RUOLO DELLA CISTEINA NELLA RIEPITELIZZA- ZIONE CORNEALE DOPO CHERATECTOMIA FOTOREFRATTIVA

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1 Dr. SZ Scalinci RUOLO DELLA CISTEINA NELLA RIEPITELIZZA- ZIONE CORNEALE DOPO CHERATECTOMIA FOTOREFRATTIVA ROLE OF CYSTEINE IN CORNEAL REEPITHELIALIZATION AFTER PHOTOREFRACTIVE KERATECTOMY Riccettì A, Scalinci SZ, Scorolli L, Meduri R Università degli Studi di Bologna - Cattedra di Ottica Fisiopatologica (Dir.: Prof. R. Meduri) RIASSUNTO Nel presente studio abbiamo valutato l effetto di una supplementazione orale di cisteina nel processo di riepitelizzazione corneale dopo intervento di cheratectomia fotorefrattiva. A tale scopo sono stati seguiti 32 pazienti (32 occhi) ripartiti in 2 gruppi (Gruppo 1 e Gruppo 2) omogenei per età ed entità del vizio rifrattivo e ciascuno composto da 16 pazienti. Si è quindi somministrato ai pazienti del Gruppo 1 L-cisteina per os con dose giornaliera di 200 mg per 15 giorni a partire dai 7 giorni precedenti l intervento, utilizzando i pazienti dell altro gruppo come controllo. Dopo l intervento i pazienti sono stati monitorati giornalmente a partire dalle 24 ore successive, tramite biomicroscopia, per la misurazione del diametro del difetto epiteliale creato dal laser e successivamente sottoposti a controlli effettuati alla 1, 2, 3, 4 settimana dall intervento per la misurazione tramite microscopia confocale dello spessore dell epitelio corneale neoformato. Nel corso di tali controlli i pazienti del Gruppo 1 hanno mostrato un tempo di riepitelizzazione corneale inferiore rispetto ai pazienti del Gruppo 2 (102±15 ore contro 159±9 ore) e, alla 4 settimana, lo spessore dell epitelio corneale nei primi è risultato significativamente superiore rispetto ai secondi (50±5 µm contro 43±3 µm) ed equiparabile al valore medio misurato durante la visita preoperatoria. PAROLE CHIAVE: PRK, cisteina, riepitelizzazione. 66 SUMMARY In this study we have valued the effect of cysteine oral supplements in the process of corneal reepithelialization after PRK. At such purpose 32 patients (32 eyes), divided into two groups (Group 1 and Group 2) with the same age and comparable refractive defects, each made up of 16 patients, have been monitored. It was administered to patients in Group 1 L-cysteine per os, with a daily dose of 200 mg for 15 days starting from a week before surgery, using the other group (Group 2) as a control. After surgery, patients have been daily monitored starting from 24 hours following surgery, through biomicroscopy, to measure the epithelial diameter defect; patients were then monitored on 1th, 2th, 3th, 4th weeks after surgery through confocal microscopy, to value epithelial corneal thickness. During these controls, patients in Group 1 showed a time of reepithelialization inferior to patients in Group 2 (102±15 hours versus 159±9 hours); 4 weeks after surgery, corneal epithelial thickness, valued through confocal microscopy in patients in Group 1, resulted significatively superior to patients in Group 2 and comparable to the mean value measured during the baseline check. KEYWORDS: PRK, cysteine, reepithelialization. INTRODUZIONE La PRK (Photorefractive Keratectomy) rappresenta, fra le diverse tecniche di chirurgia refrattiva, quella attualmente più utilizzata per il trattamento dei vizi di rifrazione di entità da lieve a moderata. Analogamente alla LASIK (Laser Assisted In Situ Keratomileusis), dalla quale però si differenzia per la metodica di esecuzione, la PRK si avvale di laser ad eccimeri per modificare il raggio di curvatura della cornea e, di conseguenza, il suo potere diottrico. Il laser ad eccimeri, per la peculiarità delle radiazioni ultraviolette utilizzate, caratterizzate da un elevata intensità e da un basso potere di penetrazione nei confronti delle cellule biologiche, è un laser freddo, non producendo il suo effetto attraverso il calore, e quindi bruciando i tessuti, ma vaporizzandoli tramite la dissociazione dei legami molecolari. Il forte assorbimento di tali radiazioni in un ridotto spessore di tessuto corneale (epitelio, membrana di Bowman e stroma superficiale) ne determina la fotoablazione, producendo pertanto un rimodellamento della superficie corneale anteriore ed

