Impiego Per la misura qualitativa in vitro dell antigene e componente del core del virus dell epatite B (HBeAg) nel siero umano.
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- Agnella Amato
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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti HBeAg HBeAg Impiego Per la misura qualitativa in vitro dell antigene e componente del core del virus dell epatite B (HBeAg) nel siero umano. Compendio e spiegazione del dosaggio L HBeAg è un polipeptide di dimensioni ridotte che si riscontra in forma libera nel siero delle persone infettate da virus dell epatite B (HBV) 1. Si presenta poco dopo l insorgere dell antigene di superficie dell epatite B e può essere rilevato in campioni raccolti ad uno stadio precoce dell infezione acuta da HBV e in alcuni portatori cronici. Durante la prima fase dell infezione, l anti-hbe non viene rilevato. La presenza dell HBeAg nel siero indica chiaramente un elevata infettività sia per la trasmissione maternofetale che per quella orizzontale dell HBV. La sieroconversione all anti-hbe si verifica generalmente prima dell insorgere di anticorpi all HBsAg, e durante questa fase il grado di infettività non è chiaro. Con l aumento del livello di anti-hbe, i livelli di antigene e del core del virus dell epatite B in circolazione precipitano e alla fine non sono più individuabili. Il trattamento dei pazienti positivi all HBeAg con interferone α può spesso indurre sieroconversione ad anti-hbe 2. Il monitoraggio dello stato HBeAg/anti-HBe consente di misurare la sieroconversione, importante per curare l infezione da HBV. Principi della procedura Il dosaggio HBeAg VITROS viene eseguito utilizzando la Confezione dei reagenti HBeAg VITROS e il calibratore HBeAg per prodotti immunodiagnostici VITROS sul sistema immunodiagnostico VITROS. Viene utilizzata una tecnica immunometrica che implica la reazione simultanea di HBeAg nel campione con anticorpo biotinilato HBeAg monoclonale di ratto e anticorpo HBeAg monoclonale di ratto marcato con perossidasi di rafano (HRP) nel coniugato. L immunocomplesso viene catturato nei pozzetti dalla streptavidina, il materiale non legato viene rimosso mediante lavaggio. Il coniugato HRP legato viene misurato mediante reazione luminescente 3. Ai pozzetti vengono aggiunti reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed agente di trasferimento degli elettroni. L HRP presente nel coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, producendo luce. L agente di trasferimento degli elettroni (acetanilide sostituito) aumenta il livello di luce prodotto, prolungandone altresì l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato con perossidasi da rafano legato è direttamente proporzionale alla concentrazione di HBeAg presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale Potenzialmente Infettivo Trattare come prodotto potenzialmente infettivo. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es. Direttiva M29 del NCCLS 4 ). Il Calibratore HBeAg VITROS contiene plasma umano HBeAg positivo proveniente da donatori testati individualmente e risultati negativi agli anticorpi del virus dell immunodeficienza umana (HIV 1+2) e del virus dell epatite C (HCV), utilizzando metodi approvati (immunodosaggi enzimatici, EIA). Esso è diluito in plasma umano proveniente da donatori testati individualmente e risultati negativi all HBsAg, agli anticorpi dell HIV 1+2 e HCV utilizzando metodi approvati (immunodosaggi enzimatici, EIA). Il plasma positivo HBeAg è stato trattato al fine di ridurre il titolo del virus potenzialmente infettivo. Tuttavia, poiché nessun metodo di dosaggio è in grado di escludere il rischio di una potenziale infezione, trattare come agente potenzialmente infettivo. Versione 1.0 Pubb. n. GEM0220_IT 1
