FUSARIOSI DELLA SPIGA (FHB) e MICOTOSSINE

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1 IL MONITORAGGIO DELLE PRODUZIONI NAZIONALI Bologna, 3 Settembre FUSARIOSI DELLA SPIGA (FHB) e MICOTOSSINE FHB è una malattia causata da diverse specie fungine appartenenti al genere Fusarium e Microdochium Contaminazione da tossine di Fusarium (, T- e HT-) nel grano duro nazionale Michelangelo Pascale Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR) Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA) - Bari Colpisce frumento, orzo, segale, triticale, mais, sorgo Condizioni ideali per l insorgenza della malattia: andamenti climatici piovosi e/o caldo umidi, in coincidenza con le fasi fenologiche comprese tra la spigatura e la maturazione latteo-cerosa FHB sta ricevendo particolare attenzione in Italia negli ultimi anni per le conseguenze che la malattia può avere su: resa in granella qualità della granella contaminazione delle cariossidi con micotossine (di Fusarium) SPECIE FUNGINE ASSOCIATE ALLA FUSARIOSI DELLA SPIGA Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 3 TRICOTECENI - Prodotti a rischio contaminazione Fusarium graminearum (, Ac, NIV, FUS, ZEN) F. culmorum (, Ac, NIV, ZEN, Z) F. avenaceum (MON, BEA, enniatine) F. poae (DAS, NIV, FUS, T-) Microdochium nivale F. cerealis (NIV, FUS, ZEN, Z) F. sporotrichioides (T-, HT-, NEO) F. tricinctum (MON, BEA, ENS) F. acuminatum (T-, NEO, MON, ENS) F. subglutinans (MON, BEA, FUP) F. oxysporum (MON, BEA, ENS) F. equiseti (DAS, ZEN, Z) First Report of Fusarium langsethiae on Durum Wheat Kernels in Italy Infantino et al., Plant Disease, 7, 9, 36 Tricotecene Prodotto contaminato (percentuale di campioni positivi)* Deossinivalenolo mais (89%), frumento (6%) Nivalenolo mais (35%), avena (%), frumento (4%) 3 Acetil- mais (7%), frumento (8%) Tossina T- mais (8%), frumento (%), avena (%) Tossina HT- avena (4%), mais (4%), segale (7%), frumento (%) * campioni analizzati: (57% positivi) NIV 466 (6% positivi) Ac- 37 (8% positivi) T- 349 (% positivi) HT- 33 (4% positivi) Wheat and wheat containing products (like bread and pasta) represent for, NIV, T- toxin and HT- toxin the major source of intake

2 Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 3 Deossinivalenolo - Prodotti a rischio contaminazione Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 3 numero di campioni positivi per nazione 6358 campioni analizzati 6% positivi ( 5 µg/kg) Scientific Cooperation (SCOOP) - Aprile 3 Tossina T- - numero di campioni positivi per nazione Deossinivalenolo (vomitossina, ) T- 45 campioni analizzati 94% positivi ( 8 µg/kg) Metodo di analisi: ELISA 53 campioni frumento e prodotti derivati (-6 µg/kg) O O O DERRATA frumento, mais, orzo, segale, avena, birra FUNGHI PRODUTTORI Fusarium graminearum, F. culmorum EFFETTI TOSSICI vomito rifiuto di cibo ridotto peso corporeo immunosoppressione * * nessun campione analizzato per HT- Dessinivalenolo LIVELLI MASSIMI AMMISSIBILI Regolamenti (CE) 88/6 e (CE) 6/7

3 Regolamento (CE) N. 8/6 e 6/7 Tossine T- e HT- PRODOTTO Cereali non processati diversi da frumento duro, avena e mais Livelli 5 Frumento duro e avena (non processati ) 75 Cereali destinati al consumo umano diretto, farina di cereali, crusca, germe 75 Pasta (secca) 75 Pane (compresi piccoli prodotti da forno), prodotti della pasticceria, biscotteria, merende a base di cereali e cereali da colazione Alimenti a base di cereali trasformati e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini 5 6 H H H3C 9 O 3 3 H 8 6 O (CH3)CHCHOCO (CH 3) CHCH OCO 5 4 CH CH3 OCOCH3 Tossina T- 5 CH 4 CH 3 OCOCH 3 Tossina HT- H OCOCH3 6 H H H 3C 9 O 3 3 H 8 6 O H PRODOTTI A RISCHIO avena, mais, frumento, segale e prodotti derivati FUNGHI PRODUTTORI Fusarium sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae, F. acuminatum EFFETTI TOSSICI orzo, attività immunosoppressiva citotossicità attività dermotossica ed emorragica inibizione della sintesi proteica leucopenia tossico-alimentare (ATA) Rispetto al, la tossicità delle tossine T- e HT- è volte più elevata nel topo e - volte più elevata in linee cellulari (in vitro). REGOLAMENTO (CE) N. 88/6 che definisce i tenori massimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari LIVELLI DI IN FRUMENTO PRODOTTO IN ITALIA (998-4) (analisi HPLC-IMA/DAD, LOD = ppb) Paragrafo 3 Stime sull'assunzione indicano che la presenza delle tossine T- e HT- può essere preoccupante per la salute pubblica. È quindi necessario e altamente prioritario sviluppare un metodo di analisi sensibile e affidabile, raccogliere ulteriori dati sull'occorrenza e svolgere ulteriori maggiori indagini/ricerche sui fattori che incidono sulla presenza delle tossine T- e HT- nei cereali e nei prodotti a base di cereali, in particolare nell'avena e nei prodotti a base di avena. Annata Campioni positivi (%) Frumento tenero Valore medio Valore massimo Campioni positivi (%) Frumento duro Valore medio Valore massimo UE: livelli massimi ammissibili in discussione Totale campioni analizzati 945; : 55; : 68; 999-: 88; -: 9; -: 54; -3: 89; 3-4: 8. Campagna et al., 5 3