2 una conseguente modificazione del potere diottrico oculare. Le principali complicanze della PRK comprendono ipo ed ipercorrezioni, decentramento del trattamento (quest ultimo, con le più recenti evoluzioni della metodica, assai meno frequente rispetto al passato) e le possibili conseguenze, dirette o indirette, della disepitelizzazione della superficie corneale prodotta dall azione del laser. Queste ultime sono rappresentate da processi infiammatori e/o infettivi, reazione algica corneale, comparsa di opacizzazioni corneali (Haze). L insorgenza di tali complicanze riconosce, infatti, nella soluzione di continuo provocata a livello corneale dalle radiazioni ultraviolette il principale fattore causale: la disepitelizzazione della superficie corneale e la distruzione della membrana di Bowman espongono il sottostante stroma superficiale all azione lesiva di agenti patogeni di varia natura (fisici, biologici, chimici) contribuendo, unitamente alla presenza in tale sede di residui ablativi proteici e lipidici, formatisi per effetto del laser e possibili substrati per l azione litica di enzimi ad attività proinfiammatoria, all insorgenza di uno stato flogistico post-operatorio e alla conseguente accentuazione di una sintomatologia algica corneale in genere sempre presente nelle ore successive all intervento. Quest ultima complicanza (reazione algica corneale) consegue all esposizione delle terminazioni nervose dei plessi subepiteliale e stromale traumatizzate dall azione del laser e può trovare un parziale sollievo nell applicazione di una lente a contatto terapeutica. Distruzione della membrana di Bowman (inevitabile conseguenza della fotoablazione laser) e disorganizzazione nel processo di cicatrizzazione corneale, evento quest ultimo estremamente complesso nella sua regolazione e strettamente correlato a eventi lesivi intercorrenti nell immediato decorso post-operatorio, possono essere alla base di un ulteriore complicanza della PRK consistente nella comparsa di opacizzazioni corneali centrali puntiformi, nella maggior parte dei casi asintomatiche e in genere transitorie (Haze), più frequenti con i primi laser che si basavano sull impiego di gas non stabili. La disepitelizzazione corneale laser indotta espone pertanto la cornea ad una serie di possibili complicanze, insorgenti nell immediato post-operatorio o a distanza di tempo dall intervento, in grado di influire sulla sintomatologia soggettiva del paziente, sull esito del trattamento fotoablativo e sul tempo di guarigione del difetto epiteliale. Una precoce riepitelizzazione corneale, con conseguente isolamento dall ambiente esterno del sottostante stroma può pertanto svolgere un ruolo fondamentale nel favorire e promuovere i processi riparativi della cornea, prevenendo l insorgenza di complicanze infiammatorie e/o infettive, limitando la sintomatologia algica successiva alla fotoablazione e favorendo, attraverso il mantenimento di una normale citoarchitettura corneale, la conservazione della trasparenza e della corretta geometria della cornea. Lo scopo del presente studio è stato valutare l efficacia di un apporto supplementare di cisteina nel promuovere e facilitare il processo di riepitelizzazione corneale dopo intervento di cheratectomia fotorefrattiva. PAZIENTI E METODI Il presente studio è stato condotto su un totale di 32 occhi di altrettanti pazienti con vizi di refrazione di entità da lieve a moderata in programma di essere sottoposti a intervento di cheratectomia fotorefrattiva (PRK). L età dei pazienti, di cui 19 maschi e 13 