2 HBeAg ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti Si raccomanda di usare la dovuta cautela nella manipolazione di materiali di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, HCV, HIV 1+2 e di altri agenti infettivi. AVVERTENZA: Contiene Kathon e 2-Chloroacetamide Il reagente coniugato contenente del Kathon e il reagente di dosaggio contenente del 2-Chloroacetamide. R36/38: Irritante per gli occhi e la pelle. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S26: In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. S37/39: Usare guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. Materiali forniti 1 confezione dei reagenti contenente: 52 pozzetti rivestiti (streptavidina, lega 3 ng biotina/pozzetto). 5,4 ml di reagente di dosaggio, soluzione tampone con agente antimicrobico e siero di ratto. 5,4 ml di reagente coniugato (0,3 µg/ml anti-hbe monoclonale di ratto marcato con HRP e 5,0 µg/ml anti-hbe monoclonale biotina di ratto) in soluzione tampone con agente antimicrobico, siero di pecora e siero di ratto. NOTA: Contiene albumina di siero bovino e gammaglobulina bovina. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema immunodiagnostico VITROS e i seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: HBeAg Calibratore (comprese la scheda di calibrazione del lotto e le schede dei protocolli), il reagente di segnale, il reagente di lavaggio universale, scatola di conservazione della confezione di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C. Non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti sigillati con essiccante a secco. Il calibratore HBeAg VITROS viene fornito liofilizzato. Conservare in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Ricostituire con 1,0 ml di acqua distillata. Dopo la ricostituzione conservare per un massimo di 5 settimane a 2-8 C o 13 settimane a -20 C (non è ammesso più di 1 ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Utilizzare solo campioni di siero. Prelevare i campioni di sangue utilizzando le procedure standard. Non riutilizzare campioni emolizzati. Il siero deve essere completamente separato da coaguli e residui cellulari il giorno stesso della prelievo. Non seguire questa procedura può portare ad risultati falsamente elevati. Il siero separato può essere stoccato fino a 7 giorni a 2-8 C o 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 5. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con il sistema VITROS. 2 Pubb. n. GEM0220_IT Versione 1.0
3 ISTRUZIONI PER L USO Note sul controllo di qualità e sulla procedura HBeAg Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. La calibrazione è specifica per i singoli lotti; i calibratori e le confezioni di reagenti vengono associati in base al numero di lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la stessa calibrazione, che dev essere effettuata con calibratore con lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. Il calibratore HBeAg viene elaborato automaticamente in duplicato. Manipolare i campioni, calibratori e controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Riportare a 2-8 C quanto prima dopo l uso oppure caricarne soltanto un quantitativo sufficiente per un singolo impiego. Il calibratore può essere suddiviso in aliquote in contenitori alternativi, che devono essere identificati mediante le etichette con codice a barre fornite in dotazione. Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti e la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sufficienti a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio richiede l esecuzione di controlli per la verifica delle prestazioni del dosaggio. Sono disponibili 3 controlli HBe VITROS (C1 - negativo, C2 - HBeAg positivo e C3 - anti-hbe positivo). Si raccomanda l esecuzione di controlli (C1 e C2) all atto della calibrazione e in seguito almeno ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). O ad intervalli più vicini ove richiesto dalle procedure di controllo qualità in uso presso il laboratorio. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è HBeAg. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio. Se necessario è possibile riconfigurare questi valori predefiniti dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. Procedura Il dosaggio per HBeAg VITROS richiede 80 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola, indipendentemente dal volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio per HBeAg VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 28 giorni. Il dosaggio per HBeAg VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema immunodiagnostico VITROS, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema. A questo punto viene visualizzato il pulsante relativo alle diverse determinazioni sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti per immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i settori sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi di campionamento vengono effettuate automaticamente. 