Il metodo scientifico nella ricerca in campo fisiologico. Utilizzo di modelli sperimentali in campo fisiologico

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1 Il metodo scientifico nella ricerca in campo fisiologico Utilizzo di modelli sperimentali in campo fisiologico Livelli di organizzazione biologica studiati dalla fisiologia Tecniche di indagine: tecniche elettrofisiologiche tecniche fluorimetriche tecniche di biologia molecolare

2 Il metodo scientifico nella ricerca in campo fisiologico Il percorso della ricerca sperimentale Osservazione Ipotesi Esperimento Conclusione Teoria l applicazione del metodo scientifico inizia da una serie di osservazioni di un fenomeno L osservazione porta lo sperimentatore a formulare un ipotesi, ossia una supposizione logica su come il fenomeno si verifichi L ipotesi viene verificata progettando un esperimento in cui il ricercatore realizza condizioni accuratamente controllate per riprodurre deliberatamente il fenomeno osservato. Dai risultati ottenuti bisogna poi trarre una conclusione che accetta o respinge l ipotesi originale. Quando l ipotesi è sostenuta da dati raccolti in molteplici occasioni, può diventare una teoria scientifica.

3 Esempio: esperimento per dimostrare che la luce ultravioletta provoca la cataratta. Il gruppo di animali sperimentali viene esposto alla luce ultravioletta per un certo periodo (+UV) mentre il gruppo di controllo è esposto ad una luce dalla quale sono filtrati i raggi ultravioletti (-UV). Tutte le altre condizioni sono identiche per entrambi i gruppi animali (da Rhoades e Pflanzer, 1998) +UV -UV N.B. Una caratteristica fondamentale di ogni esperimento è la presenza di un gruppo di controllo. Il gruppo di controllo è generalmente un duplicato del gruppo sperimentale in ogni suo aspetto eccetto che per la variabile studiata. Dai dati ottenuti si trae una conclusione che accetta o respinge l ipotesi originale. La sperimentazione viene poi ripetuta nella fase di replicazione, per garantire che i risultati ottenuti non siano stati occasionali.

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5 Utilizzo di modelli sperimentali in campo fisiologico I sistemi viventi sono estremamente complessi. Per comprenderne il funzionamento il fisiologo tende a semplificare il sistema sul quale vuole sperimentare. Un grosso aiuto in tal senso deriva allo sperimentatore dall utilizzo di modelli sperimentali, ossia cellule, tessuti o interi organismi estensivamente studiati per comprendere particolari processi fisiologici, in base al presupposto che le acquisizioni fatte sul modello possano fornire indicazioni utili per la comprensione dello stesso processo in altri organismi. Ciò è reso possibile grazie al fatto che i principi fisiologici fondamentali si mantengono nel corso dell evoluzione. Modello sperimentale Un sistema biologico che per le sue peculiari caratteristiche permette di studiare in maniera esemplificata e rappresentativa un determinato fenomeno fisiologico Es. L assone gigante di calamaro (1mm di diametro) ha rappresentato un ottimo modello sperimentale per la comprensione dei meccanismi attraverso cui si genera il potenziale d azione.

6 Il metodo scientifico nella ricerca in campo fisiologico Utilizzo di modelli sperimentali in campo fisiologico Livelli di organizzazione biologica studiati dalla fisiologia Tecniche di indagine: tecniche elettrofisiologiche tecniche fluorimetriche tecniche di biologia molecolare

7 Livelli di organizzazione biologica studiati dalla fisiologia Le Tecniche utilizzate dipendono dal livello di organizzazione biologica che si considera e da ciò che si vuole indagare

8 La scelta del particolare sistema biologico dipende dal tipo di informazioni che si vogliono ottenere

9 Nel progettare un esperimento la prima e più importante decisione che il fisiologo deve prendere è quella di definire a quale livello di organizzazione un dato problema fisiologico deve essere affrontato. La scelta del livello determina poi la metodologia più appropriata per misurare le variabili sperimentali prescelte. Tecniche sempre più sofisticate hanno permesso di affrontare i problemi fisiologici estendendo la sperimentazione dall animale intero, fino ai livelli cellulare e molecolare. Dall integrazione di tutti i livelli di analisi scaturisce quindi la comprensione della fisiologia di un organismo Studio a livello subcellulare Studio a livello cellulare Studio su tessuto isolato Dosaggi su liquidi fisiologici Studio su organi e sistemi d organo isolati

