti irritativi che si producono a livello della cute e delle mucose, è necessario adottare dispositivi di protezione individuale, come occhiali, guanti e camici integrali, che proteggono contro l esposizione delle superfici corporee (fig. 6.12) Radiazioni ionizzanti Sono dotate di un alto contenuto energetico e di un elevata capacità penetrativa. Provocano danni rilevanti alle molecole organiche di tutti gli organismi, in particolare agli acidi nucleici; possiedono un elevatissimo effetto microbicida. L azione specifica posseduta è la capacità di alterare le strutture atomiche, provocando l espulsione dei protoni e degli elettroni, formando ioni e radicali liberi altamente reattivi. A livello del DA producono alterazioni dei legami fosfodiesterici e delle basi azotate, con conseguenze di notevole gravità nella struttura molecolare. Tali alterazioni possono essere in parte ripristinate, ma quando vanno oltre la capacità riparativa risultano irreversibili, in quanto comportano modificazioni permanenti, che sono trasmesse alla discendenza; talora sono letali per l organismo. Comprendono i raggi x e γ. I raggi γ comprendono radiazioni elettromagnetiche con lunghezza d onda tra 10 5 e 10 3 nm; sono ottenuti artificialmente per bombardamento del Co 60 o del Cs 137. Ionizzano le molecole organiche e, in particolare, gli acidi nucleici che possono essere danneggiati irreversibilmente. Sono impiegati soprattutto nel trattamento degli alimenti; sono utilizzati in Italia solo come antigermogliante di patate, aglio e cipolla. Più importante è il loro impiego industriale nella sterilizzazione di materiale monouso in polistirene, come provette, piastre Petri, contenitori, pipette e siringhe (fig. 6.13). I raggi x comprendono radiazioni con una lunghezza d onda tra 10 3 e 20 nm; sono prodotti dall interazione tra elettroni dotati di alta energia e un elettrodo metallico. Possiedono la capacità di penetrare facilmente attraverso la materia vivente e di modificare gli acidi nucleici. Il loro utilizzo in microbiologia è limitato, mentre sono importanti nella diagnostica medica. FIGURA 6.12 ella cappa a flusso laminare oltre ad una lampada a fluorescenza è presente una lampada a raggi ultravioletti Filtrazione È un trattamento con cui sono rimossi microrganismi contenuti in prodotti liquidi a bassa torbidità. Questa meto-

10 10 Le basi microbiologiche della Biochimica FIGURA 6.14 membrana. Apparecchiatura per la filtrazione sterilizzante su on esiste una sostanza tossica per i microrganismi, ma totalmente innocua per gli organismi superiori; di conseguenza nei trattamenti antimicrobici deve essere tenuto in adeguata considerazione il rapporto tra tossicità nei confronti dei microrganismi e gli effetti prodotti sugli organismi (tossicità selettiva). È fondamentale, inoltre, conoscere anche il meccanismo con cui le sostanze agiscono e la situazione in cui sono impiegate. L ipoclorito di sodio, ad esempio, possiede una spiccata azione ossidante nei confronti dei microrganismi, ma è piuttosto irritante nei confronti dei tessuti. Per questo motivo nella disinfezione delle superfici, che non vengono a contatto con gli organismi, può essere impiegato anche a concentrazioni relativamente elevate (1-2%); tuttavia, quando s intende impiegarlo come antisettico cutaneo (fig. 6.15), si deve ricorrere a preparazioni a concentrazioni più basse e per tempi limitati. Il problema della tossicità è ancora più rilevante se le sostanze antimicrobiche devono pervenire all interno del corpo con l acqua e gli alimenti o come farmaci impiegati contro le malattie infettive. Per questo motivo nei trattamenti di potabilizzazione delle acque che impiegano ipoclorito di sodio, si deve ricorrere a concentrazioni ancora più basse. Tutto questo garantisce un efficace attività del composto nei confronti della flora