TT3. ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti T3 totale

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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti T3 totale TT Impiego Per la determinazione quantitativa in vitro della triiodotironina totale (T3) in siero e plasma (EDTA o eparina) umani quale ausilio nella diagnosi differenziale delle patologie tiroidee. Compendio e spiegazione del dosaggio Essenzialmente, la triiodotironina viene trasportata nel siero ad opera della globulina legante tiroxina (TBG), circa il 99,5% di T3 in circolo è legato a proteine 1. La T3 contribuisce in modo significativo al mantenimento dello stato eutiroideo 2, e il livello di T3 totale, unitamente ad altri test, gioca un ruolo preponderante nello screening dei disturbi tiroidei. Da sola, la T3 non è in grado di fornire una diagnosi di ipotiroidismo, mentre può risultare più sensibile della tiroxina (T4) ai fini della diagnosi di ipertiroidismo 3. Si registra una caduta della concentrazione di T3 fino ad un massimo del 50% in numerose situazioni cliniche, comprese malattie acute e croniche 4. I livelli di T3 possono risultare alterati in condizioni in cui e alterata la capacita di legame delle proteine leganti gli ormoni tiroidei, come in gravidanza 3,5, dove il test per l uptake di T3 o T4 è utilizzabile con il risultato di T3 totale ai fini del calcolo dell indice di T3 libera (FT3I) per la valutazione del livello di T3 libera metabolicamente attiva 6. Principi della procedura Il dosaggio T3 totale VITROS viene effettuato con la confezione di reattivi T3 totale e i calibratori T3 totale per prodotti immunodiagnostici VITROS sul sistema VITROS per immunodiagnostica. Viene utilizzata una metodica competitiva che prevede la competizione tra la T3 presente nel campione e la T3 marcata con perossidasi da rafano (HRP), ovvero il coniugato, per un numero limitato di siti di legame su un anticorpo anti-t3 da pecora presente in fase liquida. L effetto legante delle proteine viene eliminato grazie all uso di tampone e agente bloccante idonei. L anti-t3 da pecora viene catturato da un secondo anticorpo anti-pecora da asino sui pozzetti, mentre i materiali non legati vengono rimossi mediante lavaggio. Il coniugato con perossidasi da rafano legato viene misurato mediante reazione luminescente 7. Un reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed un agente di trasferimento di elettroni, viene aggiunto ai pozzetti. La perossidasi da rafano del coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, dando origine a produzione di luce. L agente di trasferimento di elettroni (acetanilide sostituita) provoca un aumento del livello di luce prodotta e ne prolunga l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal Sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato con perossidasi da rafano legato è indirettamente proporzionale alla concentrazione di T3 presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale potenzialmente infettivo I calibratori per T3 VITROS contengono emoderivati provenienti da donatori umani i quali sono stati sottoposti a test individuali usando metodi approvati (immunodosaggio enzimatico) e risultati negativi per quanto concerne la presenza dell antigene di superficie dell epatite B, di anticorpi del virus dell immunodeficienza umana (HIV 1+ 2) e del virus dell epatite C (HCV). Trattati come se capaci di trasmettere l infezione. Si raccomanda di usare la dovuta cautela nel maneggiare i campioni di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, HCV, dell HIV 1+2 o di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es.direttiva M29 del NCCLS 8 ). Versione 2.0 Pubb. n. GEM1010_IT 1