10 A livello subcellulare molte sono le tecniche utilizzate: -Tecniche Biochimiche - Tecniche di Ingegneria genetica - Uso di molecole marcate con radioisotopi o con anticorpi monoclonali Studio a livello subcellulare Studio di singoli componenti cellulari come organuli cellulari, porzioni di membrane cellulari, proteine, ecc. In questi casi si perde l integrità cellulare (sistemi cell-free) e il componente cellulare oggetto di studio viene analizzato in un sistema artificiale in vitro in cui è possibile controllare e modificare la natura chimica del mezzo che lo circonda. Ciò consente di caratterizzarne le proprietà funzionali eliminando molte variabili incognite.

11 Studio a livello cellulare Uno dei principali obiettivi della ricerca sperimentale in campo fisiologico è quello di comprendere le funzioni cellulari. Dal funzionamento delle singole cellule e dai processi di comunicazione intercellulare si può comprendere come le cellule formino i tessuti e come questi sostengano le funzioni degli organi. Lo studio fisiologico a livello cellulare permette di studiare componenti e funzioni cellulari non in un sistema artificiale, ma nella cellula vitale. L analisi fisiologica a livello cellulare viene condotta facendo ricorso a svariate tecniche. Tra le più utilizzate tecniche di studio in campo fisiologico a livello cellulare: - registrazioni con microelettrodi - microscopia - colture cellulari

12 - colture cellulari Con il termine di colture cellulari si intende la tecnica di coltivazione delle cellule in vitro. Attualmente la procedura più comune consiste nel disgregare piccoli pezzi di tessuto e risospendere poi le cellule dissociate in un opportuno terreno nutritivo nel quale esse si accrescono e si dividono come entità separate. Trattamento con collagenasi che dissolve la matrice entro cui sono immerse le cellule organo frammenti di organo cellule in coltura Si definiscono linee cellulari popolazioni omogenee di cellule in coltura immortalizzate. Quantunque le linee cellulari differiscano per alcuni aspetti dalle cellule normali di partenza esse rappresentano un utile modello sperimentale e hanno permesso di effettuare molti studi impossibili da realizzare ricorrendo alle colture primarie delle cellule normali.

13 Studio su tessuti isolati Lo studio su tessuto isolato permette di studiare le funzioni biologiche in un sistema cellulare integrato come un tessuto. Questo tipo di approccio è particolarmente utilizzato per lo studio funzionale degli epiteli. Lato mucosale Lato serosale soluzione fisiologica ben ossigenata soluzione fisiologica ben ossigenata Camerette di Ussing tessuto - misure elettrofisiologiche transepiteliali (misura della corrente di cortocircuito, del potenziale transepiteliale, della resistenza transepiteliale) - misura dei flussi transepiteliali di molecole (es. mediante l uso di molecole marcate con isotopi radioattivi) L utilizzo di traccianti radioattivi, ha permesso di conoscere gli spostamenti delle molecole all interno delle cellule o tra le cellule, facendo luce su molteplici processi fisiologici.

14 Studio su organi e sistemi d organo isolati In tutti gli animali l attività degli organi e apparati è coordinata e regolata affinchè l animale possa mantenere l omeostasi. Si tratta di studi condotti su organi isolati, rimossi dall animale e tenuti in un ambiente artificiale in vitro. Sono particolarmente utili per comprendere i meccanismi di controllo fisiologico (essenzialmente nervoso ed endocrino) di organi e apparati, argomento che sarebbe difficile se non impossibile da studiare sugli organi intatti in situ. Utilizzando un cuore isolato, perfuso con soluzione salina, è possibile misurare l effetto della stimolazione chimica da farmaci e ormoni, o della stimolazione elettrica dei nervi sulla frequenza cardiaca, gettata cardiaca. Gli esperimenti condotti su cuori isolati hanno permesso quindi, di approfondire le conoscenze sul sistema cardiovascolare.