femmine, era compresa tra 22 e 41 anni, con una media di 33±7. I soggetti in esame erano affetti dai seguenti vizi di rifrazione: miopia (media -4.75±2.4 diottrie) in 26 pazienti, ipermetropia (media +3.2±0.5 diottrie) in 6 pazienti. Le seguenti condizioni sistemiche sono state considerate motivo di esclusione: patologie cardiovascolari scompensate, gravidanza, trattamenti immunosoppressivi, disordini neurologici e condizioni associate ad alterazioni del processo di cicatrizzazione, quali malattie autoimmuni e collagenopatie e diabete mellito, quest ultimo anche in relazione alle proprietà glucogenetiche della cisteina. Si sono inoltre considerati criteri di esclusione dallo studio le condizioni oculari di seguito riportate: glaucoma, cataratta, neuropatie ottiche, patologie vitreo-retiniche, cheratocono, flogosi uveali, pregressa cheratite erpetica, difetto rifrattivo non stabile da almeno 2 anni, gravi alterazioni del film lacrimale. Durante la visita preoperatoria i pazienti sono stati sottoposti agli esami qui di seguito indicati: - esame biomicroscopico del segmento anteriore e posteriore (lente VOLK 60D) dell occhio; - studio del campo visivo (perimetro computerizzato Humphrey); - valutazione dell acuità visiva naturale e corretta; - misurazione della PIO tramite tonometria ad applanazione (tonometro di Goldman); - autorefrattometria (autorefrattometro Nidek 1600); 67

3 68 - topografia corneale (Keratron Optikon); - pachimetria corneale (Tomey TMS-2); - conta delle cellule endoteliali (Topcon SP2000P); - valutazione della secrezione lacrimale tramite test di Schirmer, per escludere pazienti con xeroftalmia; - misurazione dello spessore dell epitelio corneale tramite microscopia confocale (Confoscan Nidek). I soggetti in esame sono stati istruiti a non utilizzare lenti a contatto nelle 2 settimane precedenti l intervento. I 32 pazienti inclusi nel nostro studio sono stati quindi ripartiti in 2 gruppi (Gruppo 1 e Gruppo 2), omogenei per età ed entità del vizio rifrattivo dei soggetti. Entrambi i gruppi erano composti da 16 pazienti (16 occhi) con i seguenti vizi di rifrazione: 13 pazienti con miopia e 3 con ipermetropia. Si è poi proceduto alla somministrazione ai pazienti del Gruppo 1 di L-cisteina per os, con dose giornaliera di 200 mg, in forma di capsule da 100 mg da assumere due volte al dì, per una durata complessiva di 14 giorni a partire dalla settimana precedente l intervento; i pazienti del Gruppo 2, cui non è stata somministrata la supplementazione orale di tale aminoacido, sono stati utilizzati come controllo. La procedura fotoablativa è stata condotta come di seguito riportato: previa instillazione di collirio anestetico ed applicazione di un divaricatore palpebrale si è proceduto alla rimozione meccanica dello strato più superficiale di epitelio corneale. E stata quindi condotta la fotoablazione di un area centrale di diametro di 6 mm e di profondità proporzionale all entità del vizio di refrazione negli occhi con miopia e di un area periferica, con zona ottica fissa di 5 mm, negli occhi con ipermetropia; al termine dell intervento è stata posizionata negli occhi trattati una lente a contatto terapeutica per ridurre la sintomatologia algica (Sky soft mensile). Si sono quindi prescritti ai pazienti trattati un collirio con associazione di antibiotico (tobramicina 3 mg) e corticosteroide (desametasone 1mg), con posologia di 4 volte al dì e un FANS topico (diclofenac) da utilizzare al bisogno, in presenza di elevata reazione algica corneale, con analoga posologia (4 volte al dì). L evoluzione del processo di riepitelizzazione corneale nei 2 gruppi di pazienti sottoposti a PRK è stata seguita attraverso la valutazione di due parametri: il diametro orizzontale del difetto epiteliale prodotto dall azione del laser e lo spessore dell epitelio neoformato. I pazienti appartenenti ai 2 gruppi sono stati monitorati giornalmente, a