2 TT3 ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti AVVERTENZA: Contiene Kathon Il reagenti contenente del Kathon. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Materiali forniti 1 confezione dei reagenti contenente: 100 pozzetti rivestiti (anti-pecora da asino, lega 400 fmol di IgG di pecora/pozzetto). 11,7 ml di reagente coniugato (HRP-T3, 30 ng/ml) in tampone con agente antimicrobico. 11,7 ml di reagente di dosaggio (anti-t3 da pecora, lega 4,15 pmol T3/mL) in tampone con agente antimicrobico. NOTA: Contiene sieroalbumina bovina. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema VITROS per immunodiagnostica oltre ai seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: Calibratori per T3 Totale (comprese scheda di calibrazione lotti e scheda dei protocolli), reagente di segnale, reagente di lavaggio universale, contenitore per la conservazione delle confezioni di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti Le Confezioni di Reagenti per Prodotti Immunodiagnostici VITROS contengono reagenti liquidi omogenei che non devono essere agitati né mescolati prima di essere caricati sul sistema. Come tutte le soluzioni per dosaggi immunologici a base di proteine, una manipolazione scorretta della confezione di reagente può provocare la formazione di schiuma sulla superficie del reagente stesso. La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti con essiccante. I calibratori per T3 totale VITROS vengono forniti pronti per l uso. Conservare i calibratori in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Dopo l apertura conservare per un massimo di 13 settimane a 2-8 C o di 13 settimane a -20 C (è ammesso un solo ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Si possono usare campioni di siero o plasma (EDTA o eparina). Per la raccolta dei campioni ematici attenersi a procedure standard. I campioni di siero o plasma possono essere conservati fino ad un massimo di 7 giorni a 2-8 C o di 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 9. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con questo dosaggio VITROS. Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. Se le Confezioni di Reagenti VITROS vengono capovolte o agitate, piccole quantità di schiuma sottile possono risultare impossibili da rilevare dal Sistema VITROS. Le Confezioni di Reagenti contenenti una schiuma sottile che non viene rilevata possono mostrare un bias positivo. Se dovete utilizzare una confezione di reagente che è stata capovolta o agitata prima che abbia avuto la possibilità di depositarsi, dovrete verificarne le prestazioni eseguendo campioni in duplicato ai fini del controllo qualità dopo aver caricato la confezione sul sistema. La calibrazione è specifica per i singoli lotti. Le confezioni di reagenti e i calibratori vengono associati in base al numero del lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la medesima calibrazione, che dev essere effettuata con calibratori aventi lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. 2 Pubb. n. GEM1010_IT Versione 2.0

3 ISTRUZIONI PER L USO Procedura TT3 Manipolare i campioni, i calibratori e i controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Dopo l uso, devono essere tempestivamente riportati a 2-8 C. In alternativa è possible utilizzarne un aliquota sufficiente ad una singola determinazione. I calibratori possono essere aliquotati in altri contenitori resi identificabili mediante le etichette con codice a barre fornite nel kit. Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti e che la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sia sufficiente a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio prevede l esecuzione di controlli ai fini della verifica delle prestazioni del dosaggio eseguito. I controlli della tiroide totale VITROS contengono 3 idonei livelli di T3 totale (basso, medio, alto). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente ad una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). Se le procedure di controllo di qualità interne al vostro laboratorio richiedono un uso più frequente dei controlli, è opportuno attenersi alle procedure previste. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è Total T3. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio è TT3. Se necessario è possibile riconfigurare. I risultati possono essere espressi in termini di nmol/l o ng/ml. I risultati di T3 totale e T4 totale generati dal sistema sono utilizzabili per il calcolo automatico del rapporto TT3/TT4 (T3/T4). Analogamente è possibile ricavare l indice FT3 (FT3I) dai risultati di T3 uptake e T3 totale. Queste opzioni sono configurabili nella videata di configurazione degli analiti, nelle opzioni e configurazioni. Procedura Il dosaggio T3 totale VITROS richiede 20 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola, indipendentemente dal volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio T3 totale VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 28 giorni. Il dosaggio per HBsAg VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema VITROS per immunodiagnostica, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema. A questo punto viene visualizzato il pulsante relativo al dosaggio sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti per immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i portacampioni sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi di campionamento vengono effettuate automaticamente. 4. Processare i calibratori analogamente ai campioni. Non è necessario programmare la calibrazione se si usano etichette con codici a barre. Caricare i calibratori nell ordine voluto: la calibrazione parte automaticamente. Risultati Per costruire la curva di calibrazione principale codificata sulla scheda di calibrazione dei lotti si usa una funzione di interpolazione di curva logistica a quattro parametri modificata. Il processo di calibrazione riposiziona la curva di calibrazione principale definendo una curva valida che viene memorizzata per il sistema Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Controllo di qualità I risultati di calibrazione vengono confrontati con un range di parametri di che appaiono in dettaglio nella videata dei parametri di calibrazione alla quale si accede dalle Opzioni e Configurazioni (videata di revisione/calibrazioni utente). Sul rapporto di calibrazione verra evidenziato se i range dei parametri di qualità definiti non vengono rispettati. Per le operazioni da eseguire successivamente ad una calibrazione non andata a buon fine si veda il capitolo 8 della Guida dell Operatore (Revisione dei risultati). I valori dei campioni dei pazienti che non rientrano nell intervallo di riferimento vengono identificati con l indicazione basso o elevato LO o HI. I valori dei controlli vengono evidenziati se 2 DS rispetto alla media di base definita. Versione 2.0 Pubb. n. GEM1010_IT 3