15 Dosaggi su liquidi fisiologici L utilizzo di determinati parametri dei liquidi biologici (come sangue, urina) come indicatori dello stato di salute dell organismo stesso e, quindi, come strumenti diagnostici è una pratica che trova ampia applicazione in campo clinico. Le tecniche analitiche utilizzate in tal caso sono diverse quali la spettrofotometria, la cromatografia, l elettroforesi

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17 Tecniche di indagine: tecniche elettrofisiologiche Tecnica dei microelettrodi Tecnica della cortocircuitazione Tecnica del patch-clamp Tecnica del voltage-clamp

18 MICROSCOPIA La funzione cellulare dipende dalla struttura cellulare La Fisiologia è governata da forti relazioni struttura - funzione La microscopia ottica usa i fotoni della luce visibile per illuminare le preparazioni cellulari, con una risoluzione di pochi micrometri. La marcatura con reagenti fluorescenti ha permesso di elevare la sensibilità di visualizzazione. I traccianti molecolari fluorescenti assorbono la luce ad una data lunghezza d onda e la emettono ad una lunghezza d onda più elevata Tra le tecniche di Microscopia a Fluorescenza più utilizzate, vi è la Microscopia ad Immunofluorescenza in cui i campioni da analizzare sono trattati con anticorpi monoclonali o policlonali marcati con sostanze fluorescenti ed ancora, la misura di ioni intracellulari attraverso l uso di coloranti fluorescenti per essi

19 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Fluorescenza: proprietà di alcune sostanze di riemettere a frequenza più bassa le radiazioni assorbite Il marcaggio con reagenti fluorescenti, ha permesso di elevare la sensibilità di visualizzazione. Quando un campione trattato con una sostanza fluorescente viene osservato con un microscopio a fluorescenza, sono visibili solo quelle cellule o quei costituenti cellulari a cui si è legata la sostanza. Step 1: Quando un fluoroforo (una sostanza in grado di produrre il fenomeno della fluorescenza) assorbe un fotone di energia hn ex passa dal livello fondamentale S 0 ad un livello elettronico eccitato S 1 (detto singoletto). Step 2: Lo stato eccitato permane per un breve lasso di tempo (1-10 x 10-9 sec), durante il quale dissipa parte dell energia assorbita a causa di moti vibrazionali, passando ad uno stato eccitato S 1 (detto singoletto rilassato) a energia lievemente inferiore rispetto a S 1.

20 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Fluorescenza E ex E em Step 3: il fluoroforo ritorna al livello fondamentale So in seguito ad emissione di un fotone di energia hν. A causa della parziale dissipazione di energia durante lo stato eccitato, l energia del fotone emesso è minore rispetto a quella del fotone assorbito, pertanto la lunghezza d onda di emissione è maggiore rispetto a quella di eccitazione.

21 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Principio della microscopia a fluorescenza Lo spostamento nello spettro visibile dei due processi, quello di eccitazione e quello di emissione, permette con l uso di particolari filtri di separare completamente la luce adoperata per l eccitazione dal segnale di fluorescenza. Pertanto è possibile rilevare il segnale di fluorescenza direttamente dal campione in quanto esso può essere isolato dai fotoni di eccitazione. Se il campione non manifesta fluorescenza endogena, sarà sufficiente iniettare nel campione alcune speciali molecole fluorescenti che nella cellula, o nel tessuto investigato si comporteranno come lucette microscopiche. Un campione marcato con una sostanza fluorescente, fluoresceina viene illuminato con intensa luce blu. Se il campione viene osservato attraverso un filtro di sbarramento, la luce blu d'eccitazione non è più visibile. E' invece chiaramente visibile sul campione la luce verde della fluorescenza.

22 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Miscoscopia a fluorescenza Schema del percorso ottico in un microscopio a fluorescenza Specchio dicroico Elemento chiave di un microscopio a fluorescenza. Permette di separare la luce di eccitazione da quella di emissione. Esso, infatti, è in grado di riflettere la luce al di sotto di una certa lunghezza d onda (lunghezza di taglio) e di essere trasparente alla luce con lunghezze d onda superiori. La luce di eccitazione viene, quindi, riflessa verso il preparato, ma solo la luce emessa dal fluoroforo raggiunge gli oculari del microscopio.