microbica, ma evita che siano prodotti effetti nocivi sull organismo. In sintesi nei trattamenti mediante agenti chimici è necessario tenere in considerazione i seguenti parametri: il meccanismo d azione. I meccanismi con cui le sostanze agiscono nei confronti dei microrganismi sono in genere piuttosto complessi. I meglio definiti sono quelli che coinvolgono i farmaci antimicrobici; lo spettro d azione. Con questo termine s intende il complesso dei gruppi microbici verso cui l azione antimicrobica è efficace. on esiste un composto attivo in uguale misura su tutte le forme microbiche; dologia si basa sull impiego di filtri con una porosità, che permette la ritenzione di tutti i microrganismi dotati di struttura cellulare; presenta un importante limitazione, in quanto non trattiene i virus. In passato sono stati utilizzati filtri di farina fossile o di porcellana porosa; ora trovano impiego sempre più ampio le membrane filtranti monouso in acetato di cellulosa, con porosità compresa tra 0,2 e 0,8 μ (fig. 6.14). Con esse in laboratorio è possibile assicurare la ritenzione dei microrganismi; per la completa filtrazione dei batteri è necessario ricorrere a membrane con una porosità di 0,2 μ. La filtrazione è utilizzata nei trattamenti di materiali liquidi contenenti costituenti termolabili, che non permettono di ricorrere alla sterilizzazione in autoclave, come la preparazione di alcuni terreni di coltura, la decontaminazione di soluzioni vitaminiche, di antibiotici, di sieri; è impiegata anche nella determinazione della carica microbica AGETI ATIMICRBICI CHIMICI Molte sostanze sono in grado di ostacolare la crescita microbica. Un esempio esplicativo è rappresentato dagli agenti che innalzano il potenziale redox, come i nitrati, i nitriti o l acqua ossigenata; questa categoria di sostanze possiede un sicuro effetto tossico nei confronti degli anaerobi obbligati, che possono riprodursi solo in condizioni di basso potenziale ossidoriduttivo. Gli antibiotici, invece, sono in grado di interagire con le componenti microbiche alterandone struttura e fisiologia; le penicilline, per esempio, agiscono sulla parete cellulare impedendo la sintesi del pe pti do gli ca no. FIGURA 6.15 Disinfettanti antisettici e farmaci antimicrobici costituiscono un amplissima categoria di sostanze il cui impiego deve essere attento agli effetti che possono essere prodotti.

11 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica 11 concentrazione e periodo di impiego. La concentrazione e la durata del trattamento antimicrobico devono essere tali da ottenere il massimo effetto antimicrobico e, al contempo, limitare il più possibile i danni nei confronti dei materiali o degli organismi coinvolti; tossicità selettiva. Una sostanza ideale dovrebbe avere una elevata efficacia nei confronti di una gran varietà di microrganismi, agire rapidamente e non produrre effetti dannosi nei confronti dei materiali e degli organismi; natura del materiale da trattare. Il disinfettante deve essere compatibile con il materiale trattato. Alcuni disinfettanti sono ottimi per la disinfezione di oggetti, ma non idonei come antisettici, in quanto possono provocare lesioni cutanee. Le caratteristiche chimico-fisiche ambientali modificano l efficacia della sostanza impiegata. La presenza di proteine, ad esempio, limita l azione degli acidi e delle basi che, di conseguenza, devono essere impiegati in concentrazioni più elevate. Le sostanze chimiche comunemente coinvolte nei trattamenti antimicrobici sono suddivise in tre categorie: disinfettanti, antisettici e farmaci antimicrobici. Per disinfettanti s intendono le sostanze utilizzate, di norma, nel trattamento dei materiali e degli ambienti, mentre gli antisettici sono composti impiegati a livello cutaneo. I farmaci antimicrobici, infine, sono sostanze naturali o di sintesi