partire dalle 24 ore successive l intervento, per la durata di una settimana e comunque fino a riepitelizzazione corneale avvenuta, per la misurazione, effettuata mediante biomicroscopia con lampada a fessura, previa instillazione di fluoresceina, del diametro orizzontale dell area disepitelizzata. I soggetti sono stati successivamente sottoposti a controlli, compiuti a 1, 2, 3, 4 settimane dall intervento, per la valutazione dello spessore dell epitelio corneale neoformato, misurazione realizzata tramite microscopia confocale. In particolare ci si è avvalsi della possibilità, offerta da tale metodica diagnostica, di caratterizzare, durante ogni scansione antero-posteriore della cornea, ciascuna immagine in base alla sua posizione sull asse z (profondità) e in base alla sua reflettività intrinseca. Ciò consente di ottenere, per ogni singolo strato analizzato, un grafico (grafico Z-scan), in cui vengono riportate le coordinate di profondità e spessore corneale (sull asse x), unitamente al livello di reflettività intrinseco (sull asse y) e da questo, pertanto, derivare il valore dello spessore corneale parziale oggetto di studio. Al termine dei controlli, si sono quindi comparati i valori del diametro del difetto epiteliale e dello spessore dell epitelio neoformato osservati negli occhi dei pazienti trattati con cisteina ai valori osservati negli occhi dei pazienti del gruppo di controllo. RISULTATI In tutti i controlli effettuati durante il periodo di monitoraggio, sia per le misurazioni del diametro del difetto epiteliale, sia per le misurazioni dello spessore dell epitelio neoformato, gli occhi dei pazienti cui è stata somministrata la supplementazione orale di cisteina (Gruppo 1) hanno mostrato un tempo di riepitelizzazione corneale inferiore rispetto agli occhi dei pazienti del gruppo di controllo (Gruppo 2). I valori riportati nella tabella sottostante (Tabella N. 1), fanno riferimento alle misurazioni del diametro (in mm) del difetto epiteliale condotte giornalmente per la durata di una settimana a partire dalle 24 ore successive all intervento ed effettuate tramite biomicroscopia, previa instillazione di fluoresceina.

4 DIAMETRO MEDIO DIFETTO EPITELIALE GRUPPO 1 GRUPPO 2 GIORNO ± ±0.28 GIORNO ± ±0.31 GIORNO ± ±0.25 GIORNO ± ±0.28 GIORNO ±0.27 GIORNO ±0.17 GIORNO Tabella 1: Diametro medio del difetto dell epitelio corneale nei pazienti dei 2 gruppi. Al 4 giorno 7 pazienti del Gruppo 1 (pari al 44%) hanno presentato una completa riepitelizzazione corneale. Al 5 giorno tutti gli occhi sottoposti a PRK dei 16 pazienti del Gruppo 1 (100%) sono risultati completamente riepitelizzati. Al 7 giorno tutti i 16 pazienti del Gruppo 2 (100%) hanno mostrato una riepitelizzazione corneale completa. La presenza di una Deviazione Standard (DS) più ampia nel gruppo di soggetti trattati con cisteina (Gruppo 1) rispetto ai pazienti del gruppo di controllo (Gruppo 2) evidenzia come vi siano stati nel Gruppo 1, accanto a pazienti con un ottima risposta alla supplementazione orale di cisteina, altri con una risposta di minor rilevanza. Nel complesso, la media del tempo di riepitelizzazione corneale osservata negli occhi dei pazienti del Gruppo 1 è risultata pari a 102±15 ore, contro una media di 159±9 ore riscontrata nei pazienti del Gruppo 2 di controllo. I valori dello spessore dell epitelio corneale di seguito riportati si riferiscono alle misurazioni effettuate, tramite microscopia confocale, durante la visita preoperatoria e alla 1, 2, 3, 4 settimana successive all intervento di cheratectomia fotoablativa. Il valore medio dello spessore dell epitelio corneale riscontrato alla visita preliminare nei pazienti oggetto di studio è risultato pari a 51±5 µm (51±4 µm nel Gruppo 1 e 52±4 µm nel il Gruppo 2). Alla 1 settimana il valore dello spessore dell epitelio neoformato è risultato: 29±4 µm nei pazienti del Gruppo 1 e 22±3 µm nei pazienti