NTx. ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti NTx

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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti NTx NTx Impiego Per la misura quantitativa in vitro dei telepeptidi -N a legame crociato del collagene di tipo 1 (NTx) nell urina umana come indice del riassorbimento osseo nell uomo. Compendio e spiegazione del dosaggio Le ossa dell uomo sotto soggette ad un rimaneggiamento continuo della propria forma provocato dall azione degli osteoclasti e degli osteoblasti tramite l equilibrio tra processi di demolizione e di formazione ossea. Anomalie in questo processo possono provocare cambiamenti nella massa e nella forma dello scheletro. Circa il 90% della matrice organica ossea è di collagene di tipo 1, una proteina con struttura a forma di elica, legata da legame crociato con le estremità N e C - terminale della molecola. Le sequenze di aminoacido e l orientamento del telepeptide - N a legame crociato Alfa 2 (1) del collagene di tipo 1 (NTx) indica che esso è un indice specifico del riassorbimento osseo nell uomo. La molecola NTx viene generata da osteoclasti presenti nelle ossa e successivamente escreta nell urina. Un livello elevato di riassorbimento osseo è la causa primaria della perdita ossea legata all età e una bassa massa ossea provoca spesso l osteopenia e costituisce la causa principale dell osteoporosi 1,2. Livelli elevati di NTx indicano un riassorbimento osseo elevato. La molecola NTx è risultata anticipare una risposta dello scheletro alla terapia sostitutiva ormonale (HRT) nella condizione postmenopausale delle donne 3. È stato dimostrato che la NTx indica l effetto della terapia di antiriassorbimento sul riassorbimento osseo nella condizione postmenopausale delle donne e in individui a cui è stato diagnosticato il morbo di Paget 1,4. Principi della procedura Il dosaggio NTx VITROS viene eseguito utilizzando la confezione di reagenti NTx VITROS e i Calibratori NTx per prodotti immunodiagnostici VITROS sul sistema immunodiagnostico VITROS. Viene utilizzata una tecnica a dosaggio immunologico competitivo. Questa dipende dalla competizione tra la molecola NTx presente nel campione e un peptide NTx sintetico rivestito sui pozzetti per essere legati da un coniugato dell anticorpo marcato con perossidasi di rafano (HRP) (anti-ntx monoclonale di ratto). Il coniugato viene catturato dal peptide rivestito sui pozzetti, il materiale non legato viene rimosso mediante lavaggio. Il coniugato con perossidasi da rafano legato viene misurato mediante reazione luminescente 5. Un reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed un agente di trasferimento di elettroni, viene aggiunto ai pozzetti. La perossidasi da rafano nel coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, dando origine a produzione di luce. L agente di trasferimento di elettroni (acetanilide sostituita) provoca un aumento del livello di luce prodotta prolungandone l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal Sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato con perossidasi da rafano legato è indirettamente proporzionale alla concentrazione di NTx presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale Potenzialmente Infettivo Si raccomanda di usare la dovuta cautela nel maneggiare i campioni di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, del virus dell epatite C, dell HIV 1+2 o di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es.direttiva M29 del NCCLS 6 ). AVVERTENZA: Contiene ProClin 300 Il reagente coniugato contenente del ProClin 300. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1425_IT 1

2 NTx ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti Materiali forniti 1 confezione dei reagenti contenente: 100 pozzetti rivestiti (streptavidina, lega 3 ng biotina/pozzetto) e biotina - peptide NTx sintetico, rivestito a 18 ng/pozzetto). 17,6 ml di reagente coniugato (anti - NTx monoclonale di ratto marcato con HRP, lega 740 pmole di NTx BCE/mL) in soluzione tampone con agente antimicrobico. NOTA: Contiene sieroalbumina bovina. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema VITROS per immunodiagnostica oltre ai seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: Calibratori per NTx (comprese scheda di calibrazione lotti e schede dei protocolli), reagente di segnale, reagente di lavaggio universale, diluente per campioni ad elevata concentrazione A, contenitore per la conservazione delle confezioni di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti sigillati con essiccante a secco. I calibratori per NTx VITROS vengono forniti pronti per l uso. Conservare i calibratori in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Dopo l apertura conservare per un massimo di 13 settimane a 2-8 C o di 13 settimane a -20 C (è ammesso un solo ciclo di congelamento-scongelamento). Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Vengono utilizzati campioni di urina. Raccogliere la seconda urina del mattino utilizzando recipienti di raccolta adatti. I campioni di urina possono essere conservati fino ad un massimo di 5 giorni a 2-8 C o di 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Quando si effettuano misurazioni in serie, si raccomanda di raccogliere i campioni di urina sempre alla stessa ora del giorno. Non aggiungere conservanti al campione di urina. Non usare campioni nei quali è visibile o sospetta una contaminazione da emoglobina. Per questi campioni si raccomanda un ulteriore raccolta. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con il sistema VITROS. Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. La calibrazione è specifica per i singoli lotti. Le confezioni di reagenti e i calibratori corrispondenti sono identificabili dal numero di lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la medesima calibrazione, che dev essere effettuata con calibratori aventi lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. Manipolare i controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Riportare a 2-8 C quanto prima dopo l uso oppure caricarne soltanto un quantitativo sufficiente per un singolo impiego. Aliquote di calibratori possono essere trasferite in contenitori alternativi, identificabili tramite codici a barre con le etichette fornite. Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti e la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sufficienti a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio prevede l esecuzione di controlli ai fini della verifica delle prestazioni del dosaggio eseguito. I controlli NTx VITROS contengono 3 idonei livelli di NTx (bassi, medi, elevati). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente all esecuzione di una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). Se le procedure di controllo di qualità interne richiedono un uso più frequente dei controlli, è opportuno attenersi alle procedure previste. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. 2 Pubb. n. GEM1425_IT Versione 1.0