che hanno lo scopo di combattere le malattie infettive. Alcuni disinfettanti possono essere impiegati, in opportune concentrazioni, anche come antisettici Disinfettanti e antisettici Il cloro. È largamente utilizzato sotto forma di biossido di cloro (1-3 ppm), di cloramine (2 ) e soprattutto d ipoclorito di sodio (0,1-5%) nella disinfezione delle acque, delle superfici, di contenitori, della frutta e come antisettico cutaneo. In rapporto al tipo d impiego, di queste sostanze è necessario allestire idonee diluizioni. L azione dei composti del cloro è fortemente ossidante per la liberazione di radicali liberi, come l ossigeno nascente, e per la combinazione del cloro con le proteine di membrana. Lo iodio. È largamente impiegato come antisettico cutaneo in soluzione alcolica (0,5-2%) e acquosa (0,25-1% + ioduro di potassio). Possiede un azione battericida molto energica rivolta contro le cellule batteriche e contro le strutture sporali, in rapporto alla capacità elevata di denaturare le proteine. Sono in commercio anche miscele di iodio e sostanze tensioattive (composti iodofori). Composti dell ossigeno. Tra i composti dell ossigeno devono essere ricordati l acqua ossigenata e l ozono. Sono energici ossidanti, poiché sono in grado di liberare ossigeno nascente; mentre l acqua ossigenata è impiegata in opportune diluizioni come antisettico, l ozono è utilizzato soprattutto nei processi di potabilizzazione delle acque. I metalli pesanti. umerosi metalli possiedono un elevato effetto microbicida. Tra questi possono essere ricordati i sali di mercurio mercurocromo e mertiolato di sodio), d argento (nitrato d argento) e di rame (solfato di rame). L azione dei metalli pesanti è conseguente alla combinazione con le molecole proteiche microbiche; i sali di mercurio sono largamente utilizzati come antisettici cutanei, mentre il nitrato d argento è stato impiegato per lungo tempo come antiblenorragico nelle istillazioni oculari dei neonati. Acidi e basi. Per il forte potere corrosivo sono scarsamente utilizzati. L azione microbica è prodotta dall elevata quantità degli idrogenioni, degli ossidrili liberati e dalla TABELLA 6.6. Alcune molecole inorganiche dotate di potere antimicrobico Ipoclorito di sodio Composti del cloro acl Biossido di cloro Cl 2 Cloramina H 2 Cl Composti dello iodio Iodio I 2 Ioduro di potassio KI Composti dell ossigeno zono 3 Perossido di idrogeno H 2 2 Metalli pesanti Solfato di rame CuS 4 itrato d argento Ag 3 Acidi e basi Acido solforico H 2 S 4 Idrato di calcio Ca (H) 2 Idrato di sodio ah conseguente modificazione del ph della soluzione. Le variazioni del ph alterano la solubilità delle sostanze disciolte nell ambiente di crescita, le proteine di membrana e gli enzimi cellulari. Queste alterazioni possono produrre gravi danni strutturali e funzionali, fino alla morte cellulare. Sono impiegati per il trattamento degli ambienti molto inquinati. Tra gli acidi e le basi più utilizzati possono essere ricordati: l acido solforico, l idrato di calcio e l idrato di sodio (tab. 6.6). Gli alcoli. Quello più comunemente impiegato è l alcool etilico alla concentrazione del 50-70% in soluzione acquosa; presenta discreta efficacia nei confronti delle forme vegetative. È del tutto inefficace nei confronti delle spore e dei microrganismi dotati di un elevata resistenza, come il bacillo tubercolare. Gli effetti microbicidi sono conseguenti alla denaturazione delle proteine e alla solubilizzazione dei lipidi. Gli alcoli sono stati largamente impiegati come antisettici cutanei, ma sono fortemente irritanti per le mucose e per i tessuti in genere. Fenoli. Comprendono il fenolo in soluzione all 1-5% e l esaclorofene in soluzione al 2%. Possiedono un importante capacità microbicida, per la capacità di denaturare le proteine e solubilizzare i lipidi. Sono molto corrosivi, irritanti e tossici. Sono scarsamente attivi sulle spore e sono impiegati nella disinfezione degli ambienti molto contaminati. Formaldeide e ossido d etilene. Sono attivi su tutte le forme microbiche, comprese le spore; la loro azione è conseguente alla denaturazione delle proteine e degli acidi nucleici. La formaldeide è impiegata sotto forma gassosa nella sterilizzazione ambientale e, sotto forma liquida (formalina), di strumenti. L ossido d etilene è impiegato nella