di controllo. Alla 2 settimana: 37±5 µm nel Gruppo 1 e 29±2 µm nel Gruppo 2. Alla 3 settimana: 45±4 _m nel Gruppo 1 e 35±4 _m nel Gruppo 2. Alla 4 settimana: 50±5 _m nel Gruppo 1 e 43±3 µm nel Gruppo 2. Durante tutti i controlli effettuati tramite microscopia confocale, i pazienti del Gruppo 1 trattati con cisteina hanno mostrato uno spessore di epitelio corneale neoformato superiore rispetto ai pazienti di controllo. Alla 4 settimana il valore medio dello spessore dell epitelio corneale osservato nei pazienti del Gruppo 1, di 7 µm superiore rispetto ai pazienti del Gruppo 2, è risultato equivalente al valore medio riscontrato negli stessi pazienti durante la visita preoperatoria. La seguente figura (Figura N. 2) mostra l andamento della crescita dello spessore epiteliale (in µm) osservato nei 2 gruppi di pazienti tramite microscopia confocale, durante i controlli effettuati alla 1, 2, 3,4 settimana a partire dall intervento. 69 Figura 1: Incremento spessore dell'epitelio corneale nei 2 gruppi di pazienti In tutti i controlli effettuati, nessun paziente ha mostrato effetti indesiderati a livello sistemico o a livello oculare.

5 MOLECOLE IMPIEGATE La cisteina è un aminoacido non essenziale, appartenente al gruppo dei glucogenetici, che nell organismo si forma a partire dalla metionina (aminoacido essenziale) e dalla serina (aminoacido non essenziale). Figura 2: formula di struttura della cisteina. 70 Dotata di un gruppo sulfidrilico (vedi Figura N. 2), la cisteina viene utilizzata, insieme a glutammato e glicina, nella sintesi del glutatione, tripeptide dal basso PM presente in tutte le cellule, spesso in concentrazioni elevate, ove costituisce uno dei principali sistemi antiossidanti intracellulari, fungendo da riserva di equivalenti riducenti. Tali equivalenti riducenti possono essere utilizzati per rimuovere radicali ossidanti e perossidi tossici che si formano durante il metabolismo cellulare in condizioni aerobiche e in quantità maggiore nel corso di eventi infiammatori, secondo la reazione: 2GSH + R-OOH _ GSSG + R-OH + H2O Il gruppo sulfidrilico della cisteina, contenuta nel glutatione, è, infatti, un potente nucleofilo in grado di intercettare i substrati elettrofili dei radicali ossidanti. La reazione sopra riportata è catalizzata dal glutatione perossidasi, enzima che si forma dalla combinazione del glutatione con un atomo di selenio legato covalentemente in forma di selenocisteina, e che rappresenta il principale componente del sistema antiossidante corneale. Radicali ossidanti, con particolare riferimento al perossido di idrogeno (H2O2), fisiologicamente presenti a livello corneale, possono subire un notevole incremento della loro concentrazione allorquando in tale sede (cornea) si vengono ad instaurare determinate condizioni (stati infiammatori) favorite dall esposizione ad agenti biologici, chimici e fisici (ivi comprese anche le radiazioni ultraviolette usate nella PRK). In tali circostanze le specie reattive dell ossigeno agirebbero, come dimostrato dai numerosi studi sull argomento, inducendo una serie di alterazioni dapprima funzionali e quindi strutturali a carico delle cellule dell epitelio e dello stroma corneale, con incremento dei processi apoptosici di cheratociti e fibroblasti stromali. Tali danni tissutali risultano essere una conseguenza delle reazioni di perossidazione indotte dalle sopracitate specie radicaliche a carico delle principali molecole biologiche: lipidi di membrana, proteine enzimatiche e strutturali ed acidi nucleici. L ingente liberazione a livello corneale di perossido di idrogeno e degli altri radicali ossidanti nel periodo immediatamente successivo alla fotoablazione laser prodotta dalla PRK, come conseguenza della massiccia infiltrazione di leucociti polimorfonucleati a livello dello stroma corneale, unitamente al contemporaneo decremento dell attività dell enzima glutatione