4 TT3 ISTRUZIONI PER L USO Limiti della procedura Non esistono singoli parametri in grado di descrivere completamente la qualità dell interpolazione della curva. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento a valori di controllo ai fini della determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. Gli anticorpi eterofili nei campioni di siero o di plasma possono provocare interferenze negli immunodosaggi 10. Questi anticorpi possono essere presenti nei campioni di sangue provenienti da individui a contatto con animali o che sono stati curati con prodotti derivati da siero animale. I risultati che sono contraddittori con le osservazioni cliniche indicano che sono necessari altri test. In campioni emolizzati (1,90 nmol/l TT3) è stato rilevato un bias medio da 13,2% a 0,310 mmol/l di emoglobina. I campioni contenenti trioleina (33,9 mmol/l) o bilirubina (0,342 mmol/l) influenzano i risultati ottenuti per meno del 10% con questo dosaggio. Non usare campioni torbidi. I metaboliti dei farmaci Diclofenac e Flurbiprofen possono causare dei valori elevati non corretti per questo dosaggio. I risultati ottenuti da pazienti che sono in terapia con questi farmaci dovrebbero essere interpretati con cautela. Gli autoanticorpi degli ormoni tiroidei nei campioni possono causare interferenza con questo dosaggio 11. I risultati incongrui con le osservazioni cliniche indicano che è necessario eseguire dei dosaggi addizionali. Valori attesi Ogni laboratorio dovrebbe confermare la validità degli intervalli di riferimento rispetto alla popolazione afferente. A titolo indicativo, si è calcolato un intervallo di riferimento normale da 1,49 a 2,60 nmol T3/L (2,5-97,5 percentili), con una media di 1,97 nmol/l, da 239 pazienti in stato eutiroideo, non in trattamento tiroideo. Su 95 pazienti ipotiroidei esaminati, il 54% presentava concentrazioni di T3 <1,49 nmol/l. Su 99 pazienti ipertiroidei esaminati, l 86% presentava concentrazioni di T3 >2,60 nmol/l. Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla L intervallo di calibrazione del dosaggio T3 totale VITROS è 0-12 nmol T3/L (ricavabile da calibratori di riferimento interni che sono stati avvalorati mediante un metodo gravimetrico). Le concentrazioni di T3 vengono indicate in nmol/l o ng/ml. Per la conversione tra le unità si usa la seguente formula: Risultato in ng T3/mL = risultato in nmol T3/L x 0,651 Accuratezza Si è ottenuta una correlazione tra il dosaggio T3 totale VITROS e un dosaggio in commercio (X) misurando un pannello di 149 campioni di siero di pazienti appartenenti a diverse categorie cliniche. Il range di campioni utilizzato andava da 0,268-9,49 nmol/l con dosaggio T3 totale VITROS e da 0,27-9,96 nmol/l con il dosaggio in commercio: Dosaggio T3 totale VITROS = 1,01 x X - 0,0162 (nmol/l), con coefficiente di correlazione di 0,992. Precisione La precisione è stata valutata secondo il protocollo EP5-T2 12 del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Sono stati analizzati due replicati, ognuno dei quali costituito da 3 campioni di siero di controllo liofilizzato in due diverse sedute giornaliere per 20 giorni. L esperimento è stato ripetuto con due lotti di reagenti su sistemi diversi. I dati risultanti sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 1: Precisione Concentrazione tipica Giornaliera Intracalibrazione Intralaboratorio nmolt3/l DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 0,718 0,0328 4,6 0,0552 7,7 0,0585 8,2 1,78 0,0266 1,5 0,0811 4,6 0,0809 4,6 4,11 0,0760 1,9 0,199 4,9 0,220 5,3 * Quadratica media Giornaliera: Precisione fra un duplicato e l altro, con media ottenuta su tutte le sedute. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variabilità intra-seduta, fra più sedute e da giorno a giorno. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata una replica e l altra e da un giorno all altro, calcolate nell ambito di una nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. 4 Pubb. n. GEM1010_IT Versione 2.0