12 12 Le basi microbiologiche della Biochimica Alcoli CH 2 H Alcol etilico Fenoli H Acido fenico Cl Cl Detergenti anionici e cationici. Alcuni detergenti cationici possiedono un elevata capacità microbicida. I detergenti cationici più efficaci sono i sali d ammonio quaternari ed in particolare il cloruro di benzalconio. L azione di questi composti è piuttosto complessa: solubilizzano la membrana, denaturano le proteine e inibiscono l attività enzimatica (fig. 6.16). Sono attivi nei confronti di gran parte delle forme microbiche come batteri, protozoi, micromiceti e virus. Sono largamente impiegati come antisettici cutanei e nella disinfezione di superfici, indumenti e oggetti. Tra i detergenti anionici possono essere ricordati i saponi e il sodio laurilsolfato. Sono impiegati nell igiene personale e delle superfici. Alcune molecole organiche dotate di potere antimi- FIGURA 6.16 crobico. H R C Cl Cl Cl Formaldeide H R CH 2 C H 2 C sterilizzazione di strumenti e materiali termolabili. Sia la formaldeide che l ossido di etilene possiedono un azione fortemente irritante e tossica. È da tenere in considerazione l infiammabilità dell ossido d etilene. H H Cl Detergenti anionici + Esaclorofene CH 2 ssido d etilene Belzalconio cloruro CH 2 Detergenti anionici e cationici Cl Farmaci antimicrobici ella terapia contro numerose malattie infettive, in particolare batteriche, sono state impiegate con grande successo sostanze estratte da numerosi microrganismi (antibiotici), oltre a molecole ottenute per sintesi (chemioterapici antimicrobici). I farmaci antimicrobici sono stati introdotti da Paul Ehrlich. Questo ricercatore nel 1910 impiegò per primo i sali d arsenico nella terapia della sifilide e alcuni coloranti contro i tripanosomi agenti della malattia del sonno. egli anni successivi alcuni studiosi come G. Domagk in Germania e J. Trefouel in Francia, scoprirono l effetto inibente da parte della sulfanilamide da cui derivò un importante famiglia di farmaci antimicrobici: i sulfamidici. Alla fine degli anni venti Alexander Fleming osservò l effetto inibente prodotto da alcune muffe inquinanti del genere Penicillium nelle colture dello St. aureus. Estrasse e isolò da questi miceti una sostanza, che denominò penicillina, di cui dimostrò un elevato potere microbicida. L impiego degli antibiotici nella terapia antimicrobica, nonostante sia stato condotto in modo spesso inadeguato, ha permesso di conseguire importantissimi risultati nei confronti di molti microrganismi patogeni Sulfamidici I sulfamidici sono chemioterapici antimicrobici ad azione batteriostatica, attivi sui Gram positivi e sui Gram negativi durante la fase d accrescimento. Possiedono una struttura molecolare analoga a quella dell acido para-aminobenzoico (PABA), che è impiegato da molti batteri nella sintesi dell acido folico: un coenzima fondamentale nella sintesi degli aminoacidi, delle vitamine e degli acidi nucleici (fig. 6.17). La molecola dei sulfamidici (fig. 6.18) è in grado di competere con il PABA se si trova nei tessuti a una con centrazione superiore ad esso (fig. 6.19); s incorpora al suo posto nell en- H 2 S H 2 Sulfanilamide H 2 CH Acido para-aminobenzoico FIGURA 6.17 H 2 H CH CH 2 H C H CH CH 2 CH 2 CH H Acido folico La sulfanilamide è una molecola analoga all acido para-aminobenzoico impiegato dai batteri nella sintesi dell acido folico.