4. Analizzare il calibratore come se si trattasse di campioni. Trasferire un aliquota del calibratore nel contenitore del campione (caricare un quantitativo sufficiente per la misura automatica in duplicato tenendo altresì conto del volume di riempimento minimo del contenitore), che devono essere identificati mediante le etichette con codice a barre fornite in dotazione. Se si usano etichette con codici a barre non occorre programmare la calibrazione; la calibrazione verrà effettuata automaticamente. Versione 1.0 Pubb. n. GEM0220_IT 3
4 HBeAg ISTRUZIONI PER L USO Risultati Risultati I risultati sono calcolati come un segnale normalizzato, relativo ad un valore di cut-off. Durante la procedura di calibrazione viene utilizzato un parametro specifico del lotto, codificato sulla scheda di calibrazione dei lotti, ai fini della determinazione di un valore di cut-off memorizzato valido per il sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Risultato = Segnale per il campione di prova Valore di cut-off Un risultato di 1,20 indica un campione reattivo e presenza di HBeAg. Un risultato di <0,80 indica un campione non reattivo, negativo per HBeAg. Un risultato di 0,80 e <1,20 indica un campione borderline. Controllo di qualità I risultati delle calibrazione vengono valutati a fronte di due parametri di qualità secondo quanto indicato nella Visualizzazione dei parametri di calibrazione, cui si accede dalla videata Opzioni e configurazione - Revisione/Calibrazioni dell utente. Il mancato rispetto dei parametri di qualità definiti viene codificato nel rapporto di calibrazione. Per le azioni da mettere in atto in seguito ad una calibrazione non andata a buon fine, vedere la Guida dell operatore, capitolo 8, Revisione dei risultati. I valori del campione dei paziente vengono identificati come Negativo, Borderline o Reattivo. I valori di controllo vengono identificati se la DS 2 rispetto alla media di baseline definita. La qualità della calibrazione non può essere descritta appieno da un singolo parametro. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento ai valori di controllo ai fini della determinazione della validità della calibrazione. Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. Un risultato negativo del test non garantisce l assenza di HBeAg. Sono stati rilevati mutanti dell HBV privi della capacità di produrre HBeAg 6. Questi possono manifestarsi come mutanti escape in presenza di anti-hbe e tali pazienti possono essere infettivi. Gli anticorpi eterofili nei campioni di siero o di plasma possono provocare interferenze negli immunodosaggi 7. Questi anticorpi possono essere presenti nei campioni di sangue provenienti da individui a contatto con animali o che sono stati curati con prodotti derivati da siero animale. I risultati che sono contraddittori con le osservazioni cliniche indicano che sono necessari altri test. Non riutilizzare campioni emolizzati. I campioni contenenti trioleina (<33,9 mmol/l) o bilirubina (<0,342 mmol/l) non interferiscono con l interpretazione clinica dei risultati. Non usare campioni torbidi. I livelli di biotina nel siero restano elevati fino a 24 ore in seguito a somministrazione di biotina per via orale o intravenosa. I campioni contenenti 5 ng di biotina/ml non interferiscono con l interpretazione clinica dei risultati. Non usare campioni plasma. Interpretazione dei risultati Un risultato negativo indica che non è stato rilevato l HBeAg. Un risultato reattivo indica la presenza di HBeAg. Un campione risultato borderline o reattivo nel dosaggio HBeAg VITROS andrà sottoposto ad ulteriore analisi in duplicato per verificarne lo stato effettivo. Prima di ritestare il campione verificare visivamente l assenza di emolisi e centrifugare al fine di separare residui cellulari e fibrina. Se i risultati del test ripetuto sono <0,80 per entrambi i replicati, il campione deve essere ritenuto negativo. Se i risultati del test ripetuto sono 1,20 per entrambi i replicati, il campione deve essere considerato reattivo. Nel caso di risultati ripetutamente borderline, si raccomanda l esecuzione di analisi di follow-up. Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla La calibrazione del dosaggio HBeAg VITROS è ricavabile da un calibratore di riferimento interno che è stato avvalorato al fine di ottimizzare la sensibilità clinica e le specifiche di reattività. Precisione La precisione è stata valutata in conformità al protocollo EP5-T2 8 National Committee for Clinical Laboratory Standards. Due replicati, ciascuno di 5 campioni di sieri di controllo sono stati dosati in una singola occasione al giorno per almeno 20 giorni diversi. L esperimento è stato effettuato usando 2 lotti di reagenti su sistemi diversi. I dati riportati sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. 4 Pubb. n. GEM0220_IT Versione 1.0