5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia TT3 Sensibilità La sensibilità analitica viene definita come la concentrazione di 2 deviazioni standard rispetto alla media di un campione che non contiene analiti, su cui vengono determinati 20 replicati. Tipicamente, la sensibilità del dosaggio T3 totale VITROS è 0,150 nmol/l. Specificità Gli effetti di farmaci e metaboliti sul dosaggio VITROS Total T3 sono stati valutati tramite l aggiunta al campione di controllo contenente una concentrazione nota di TT3 (campo di variazione da 1,87 a 2,31 nmol/l) delle sostanze seguenti. Il bias medio confrontato con un pool di controllo è stato determinato utilizzando due diversi lotti di reagenti. Sostanza Concentrazione Bias = nmol/l o-acido acetilsalicilico (Aspirina) 2,77 mmol/l 1,92 Amiodarone 0,293 mmol/l 0,105 Diclofenac 0,094 mmol/l 0,160 3,5-Diiodotironina (T2) 73,0 pmol/l 0,045 3,5-Diiodo-L-tirosina (DIT) 176 pmol/l -0,010 Difenilidantoina (Fenitoina) 0,396 mmol/l 4,47 Dipirone 3,00 mmol/l 0,200 Furosemide 0,605 mmol/l 0,510 3-Iodo-L-tirosina (MIT) 234 pmol/l -0,015 Acido mefenamico 0,414 mmol/l ** Metimazolo 87,6 µmol/l 0,090 Fenilbutazone 3,24 mmol/l 0,830 6n-Propil-2-Tiouracile (PTU) 0,588 mmol/l 0,185 Salicilato di sodio 3,12 mmol/l 0,070 D-Tiroxina 2,57 µmol/l 5,13 L-Tiroxina 75,4 nmol/l 0,310 Acido L-3,3',5-triiodotiroacetico (TRIAC) 1,88 µmol/l ** L-3,3',5'-Triiodotironina (rt3) 691 pmol/l 0,040 = Distorsione media statisticamente rilevata ** Risultati superiori al campo di variazione del dosaggio, di conseguenza non idoneo per calcolare il bias Bibliografia 1. Prince HP & Ramsden DB.: A New Theoretical Description of the Binding of Thyroid Hormones by Serum Proteins. Clin Endocrinol 7: (1977). 2. Larsen PR.: Triiodothyronine: Review of Recent Studies of Its Physiology and Pathophysiology in Man. Metabolism 21: (1972). 3. Evered DC.: Diseases of the Thyroid Gland. Clinics in Endocrinology and Metabolism 3: (1974). 4. Cavalieri RR & Rapoport B.: Impaired Peripheral Conversion of Thyroxine to Triiodothyronine. Ann Rev Med 28: (1977). 5. Tunbridge WMG & Hall R.: Thyroid Function in Pregnancy. Clinics in Obstetrics and Gynaecology 2: (1975). 6. Clark F & Brown HJ.: Free Thyroxine Index. BMJ 2: 543 & 672 (1970). 7. Summers M et al.: Luminogenic Reagent Using 3-Chloro 4-Hydroxy Acetanilide to Enhance Peroxidase/Luminol Chemiluminescence. Clin Chem 41. S73 (1995). 8. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved guideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Calam RR.: Specimen Processing Separator Gels: An Update. J Clin Immunoassay 11: (1988). 10. Levinson SS.: The Nature of Heterophillic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J Clin Immunoassay 15: (1992). 11. Despres N & Grant AM.: Antibody interference in thyroid assays: a potential for clinical misinformation. Clinical Chemistry 44: (1998). 12. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices - Second Edition. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-T2. (1992). Versione 2.0 Pubb. n. GEM1010_IT 5

6 TT3 ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM1010_IT Versione 2.0

7 ISTRUZIONI PER L USO Revisioni TT3 Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1010/101.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 2.0 Pubb. n. GEM1010_IT 7

8 TT3 ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM1010_IT Versione 2.0