13 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica 13 H H S H R' FIGURA 6.18 Formula generale dei sulfamidici. zima che catalizza la formazione dell acido folico, bloccandone la sintesi. I sulfamidici sono ben tollerati dai mammiferi in quanto in questi organismi l acido folico non è sintetizzato, ma assunto direttamente con gli alimenti. I sulfamidici si sono rivelati utili nel trattamento delle infezioni delle vie respiratorie sostenute da streptococchi e stafilococchi e nelle infezioni alle vie urinarie sostenute da Gram negativi, come le neisserie e le shigelle. Possono essere ancora impiegati in alternativa agli antibiotici, in presenza di manifestazioni di tipo allergico. Un altro esempio di chemioterapico antimicrobico è costituito dall isoniazide (idrazide dell acido isonicotinico) attiva nei confronti dei micobatteri. Avendo una struttura analoga a quella della piridossina (vitamina B6) l isoniazide blocca i processi che impiegano la piridossina Antibiotici e chemioterapici antimicrobici Costituiscono un gruppo di sostanze antimicrobiche caratterizzate da strutture molecolari e meccanismi d azione piuttosto diversi. umerosi sono prodotti naturalmente da batteri e micromiceti (antibiotici), altri artificialmente (chemioterapici antimicrobici). Possiedono azione battericida o batteriostatica e sono classificati in rapporto al meccanismo di azione in: inibitori della sintesi della parete cellulare; inibitori della funzionalità di membrana; inibitori della sintesi proteica; inibitori del metabolismo del DA. FIGURA 6.20 Muffe del genere Penicillium. Da questo gruppo microbico sono stati estratti antibiotici di notevole efficacia. Inibitori della sintesi della parete cellulare. Compren do no un gruppo di antibiotici largamente utilizzati nella terapia di patologie di origine batterica. Sono dotati di un importante azione battericida. Tra essi possono essere ricordate le penicilline, le cefalosporine e la vancomicina. Le penicilline sono state le prime molecole impiegate nella terapia contro le malattie infettive da H.W. Florey nel Attualmente la famiglia delle penicilline comprende numerosi antibiotici con analoga struttura di base, ma con un differente meccanismo d azione. Alcune penicilline sono naturali in quanto prodotte da miceti del genere Penicillium (fig. 6.20), come Penicillium notatum e Penicillium chrysogenum. Modificando l acido 6-amino-penicillanico (fig. 6.21) con vari radicali sono state ottenute artificialmente altre penicilline (fig. 6.22), dotate di nuove proprietà. Le penicilline agiscono bloccando la fase terminale della sintesi della struttura del peptidoglicano (mureina); si ipotizza che agiscano sulla parete batterica legandosi in modo irreversibile all enzima che catalizza la formazione dei legami trasversali, tra le catene lineari del peptidoglicano (fig. 6.23). ella impossibilità di giungere ad una S R C H CH 3 CH Penicilline FIGURA 6.19 Inibizione da parte dell acido para-aminobenzoico (PABA) di un sulfamidico. In una piastra seminata con uno stafilococco sono stati posti due dischi contenenti il sulfamidico (S). Accanto ad uno dei due è posto un disco contenente PABA. Dopo incubazione è evidente l inibizione da parte del PABA del sulfamidico. FIGURA 6.21 S H 2 CH 3 CH Acido 6-aminopenicillanico Le strutture molecolari alla base delle penicilline.