3 ISTRUZIONI PER L USO Procedura NTx Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è NTx. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio. Se necessario è possibile riconfigurare. Campioni di urina che presentano valori maggiori di quelli compresi nella gamma di calibrazione possono essere diluiti prima del dosaggio fino a 1/20 con il diluente per campioni ad elevati concentrazione A. Cfr. l foglietto illustrativo della confezione di diluente A per Campioni che presentano valori elevati. Procedura Il dosaggio per NTx VITROS richiede 25 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola, indipendentemente dal volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio per NTx VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 7 giorni. Il dosaggio per NTx VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema immunodiagnostico VITROS, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema a questo punto viene visualizzato il pulsante relativo alle diverse determinazioni sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti per immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i settori sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi di campionamento vengono effettuate automaticamente. 4. Processare i calibratori analogamente ai campioni. Non è necessario programmare la calibrazione se si usano etichette con codici a barre. Caricare i calibratori nell ordine voluto: la calibrazione parte automaticamente. 5. Determinare la concentrazione di creatinina nei campioni di urina utilizzando un metodo appropriato. Registrare i valori della concentrazione nei campioni di urina in nm BCE/mM di creatinina, come viene mostrato nell esempio seguente: Valore del dosaggio = 360 nm BCE Creatinina nell urina = 60 mg/dl creatinina 11,3* = 5,3 mm creatinina 360 nm BCE = 68 nm BCE/mM creatinina 5,3 mm creatinina * NOTA: Fattore di conversione utilizzato per convertire i mg di creatinina per dl in millimole di creatinina per litro. Risultati Per costruire la curva di calibrazione principale codificata sulla scheda di calibrazione dei lotti si usa una funzione di aggiustamento di curva logistica a quattro parametri modificata. Il processo di calibrazione riposiziona la curva di calibrazione principale definendo una curva valida che viene memorizzata per il sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Controllo di qualità I risultati di calibrazione vengono confrontati con un range di parametri di che appaiono in dettaglio nella videata dei parametri di calibrazione alla quale si accede dalle Opzioni e Configurazioni (videata di revisione/calibrazioni utente). Se non vengono rispettati tutti i range dei parametri di qualità definiti, sul rapporto di calibrazione appare un codice d identificazione. Per le operazioni da eseguire successivamente ad una calibrazione non andata a buon fine si veda il capitolo 8 della Guida dell Operatore (Revisione dei risultati). I valori dei campioni dei pazienti che non rientrano nell intervallo di riferimento vengono identificati con un codice basso o elevato LO o HI. I valori dei controlli vengono identificati se 2 DS rispetto alla media della linea di base definita. Non esistono parametri individuali in grado di descrivere completamente la qualità dell aggiustamento della curva. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento a valori di controllo ai fini della determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1425_IT 3