perossidasi, come da diversi studi dimostrato, appaiono strettamente implicati in alcune delle complicanze insorgenti nel postoperatorio, contribuendo inoltre a ritardare il processo di riepitelizzazione corneale. D altra parte eventi infiammatori e/o infettivi intercorrenti nell immediato postoperatorio, possono a loro volta agire inducendo un ingente liberazione a livello corneale di specie reattive dell ossigeno, instaurando un circolo vizioso in grado di automantenersi e rinforzarsi. L importante funzione svolta dalla cisteina nella sintesi di glutatione e nel fornire il gruppo sulfidrilico per le reazioni di inattivazione dei radicali ossidanti, ne evidenzia un possibile ruolo nella prevenzione delle complicanze post PRK e nel favorire una normale riepitelizzazione corneale. Recenti studi hanno inoltre evidenziato un ulteriore possibile meccanismo d azione della cisteina nelle riparazione delle lesioni corneali. E stato osservato come la fotoablazione laser sia seguita da un notevole incremento nella produzione a livello corneale di metalloproteinasi (MMP, in particolare MMP-3, -8, -9), valutata attraverso misurazione delle concentrazioni nel film lacrimale. Tali enzimi rappresentano una famiglia di endopeptidasi zinco dipendenti, capaci nel loro insieme di degradare, a livello corneale come anche a livello di altri tessuti, i diversi componenti della sostanza intercellulare stromale. Sintetizzate da fibroblasti, cheratociti e, in presenza di uno stato infiammatorio, anche da fagociti attivati, eosinofili, mastociti e neutrofili sottoforma di pro-enzimi inattivi, vengono successivamente attivate mediante la rimozione, catalizzata da altre MMP, di un residuo di cisteina che, interagendo con l atomo di zinco catalitico, provvede a mantenere l enzima nello stato di latenza. Tali enzimi, fisiologicamente implicati nel rimodellamento della matrice extracellulare, attraverso la degradazione del collagene e di altri costituenti, se sovraespressi, come in corso di processi infiammatori, possono interferire col processo di riparazione tissuta-

6 le, ritardandone la guarigione. Si è osservato come la cisteina possa esercitare una specifica inibizione nei confronti dell attività collagenasica delle MMP presenti a livello corneale, sia riducendo i legami di tali enzimi, sia sequestrando gli ioni calcio e zinco, cofattori indispensabili dell attività collagenasica delle MMP. Un ultima importante funzione della cisteina nel processo di riparazione tissutale è stata desunta da alcuni recenti studi condotti sulle metallotioneine, una famiglia di proteine a basso PM, espresse a livello corneale e in altri tessuti in concomitanza di eventi lesivi, e contenenti nella sequenza aminoacidica cisteina in una percentuale anche superiore al 30%. Tali molecole sono prodotte in notevole quantità in corrispondenza dei margini della lesione e, a tale livello, nelle zone ad alta attività mitotica, evidenziandone un possibile ruolo nel promuovere il processo di proliferazione cellulare e di riepitelizzazione. Studi in vitro hanno dimostrato come l espressione del gene che codifica le metallotioneine vada incontro ad una up-regulation in seguito ad aggiunta di cisteina, rivelando un ulteriore possibile meccanismo alla base dell attività riepitelizzante di tale aminoacido. CONCLUSIONI La cisteina, somministrata per via orale con dose giornaliera di 200 mg, si è dimostrata efficace nel ridurre il tempo di riepitelizzazione corneale dopo intervento di cheratectomia fotorefrattiva e nel favorire, a 4 settimane da tale intervento, il ritorno dello spessore epiteliale ai valori riscontrati durante la visita preoperatoria, senza indurre la comparsa di alterazioni significative a livello sistemico o a livello oculare. BIBLIOGRAFIA 1) Vinciguerra P, Camesasca FI, Ponzin D: Use of amino acids in refractive surgery. 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