14 14 Le basi microbiologiche della Biochimica CH 2 C H S CH H CH C H H 2 S CH Benzilpenicillina (Pen G) Amoxicillina (Amox) Cl Cl C H S CH C H S CH Dicloxacillina (Diclox) FIGURA 6.22 Struttura molecolare di alcune penicilline. xacillina (xa) sintesi corretta della parete, il batterio va incontro a lisi cellulare. Le penicilline sono molecole dotate di un alta tossicità selettiva. Attive nei confronti delle cellule procariotiche, mancano di un attività specifica nei confronti della cellula eucariotica, poiché priva di mureina. Le cefalosporine (fig. 6.24) costituiscono una classe di antibiotici con caratteristiche in parte sovrapponibili alle penicilline semisintetiche. Sono prodotte da un micete: Cephalosporium acremonium. Inibitori della sintesi della membrana. Com prendo no un gruppo di sostanze di limitato impiego, in quanto gli antibiotici che agiscono sulla membrana cellulare batterica presentano un elevato grado di tossicità. Ciò è dovuto al fatto che non differenziano la membrana procariotica da quella eucariotica. Di conseguenza, sono scarsamente impiegati in terapia; in questo gruppo sono comprese le polimixine, il cui meccanismo d azione consiste nell alterazione dei processi di trasporto. Sono impiegate nelle infezioni sostenute da Gram negativi e in particolare da Pseu do mo nas. Inibitori della sintesi proteica. Comprendono alcuni antibiotici come la tetraciclina, la streptomicina, l eritromicina ed il cloramfenicolo. Agiscono a livello dei ribosomi impedendo il processo della traduzione. Le tetracicline (fig. 6.25) costituiscono un gruppo di molecole (tetracicline, clortetracicline, ossitetracicline). Possiedono proprietà molto simili. Agiscono legandosi alle subunità 30S impedendo il legame dell aminoacil-tra al complesso mra-ribosoma. In vitro le tetracicline sono attive sia sui ribosomi procariotici, sia su quelli eucariotici; la tossicità selettiva sembra conseguente alla maggiore permeabilità delle cellule procariotiche, rispetto a quelle eucariotiche. Ciò comporterebbe una maggiore concentrazione delle molecole dell antibiotico all interno del batterio. Sono antibiotici a largo spettro e quindi attivi sui Gram positivi, ma anche sui Gram negativi. Sono impiegati anche nella terapia contro le infezioni sostenute da clamidie, micoplasmi e rickettsie. La streptomicina è prodotta dallo Streptomyces griseum; è attiva sui micobatteri, sulle salmonelle e su molti batteri resistenti alle penicilline e ai sulfamidici. L eritromicina è prodotta da Streptomyces erythraeus; è attiva sui Gram positivi, su alcuni Gram negativi e su alcune spirochete patogene. È attiva su gran parte dei batteri resistenti alla penicillina e alla streptomicina. Il cloramfenicolo possiede un ampio spettro d azione; è attivo, quindi, sui Gram positivi e sui Gram negativi. Inibitori del metabolismo del DA. In questo gruppo sono compresi la rifampicina, la mitomicina e la griseo- R C H S CH Cefalosporine R 1 Ponti trasversali FIGURA 6.23 Le penicilline agiscono sulla parete batterica bloccando la formazione dei legami trasversali tra le catene laterali del peptidoglicano. S R C H CH 2 C CH Acido aminocefalosporanico FIGURA 6.24 Struttura delle cefalosporine.