4 LIVELLI DI IN FRUMENTO DURO PRODOTTO IN ITALIA aziende e centri di stoccaggio (6-8) Risultati del Progetto MICOCER LIVELLI DI IN FRUMENTO DURO PRODOTTO IN ITALIA rete nazionale (6-8) Risultati del Progetto MICOCER ANNI totale (4%) 86 (57%) 4 (85%) 6 (6%) CENTRO Totale campioni analizzati: SUD-ISOLE 74 (5%) 89 (35%) 8 (9%) 9 (3%) metodo di analisi ELISA, LOD = 8,5 ppb Aureli et al., 9 ANNI cam totale (65%) 3 (97%) 66 (%) 5 (88%) NORD CENTRO SUD-ISOLE cam Totale campioni analizzati: (5%) (7%) 8 (8%) 399 (64%) cam (5%) 73 (57%) 44 (33%) 63 (36%) metodo di analisi ELISA, LOD = 8,5 ppb Aureli et al., 9 HPLC () CORRELAZIONE ELISA/ LISA/HPLC FRUMENTO DURO Risultati del Progetto MICOCER range 8, ELISA () n = 56 y =,6x 68,7 r =,98885 Monitoraggio grano duro nazionale (8 e 9) (metodo di analisi HPLC-IMA/UV, LOD = ppb) 8 9 Numero di campioni analizzati Numero di campioni positivi 99 (73%) 67 (7%) < µg/kg (LOD) 37 (7%) 6 (8%) - 75 µg/kg 7 (5%) 6 (65%) > 75 µg/kg 8 (%) 7 (7%) dei positivi 7 67 Min Max = Nord (5), Centro (3), Sud (53) 9 = Nord (35), Centro (3), Sud (7) Pascale et al., 4

5 Monitoraggio grano duro nazionale (8 e 9) Monitoraggio grano duro nazionale () Laboratorio accreditato SINAL-ACCREDIA ( 975) 8 9 NORD 5 CENTRO 3 SUD e ISOLE 53 < (%) 6 (9%) 44 (83%) (47%) 5 (78%) 8 (5%) > 75 6 (5%) (3%) (%) () < (%) (3%) 6 (59%) (8%) (68%) (4%) > 75 7 (%) (%) (%) () NORD 9 CENTRO 4 < 8 (3%) (5%) 8-75 (76%) (5%) > 75 6 (%) (%) () metodo di analisi HPLC-IMA/UV, LOD = SUD e ISOLE (94%) 4 (6%) (%) 5 metodo di analisi ELISA, LOD = 8 ppb MONITORAGGIO grano duro nazionale - Monitoraggio T-/HT- grano duro nazionale (8 e 9) (metodo di analisi HPLC-IMA/FD, LOD = 5 ppb (T-) e 3 ppb (HT-) + - I livelli di e la frequenza di contaminazione dipendono dall annata agraria Livelli e frequenza di contaminazione di più elevati nei campioni del Nord Italia rispetto a quelli del Sud Italia T- + HT- 8 9 Numero di campioni analizzati Numero di campioni positivi 8 (6%) 54 (58%) < 3 ppb (LOD) 55 (4%) 39 (4%) 3- ppb 77 (57%) 53 (57%) > ppb 4 (3%) (%) dei positivi 7,3 4,8 Min 3 5 Max 8 8 = Nord (5), Centro (3), Sud (53) 9 = Nord (35), Centro (3), Sud (7) Pascale et al., 5