23 Tra le tecniche di microscopia a fluorescenza più utilizzate La microscopia ad immunofluorescenza in cui i campioni da analizzare vengono trattati con anticorpi monoclonali o policlonali marcati con sostanze fluorescenti La misura di ioni intracellulari ad es. Ca 2+ attraverso l uso di coloranti fluorescenti per essi Immunofluorescenza UTILIZZO DI ANTICORPI MARCATI CON UNA SOSTANZA FLUORESCENTE TRATTAMENTO DELLE SEZIONI ISTOLOGICHE CON GLI ANTICORPI MARCATI OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA METODO DIRETTO La sostanza fluorescente è legata direttamente all anticorpo prodotto contro l antigene cercato. METODO INDIRETTO Anticorpo primario che riconosce l antigene cercato. Anticorpo secondario, a cui è legata la sostanza fluorescente, che riconosce l anticoro primario

24 Ingrandimento 100X Enterociti in sezione longitudinale ALTEZZA LARGHEZZA Altezza : distanza dalla lamina basale al brush border Larghezza : distanza tra le membrane basolaterali Enterociti in sezione trasversale Piano di taglio è parallelo all asse longitudinale delle cripte Colorazione del citoscheletro di actina con rodamina- falloidina di epitelio intestinale di anguilla. L osservazione è stata effettuata mediante microscopia confocale a fluorescenza obiettivo 100X Immunolocalizzazione di BK in epitelio intestinale di anguilla. 10 μm sezione trasversale della porzione apicale di un villo intestinale. La sezione è stata incubata con l anticorpo monoclonale rabbit anti- BK Ca and Alexa fluor 488 goat antirabbit IgG (come anticorpo secondario) e visualizzata utilizzando il microscopio confocale a fluorescenza con obiettivo 100X.

25 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Indicatori fluorescenti della concentrazione intracellulare di calcio: Fluo-3 e Fura-2 Fluo-3 Spettri di emissione del FLUO-3 ottenuti eccitando alla lunghezza d onda di 488 nm e in presenza di diverse concentrazioni di Ca 2+ libero

26 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Indicatori fluorescenti della concentrazione intracellulare di calcio: Fluo-3 e Fura-2 Fura-2 eeeee Il FURA-2 è la sonda più utilizzata per monitorare cambiamenti dinamici della concentrazione di Ca 2+ libero nelle cellule vive. Manifesta particolari caratteristiche spettrali poiché il suo spettro di eccitazione cambia in seguito al legame con il calcio. Presenta la singolare caratteristica di subire uno spostamento dello spettro di assorbimento in funzione della [Ca 2+ ] libero. In seguito al legame con il calcio il picco di eccitazione si sposta da 380 nm (forma non legata) a 340 nm (forma legata). Dal momento che la forma libera e la forma legata hanno diversi spettri di eccitazione, le misure di intensità di fluorescenza possono essere effettuate a due differenti lunghezze d onda 380nm e 340nm, Per il calcolo della concentrazione viene utilizzato il rapporto delle intensità di fluorescenza. La variazione dell intensità di luce emessa è direttamente proporzionale alla concentrazione di calcio quando l eccitazione è a 340 nm, mentre è inversamente proporzionale alla [Ca 2+ ] quando si eccita a 380 nm

27 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Indicatori fluorescenti della concentrazione intracellulare di calcio: Fluo-3 e Fura-2 Fura-2 Ne consegue che eccitando alternativamente alle lunghezze d onda di 340 nm e 380 nm si raccoglie una coppia di segnali alla lunghezza d onda di emissione di 510 nm per ogni punto sperimentale. Effettuando il rapporto dei due valori è possibile, quindi, ottenere una misura che è indipendente dalla concentrazione dell indicatore nel campione.

28 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Miscoscopia confocale La microscopia confocale si è imposta negli ultimi anni come la più avanzata tecnica d indagine microscopica grazie ai vantaggi offerti nello studio delle dinamiche cellulari e delle strutture sub-cellulari: -risoluzione ottica superiore -acquisizione e visualizzazione d immagini in 3D

29 Tecniche di indagine: tecniche fluorimetriche Miscoscopia confocale La microscopia confocale consiste essenzialmente nell illuminare non tutto il campione ma solo il piano focale che si sta osservando e nel raccogliere la luce solo dal medesimo. L immagine risultante vene quindi depurata dalle componenti fuori fuoco con conseguente aumento della risoluzione.