15 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica 15 TABELLA 6.7. Classificazione di alcuni antibiotici in base al loro meccanismo d azione Sito sensibile Antibiotici Spettro d azione Meccanismo Parete Penicilline Cefalosporine Vancomicina Bacitracina Cicloserina Batteri Gram+ e Gram Batteri Gram+ e Gram Batteri Gram+ e Gram Batteri Gram+ e Gram Stafilococchi, micobatteri Inibiscono la sintesi delle glicoproteine parietali Membrana cellulare Polimixine istatina Batteri Gram Funghi patogeni Alterano i meccanismi di permeabilità e di trasporto a livello della membrana Ribosomi Cloramfenicolo Eritromicina Streptomicina Tetracicline eomicina Batteri Gram+ e Gram Batteri Gram+, micoplasmi, clamidie Micobatteri Batteri Gram+ e Gram Batteri Gram Si legano tutti alle subunità ribosomiali alterando il processo della traduzione DA Actinomicina Rifampicina Mitomicina Batteri Gram+ e Gram ; molto tossica Batteri Gram+ e Gram ; molto tossica Batteri Gram+ e Gram ; molto tossica Blocca la trascrizione del DA in RA Blocca la trascrizione del DA in RA Blocca la replicazione del DA fulvina. Gli antibiotici attivi nei confronti del DA presentano una spiccata tossicità anche nei confronti delle cellule eucariotiche; per cui l adozione di una terapia antimicrobica con tali molecole comporta importanti effetti collaterali nell organismo su cui è adottata. L unica molecola degna di menzione è la rifampicina che si è dimostrata particolarmente attiva nei confronti delle RA polimerasi batteriche. È attiva sulla gran parte dei batteri Gram positivi e Gram negativi. È stata impiegata, in particolare, nella terapia contro la tubercolosi Resistenza agli antibiotici La notevole diffusione degli antibiotici ha portato alla comparsa, nell ambito della popolazione batterica, di ceppi resistenti a molecole verso cui erano in precedenza sensibili. Il fenomeno, definito antibiotico-resistenza, è dovuto alla capacità d adattamento genetico dei batteri nei confronti delle sostanze antimicrobiche impiegate; è stato messo in H H H H H H evidenza fino dalle prime fasi dell impiego degli antibiotici ed ha acquisito una importanza sempre più rilevante. Dal punto di vista biochimico, il carattere della resistenza è acquisito con mutazioni spontanee e casuali, ma anche con la selezione di ceppi batterici che lo possiedono a livello genetico. Queste modificazioni si presentano in tutte le popolazioni batteriche: mentre le cellule sensibili muoiono, le cellule che acquisiscono l antibiotico-resistenza si riproducono e si sostituiscono progressivamente a quelle sensibili. Lo studio dei meccanismi genetici della resistenza agli antibiotici ha permesso di comprendere che i geni della resistenza possono essere localizzati a livello cromosomico o extracromosomico. La resistenza cromosomica è prodotta da rare mutazioni. Una volta acquisita, è trasmessa a tutta la discendenza. Riguarda circa il 10% dei casi d antibiotico-resistenza. La resistenza extracromosomica è dovuta alla presenza di plasmidi (plasmidi R), che contengono, oltre ai geni per la resistenza a uno o a più antibiotici, i geni per la propria replicazione e il trasferimento a un altra cellula batterica. I geni per la resistenza possono essere trasmessi verticalmente alla discendenza cellulare, ma poiché i plasmidi possono trasferirsi da una specie a un altra con la coniugazione, il fenomeno dell antibiotico-resistenza può diffondersi anche nella popolazione microbica complessiva. L acquisizione della resistenza agli antibiotici è dovuta alla resistenza extracromosomica in circa il 90% dei casi totali. Dopo la loro introduzione nella terapia, i farmaci antimicrobici sono stati impiegati in modo eccessivo e spesso improprio. In effetti, oltre che nelle terapie antimicrobiche nell uomo e negli animali, alcuni antibiotici, come le tetra- ( ) 2 H 2 H H CH 2 H + CH CH H C CHCl 2 FIGURA 6.25 Formula della tetraciclina. FIGURA 6.26 Molecola del cloramfenicolo.