6 7 Monitoraggio T-/HT- grano duro nazionale (8-9) Conferma dei risultati mediante LC-MS/MS (% dei campioni analizzati) Estrazione (con metanolo:acqua + NaCl) 8 9 T- + HT- < 3 3- > () < 3 3- > () Filtrazione (Whatman Nº 4) Diluizione con acqua (:5) Filtrazione (Whatman GF/A) NORD 5 CENTRO 3 SUD e ISOLE (65%) 9 (8%) 3 (4%) 8 (35%) (66%) 38 (7%) (%) (6%) (4%) 3, ,5 3 3, 7 (63%) 9 (9%) 8 (3%) 3 (47%) (68%) 9 (7%) (%) (3%) (%),3 39,5 7,8 Purificazione su colonne ad immunoaffinità (T- Test HPLC, VICAM) LOD = 5 (T-), 3 (HT-) LOD (LC/MS-MS): T- =,5 ; HT- =,7 Determinazione LC-MS/MS Multiple Reaction Monitoring (MRM) mode (cinque ioni monitorati per ogni tossina) Uso di Standard Interno 3 C 4 T toxin e 3 C 4 HT toxin (Biopure, Austria) MONITORAGGIO grano duro nazionale T/HT Correlazione tra il contenuto di e T- + HT- in frumento duro (8) -? Contemporanea presenza di tossina T- e HT-. Livelli di tossina HT- in genere più elevati dei livelli di tossina T-. Livelli di contaminazione trascurabili (piu del 9% dei campioni analizzati erano contaminati a livelli <5 ). T+HT T/HT Livelli di tossine T- e HT- più elevati nei campioni del centrosud Italia rispetto a quelli del Nord Italia (da confermare). 5 3 T+HT campioni S S 3 6

7 ATTIVITÀ MONITORAGGIO pasta nazionale (analisi HPLC-IMA/DAD, LOD = ppb) Distribuzione (%) del nei prodotti e sottoprodotti di molitura del frumento duro e negli spaghetti prima e dopo cottura (n=9)* semola integrale 59 Numero di campioni analizzati 45 9 Numero di campioni positivi 3 (8%) 9 (66%) < ppb (LOD) 3 (%) (34%) -75 ppb 3 (8%) 9 (66%) > 75 ppb (%) (%) (%) scarti di pulitura 44% 37 33** ** dei positivi 57 Min 4 Max 53 4 Frumento non pulito Frumento pulito Spaghetti Crusca Farinetta Semola Spaghetti dopo cottura T-/HT-: tutti i campioni <LOD (<3 ppb T-;<5 ppb HT-) Pascale et al., * Valore medio ± SD (n=9), frumento duro contaminato nell intervallo.3-3. µg/g; ** calcolato sul peso secco. (Visconti et al., 4) Distribuzione (%) della somma delle tossine T- e HT- nelle frazioni di molitura e nella pasta Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera del FRUMENTO DURO 45 4 T- + HT- 95 Scarti di pulitura = 597% 35 T- + HT- (%) grano non grano crusca farinaccio farinette semola pasta pulito pulito * I valori rappresentano la media (±SD) di livelli di contaminazione nell intervallo (esperimenti in quadruplicato). (Pascale et al., ) Modellizzazione di un Sistema Integrato per la gestione della Sicurezza Alimentare della filiera del Frumento duro (SINSIAF) Piano Operativo Nazionale -6 Progetto MIUR 79 7

8 Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera dei cereali Progetti di Ricerca Nazionale per la sicurezza alimentare della filiera del FRUMENTO DURO CRA-QCE, Unità di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali, ROMA Valutazione e controllo della contaminazione da micotossine nelle produzioni cerealicole nazionali (MICOCER) Programma Interregionale Sviluppo rurale, sottoprogramma Innovazione e Ricerca (MIPAAF) Monitoraggio dei livelli di tossina T- e HT- (e di ) nel grano duro nazionale e nella pasta. Studio dell effetto dei processi di molitura e pastificazione sulla contaminazione da tossina T- e HT- nei prodotti e sottoprodotti derivati del grano duro. Selezione di linee grano duro dotate di resistenza alla fusariosi della spiga. Progetto AGER sulla qualità e sicurezza della filiera del FRUMENTO DURO IL MONITORAGGIO DELLE PRODUZIONI NAZIONALI Bologna, 3 Settembre FROM SEED TO PASTA Filiera di ricerca integrata per la produzione di grano duro di alta qualità Coordinatore: Produttori Sementi di Bologna WP5 - Sicurezza delle materie prime e dei trasformati Metodi Rapidi per la Determinazione di Micotossine in Grano Duro e Prodotti Derivati ISPA-CNR, Bari Grazie per la vostra attenzione! Micotossine Nascoste in Grano Duro e Prodotti Derivati UNI - Parma 8