4 NTx ISTRUZIONI PER L USO Limiti della procedura Limiti della procedura Benché il dosaggio NTx VITROS venga utilizzato come indicatore del riassorbimento osseo, non è stato rilevato che l impiego di questo test sia in grado di prevedere l insorgenza di osteoporosi né un futuro pericolo di fratture. Un singolo valore di NTx non puo fornire la quota di riassorbimento osseo se i risultati riportati non contengono indicazione del periodo. L uso di questo test non è stato stabilito nell iperparatiroidismo primario e nell ipertiroidismo. I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. I campioni contenenti trioleina (33,9 mmol/l), bilirubina (0,21 mmol/l), glucosio (13,9 mmol/l), vitamina C (1,14 mmol/l) o albumina umana (5 g/l) interferiscono con questo dosaggio in ragione di meno del 10%. I campioni contenenti i microrganismi P.aeruginosa (ATCC 27853) (1 x 10 5 CFU/mL), E. coli (ATCC 25922) (1 x 10 5 CFU/mL) o Candida albicans (ATCC 14053) (1 x 10 5 CFU/mL) interferiscono con questo dosaggio in ragione di meno del 5%. L emoglobina interferisce con il dosaggio VITROS NTx. Ad una concentrazione di circa 50 mg di emoglobina/l la concentrazione di NTx nelle urine risulta essere fino al 17% superiore rispetto alla condizione di assenza di emoglobina. Non usare campioni torbidi. I livelli di biotina nell urina restano elevati fino a 24 ore dopo somministrazione orale o endovenosa di biotina. I campioni contenenti ng di biotina/ml interferiscono per meno del 10%. Valori attesi Ogni laboratorio dovrebbe confermare la validità degli intervalli di rifermento rispetto alla popolazione afferente. Come guida l intervallo di riferimento si basa sul 2,5 e il 97,5 percentile dei valori trasformati Log 10 : Categoria di individui Numero di individui Età Media Campo di variazione dell età NTx medio (nm BCE/mM di creatinina) Intervallo di riferimento (nm BCE/mM di creatinina) Donne dopo la menopausa Donne prima della menopausa Uomini Prestazioni metodologiche Calibrazione Il campo di variazione della calibrazione del dosaggio NTx VITROS va da nm BCE (Bone Collagen Equivalents 7, Equivalente di collagene osseo) (ricavabile da calibratori di riferimento interni che sono stati avvalorati per essere messi in correlazione con il dosaggio Osteomark NTx, con riferimento al tessuto osseo umano NTx). Le concentrazioni di NTx vengono indicate in nm BCE o in nm BCE/mM di creatinina. Accuratezza È stata ottenuta una correlazione tra il dosaggio NTx VITROS e il test NTx Osteomark tramite la misurazione di un panel di 378 campioni di pazienti di diverse categorie cliniche. Il campo di variazione dei campioni utilizzati comprendeva nm BCE/mM di creatinina per il dosaggio NTx VITROS a nm BCE/mM di creatinina per il test NTx Osteomark : Dosaggio NTx VITROS = 0,957 x test NTx Osteomark + 6,5 (nm BCE/mM di creatinina), con coefficiente di correlazione di 0, Pubb. n. GEM1425_IT Versione 1.0

5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia NTx Precisione La precisione è stata valutata secondo il protocollo EP5-T2 8 del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Due replicati di ognuno dei 4 controlli di urina sono stati analizzati in 2 occasioni separate al giorno per almeno 20 giorni diversi. L esperimento è stato eseguito usando 2 lotti di reagenti differenti su Sistemi differenti. I dati presentati sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 1: Precisione Concentrazione Giornaliera Intracalibrazione Intralaboratorio tipica nm BCE DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 96 3,43 3,3 8,85 8,5 8,16 9, ,98 1,7 17,4 4,1 17,3 4, ,6 0,9 33,0 2,4 45,5 3, ,4 0,8 65,9 2,9 83,4 3,7 * Quadratica media Giornaliera: Precisione fra un duplica e l altro, con media ottenuta su tutte le repliche. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variazione infra-replica, fra una replica e l altra e da un giorno all altro. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Tabella 2: Precisione - calcolato su 14 giorni Concentrazione Giornaliera Intracalibrazione Intralaboratorio tipica nm BCE DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 93 3,26 3,3 6,92 7,0 9,00 10, ,70 1,7 12,9 3,2 18,8 4, ,1 1,1 32,9 2,5 44,3 3, ,3 0,8 73,2 3,2 93,6 4,2 * Quadratica media Almeno 9 replicati in 2 sedute separate ogni giorno Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 3 calibrazioni. Sensibilità La sensibilità analitica viene definita come la concentrazione di 2 deviazioni standard rispetto alla media di un campione che non contiene analiti, dove vengono determinati 20 replicati. La sensibilità del dosaggio NTx VITROS di meno del 10 nm BCE. Specificità È stata rilevata la specificità dell anticorpo monoclonale per i peptidi legati al collagene presenti nell urina 7. Bibliografia 1. Garnero P et al. J Clin Endocrinol Metab 79: (1994) Comparison of New Biochemical Markers of Bone Turnover in Late Postmenopausal Osteoporotic Women in Response to Alendronate Treatment. 2. Garnero P et al. J Bone Miner Res 11: (1996) Increased Bone Turnover in Late Postmenopausal Women is a Major Determinant of Osteoporosis. 3. Chesnut CH III et al. Am J Med 102: (1997) Hormone Replacement Therapy in Postmenopausal Women: Urinary N-Telopeptide of Type I Collagen Monitors Therapeutic Effect and Predicts Response of Bone Mineral Density. 4. Papapoulos SE & Frolich M. J Clin Endocrinol and Metab 81: (1996) Prediction of the Outcome of Treatment of Paget s Disease of Bone with Bisphosphonates from Short-Term Changes in the Rate of Bone Resorption. 5. Summers M et al. Clin Chem 41. S73 (1995) Luminogenic Reagent using 3-chloro-4-hydroxy acetanilide to Enhance Peroxidase/luminol Chemiluminescence. 6. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved guideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Hanson D A et al. J Bone and Min Res (1992) A specific immunoassay for monitoring human bone resorption: Quantitation of Type 1 collagen cross-linked N-telopeptides in urine. 8. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-T2. (1992) Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices - Second Edition. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1425_IT 5

6 NTx ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM1425_IT Versione 1.0

7 ISTRUZIONI PER L USO Revisioni NTx Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1425/101.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 1.0 Pubb. n. GEM1425_IT 7

8 NTx ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM1425_IT Versione 1.0