5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia HBeAg Tabella 1: Precisione Risultato Intra-dosaggio Intracalibrazione Intralaboratorio Rappresentativo DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 1,47 0,030 2,1 0,112 7,8 0,139 9,2 4,85 0,045 1,0 0,248 5,3 0,348 7,0 11,2 0,125 1,1 0,441 4,1 0,714 6,3 15,3 0,129 0,8 0,898 6,1 1,08 6, ,901 0,9 2,97 2,8 6,63 5,9 * Quadratica media Intra-dosaggio: Precisione fra un duplicato e l altro, con media ottenuta su tutti i replicati. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variazione infra-replica e l altra e da un giorno all altro. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Sensibilità La sensibilità è stata determinata analizzando diluizioni seriali di riferimento del siero di riferimento HBeAg del Paul-Erhlich-Institute (PEI), in 6 determinazioni utilizzando 2 lotti di reagenti. La sensibilità complessiva del dosaggio HBeAg VITROS per il siero di riferimento PEI è risultata di <0,35 Unità/mL. 56 campioni di pazienti precedentemente determinati reattivi all HBeAg in un diverso dosaggio disponibile in commercio sono stati sottoposti ad analisi con il dosaggio HBeAg VITROS. Si è calcolato che la sensibilità di questa popolazione di campioni con il dosaggio HBeAg VITROS corrisponde a 100% (56/56). Specificità Campioni di 1676 donatori di sangue in apparente buona salute e 645 campioni clinici sono stati testati con dosaggio HBeAg VITROS. Campioni Numero di campioni analizzati Inizialmente reattivi Ripetutamente reattivi Confermati positivi Donatore Clinici La specificità del dosaggio HBeAg VITROS per i donatori di sangue è stata calcolata come 99,88% (1674/ % CI 99,57-99,99%) basandosi su reattivi ripetuti. La specificità del dosaggio HBeAg VITROS per la popolazione di clinici è stata calcolata del 99,84% (644/645 95% CI 99,14-100,00%) basandosi su reattivi ripetuti. Inoltre 87 sono stati testati con il dosaggio HBeAg VITROS campioni dei seguenti sottogruppi potenzialmente cross-reagenti: positivo al citomegalovirus (CMV), malattie epatiche non virali, EBV, positivo all anti-hcv, campioni positivi all anticorpo anti-hav della classe IgM, fattore reumatoide positivo, altre malattie autoimmunitarie. Nel dosaggio HBeAg VITROS, per nessuna di queste categorie si sono riscontrati campioni ripetutamente reattivi. Bibliografia 1. Takahashi K et al. Immunochemical Structure of Hepatitis B e antigen in the serum. J Immunol 130: (1983). 2. Jacyna M & Thomas H. Antiviral Therapy: Hepatitis B. British Medical Bulletin 46: (1990). 3. Summers M et al. Luminogenic Reagent Using 3-Chloro 4-HydroxyAcetanilide to Enhance Peroxidase/Luminol Chemiluminescence. Clin Chem 41: S73 (1995). 4. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved guideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Calam RR. Specimen Processing Separator Gels: An Update. J Clin Immunoassay 11: (1988). 6. Carmen WF et al. Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet ii: (1989). 7. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J Clin Immunoassay 15: (1992). 8. Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices - Second Edition. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-T2 (1992). Versione 1.0 Pubb. n. GEM0220_IT 5
6 HBeAg ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM0220_IT Versione 1.0
7 ISTRUZIONI PER L USO Revisioni HBeAg Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM0220/101.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 1.0 Pubb. n. GEM0220_IT 7
8 HBeAg ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. CHIRON Corporation Emeryville, CA Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM0220_IT Versione 1.0
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