16 16 Le basi microbiologiche della Biochimica FIGURA 6.27 Antibiogrammi. Il microrganismo cresciuto in piastra presenta una diversa sensibilità nei confronti degli antibiotici presenti in ogni disco. cicline, sono stati utilizzati massivamente anche nell allevamento del bestiame, per la loro capacità di stimolarne l accrescimento. Questa pratica, del tutto illecita, ha contribuito a diffondere dei farmaci antimicrobici nell ambiente ed ha facilitato il continuo adattamento della flora batterica nei loro confronti (fig. 6.27). L acquisizione dell antibiotico-resistenza da parte dei batteri, ha spinto l industria farmaceutica alla continua ricerca di nuove molecole antimicrobiche, in grado di rispondere in modo più efficace nei confronti dei ceppi divenuti resistenti e ha indirizzato i medici a un impiego più mirato e limitato ai casi realmente necessari. I meccanismi biochimici con cui i microrganismi acquisiscono i caratteri dell antibiotico-resistenza dipendono dal tipo di antibiotico; quelli che sono stati maggiormente messi in evidenza sono i seguenti: i batteri possono sintetizzare enzimi con cui diventano capaci di inattivare gli antibiotici. Una situazione esemplificativa è rappresentata dallo Sta phy lo coccus aureus. Questo batterio può facilmente acquisire la capacità di produrre enzimi come le penicillinasi, che idrolizzano il legame β-lattamico delle penicilline (fig. 6.28); i batteri nel corso delle terapie possono modificare la permeabilità cellulare e rallentare la penetrazione dell antibiotico. Ad esempio la tetraciclina, nei batteri sensibili, penetra con facilità attraverso i rivestimenti cellulari, mentre nei ceppi resistenti oltrepassa la membrana plasmatica con notevole difficoltà; può verificarsi l alterazione del sito sensibile; in questo caso è impedito l attacco dell antibiotico. La resistenza alla rifampicina, ad esempio, è conseguente al cambiamento della RA polimerasi che rappresenta il sito d attacco dell antibiotico. R C H S Penicillinasi R C H S CH C H H C H FIGURA 6.28 Meccanismo d azione delle penicillinasi.

17 Capitolo 6. Il controllo della crescita microbica 17 QUESITI DEL CAPITL 6 1) Che tipo di crescita presentano i microrganismi se a essi vengono fornite le condizioni nutrizionali e chimico-fisiche idonee? 2) Quali danni può provocare nelle attività umane la proliferazione microbica? 3) Che cosa s intende con i termini: microbicida, microbiostatico, battericida e batteriostatico? 4) Da quali elementi dipende la scelta di un agente antimicrobico? 5) Si compili un elenco dei principali agenti antimicrobici fisici. 6) Si compili un elenco dei principali agenti antimicrobici chimici. 7) Che cosa s intende per tempo d inattivazione termica? 8) Che cosa s intende per tyndalizzazione? In quali condizioni è consigliato un simile trattamento? 9) Si descriva l autoclave e il ciclo di sterilizzazione in autoclave. 10) Quale rapporto esiste tra temperatura e pressione all interno dell autoclave? 11) Per quale motivo la sterilizzazione a secco non può essere impiegata nella preparazione dei terreni di coltura? 12) Su quali materiali si adotta la sterilizzazione con il calore secco? 13) Che tipo d effetto produce la refrigerazione sulla flora microbica? 14) Tra congelamento e congelamento rapido, quale trattamento ha un maggiore effetto microbicida? 15) Che cosa s intende con il termine Aw? 16) Quali sono i valori di Aw richiesti dai batteri, dalle muffe e dai lieviti? 17) Tra le radiazioni elettromagnetiche quali possiedono un maggiore effetto microbicida? 18) Quali sono gli effetti prodotti dalla radiazione ultravioletta sulla cellula microbica? 19) Quali effetti possono essere prodotti sugli organismi superiori dalla radiazione ultravioletta? 20) Quali accorgimenti devono essere adottati per evitare l esposizione in laboratorio alla radiazione ultravioletta? 21) Che cosa s intende per tossicità selettiva? 22) Che cosa s intende per disinfettante, antisettico e farmaco antimicrobico? Si faccia un esempio di ciascuno di essi. 23) Con quale meccanismo agisce la sulfanilamide? 24) A quale studioso sono ascrivibili le prime osservazioni e ricerche sugli antibiotici? 25) Su quali componenti cellulari agiscono gli antibiotici? 26) Per quale motivo gli antimicrobici che agiscono a livello della parete hanno una larga utilizzazione nella terapia? 27) Che cosa s intende per antibiogramma? 28) Che cosa s intende con il termine antibiotico-resistenza? 29) Con quali meccanismi biochimici è acquisita l antibiotico-resistenza? 30) In che modo agiscono le penicillinasi?