30 Miscoscopia confocale Specchio dicroico Obiettivo 1) Nel microscopio confocale la luce di un laser (sorgente di eccitazione), riflessa dallo specchio dicroico, viene fatta convergere dalle lenti dell'obiettivo in un punto estremamente piccolo del campione osservato. Il fuoco dell obiettivo è contemporaneamente sia quello della luce di eccitazione, sia quello da cui viene rilevato il segnale di fluorescenza.

31 Miscoscopia confocale Specchio dicroico Obiettivo 2) Le caratteristiche della luce laser (alta intensità e lunghezza d'onda unica) consentono di evitare fenomeni di aberrazioni e diffrazioni tipiche invece della luce prodotta da tradizionali lampade a incandescenza. Inoltre, le lenti dell'obbiettivo fanno sì che l'intensità della luce laser sia sufficiente a eccitare i fluorocromi soltanto nel punto di massima concentrazione del raggio, corrispondente al piano di messa a fuoco dell'obbiettivo. In questo modo le aree superiori ed inferiori al piano di fuoco, non venendo eccitate, non contribuiscono alla formazione dell'immagine, limitando la formazione di aloni e riducendo il 'rumore di fondo'

32 Miscoscopia confocale Specchio dicroico Obiettivo 3) La luce emessa dai fluorocromi presenti nel campione viene catturata dalle lenti dell'obbiettivo e inviata dallo specchio dicroico (che separerà definitivamente i due segnali) su un fotomoltiplicatore, che trasforma l'intensità luminosa rilevata in un segnale elettrico di intensità proporzionale 4) Tra lo specchio dicroico e il fotomoltiplicatore, il fascio luminoso attraversa un diaframma (o pinhole), che impedisce alla luce proveniente dalle zone fuori fuoco (che, seppure in minima parte vengono illuminate per effetto di fenomeni di rifrazione all'interno del campione) di raggiungere il fotomoltiplicatore. In questo modo solo il segnale luminoso relativo dal piano di fuoco viene registrato e utilizzato nella formazione dell'immagine finale.

33 Miscoscopia confocale Il punto focale stesso, attraverso un sistema di specchi oscillanti, viene spostato attraverso tutto il campo visivo dell'obbiettivo così da effettuare una scansione completa di tutto il piano focale lungo l asse X e Y. Gli specchi oscillanti sono sotto controllo computerizzato. In questo modo il campione viene sottoposto a scansione.

34 Miscoscopia confocale computer Il segnale elettrico in uscita dal fotomoltiplicatore viene quindi digitalizzato e inviato ad un computer che registra i valori di intensità misurati per ogni punto. Questi valori vengono utilizzati per ricostruire l'immagine: ogni punto del campione verrà cioè a corrispondere ad un pixel dello schermo, e l'intensità luminosa del punto verrà rappresentata da una corrispondente tonalità di grigio. L'accostamento di tutti i singoli pixel corrispondenti ai punti scanditi dal fascio laser nel campione darà così l'immagine finale.

35 Miscoscopia confocale Spostando lungo l'asse verticale il campione dopo ogni scansione, è possibile eseguire serie di scansioni successive corrispondenti a piani focali via via più profondi all'interno del campione. Queste scansioni prendono il nome di sezioni ottiche e la loro sovrapposizione ordinata, eseguita via software, consente di ricostruire un'immagine complessiva dell'intero volume scandito, in cui tutti i piani sono contemporaneamente a fuoco.

36 MICROSCOPIA ELETTRONICA Immagine di cellule al microscopio elettronico a scansione SEM Immagine di Virus al microscopio elettronico Nella microscopia elettronica il campione viene investito da un fascio di elettroni fortemente accelerati piuttosto che dalla luce visibile. Poiché la lunghezza d onda dei raggi elettronici è molto più corta di quella della luce visibile i microscopi elettronici forniscono una migliore risoluzione. Infatti, i moderni micrioscopi elettronici a trasmissione hanno tipicamente una risoluzione di 0.5 nm (5 angstroms). Mentre i microscopi ottici hanno una risoluzione che non va oltre i 1000 nm (1 micrometro).