DEMENZE RARE E MALATTIE DEL MOTONEURONE

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1 CORSO DI FORMAZIONE 2011 DEMENZE RARE E MALATTIE DEL MOTONEURONE UP TO DATE SULLE SINDROMI ATASSICHE JOURNAL CLUB Lamezia terme 30/05/2011 Dott.ssa Maria Anfossi

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3 Le mutazioni nel gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) sono responsabili di due importanti fenotipi: Sindrome dell X Fragile (FXS) Sindrome da tremore e atassia associata all'x fragile (FXTAS)

4 Sindrome dell X Fragile (FXS) E la seconda causa di ritardo mentale di natura genetica dopo la sindrome di Down Si associa alla presenza di un sito fragile in corrispondenza della banda Xq27. 3, in questa regione mappa il gene FMR1 (17esoni) FREQUENZA : 1/4000 maschi; 1/6000 femmine Fenotipo Ritardo mentale grave Faccia allungata con mandibola larga Grandi orecchie a sventola Testicoli ingrossati (macro-orchidismo)

5 Alterazioni genetiche responsabili della FXS La sindrome è causata dall espansione della tripletta CGG nella regione non tradotta del gene FMR1, quando il numero delle triplette è > 200 l intera regione viene metilata aggiungendo un gruppo metilico alle citosine su entrambe le eliche, ciò comporta il silenziamento genico (malattia da perdita di funzione) e la mancata produzione della proteina FRMP (fragile X-mental redardation protein).

6 COSA FA FMRP? FMRP è una proteina RNA-binding selettiva associata con i poliribosomi ed espressa nei neuroni E implicata nel controllo traduzionale nelle sinapsi, regolando il rilascio dei neurotrasmettitori a livello post-sinaptico Nelle spine dendritiche regola la traduzione degli mrna codificanti importanti proteine che hanno funzione cruciale per la plasticità sinaptica e la maturazione neuronale Assenza di FMRP comporta un defict nell apprendimento e nella memorizzazione responsabili del ritardo mentale osservato nei pazienti affetti dalla Sindrome dell X fragile

7 Le mutazioni nel gene FMR1 sono riconducibili a mutazioni dinamiche

8 Cosa sono le mutazioni dinamiche? espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni codificanti o noncodificanti di alcuni geni. si originano per errori nella replicazione del DNA. possono originare un sito fragile visibile citogeneticamente.

9 SINDROMI DA PREMUTAZIONE DI FMR1 Una mutazione completa sul gene FMR1, responsabile della sindrome dell X fragile, non insorge MAI direttamente su un allele normale c è bisogno di una tappa intermedia la premutazione che conferisce all allele un aumentata instabilità e la propensione a diventare mutazione completa nel passaggio attraverso la gametogenesi femminile

10 SINDROMI DA PREMUTAZIONE DI FMR1 Sindrome da Tremore-Atassia associata all X fragile (FXTAS) Lievi sintomi psichiatrici Insufficienza ovarica e menopausa precoci (POF) Atassia isolata adulti

11 Sindrome da Tremore-Atassia associata all X fragile (FXTAS) La FXTAS venne descritta per la prima volta nel 2001 in 5 maschi con premutazione (PM) i cui sintomi erano: tremore con deficit delle funzioni esecutive, disfunzioni cerebellari, declino cognitivo e Parkinsonismo associato ad atrofia cerebrale generalizzata (Hagerman et al.,2001). Nel 2000 Tassone et al., aveva stabilito che i portatori di PM presentavano elevati livelli di mrna del gene FMR1 mentre i livelli di proteina FMRP erano leggermente ridotti. A tal proposito venne ipotizzato che la degenerazione del CNS presente in questi pazienti era dovuto ad elevata livelli di mrna FMR1 (Hagerman et al.,2001). La nuova sindrome venne chiamata sindrome da tremore ed atassia associata all'x fragile (FXTAS) [Jacquemont et al., 2003]

12 La sindrome da tremore ed atassia associata all'x fragile (FXTAS) è dovuta alla presenza di un'espansione da premutazione con ripetizioni CGG nel gene del ritardo mentale da X fragile 1 (FMR1; Xq27. 3) (Hagerman et al., 2001; Jacquemont et al., 2003, 2004a)

13 Dal punto di vista clinico E una malattia neurodegenerativa progressiva caratterizzata da tremore intenzionale ad esordio tardivo e andatura atassica ed è clinicamente e neuropatologicamente distinta dalla sindrome dell X fragile causata da full mutation in FMR1 (Hagerman et al., 2001; Jacquemont et al., 2003, 2004)

14 Tremore ed Atassia sono presenti insieme nel 75% dei casi Solitamente compare prima il tremore e progredisce verso l atassia Il tremore compare prima nella mano dominante e con il tempo interessa anche la mano opposta. E un tremore intenzionale a carico degli arti sup. che aumenta d intensità quando si prende o si manipola un oggetto. L atassia è di entità più moderata e risulta meno intensa rispetto al tremore La sua complicanza più grave riguarda il rischio di cadute

15 Altri segni clinici: Parkinsonismo (amimia facciale, lieve rigidità, lieve bradicinesia) Neuropatia periferica con riduzione di sensibilità delle gambe Coinvolgimento cognitivo (quando presente) va da una media alterazione delle funzioni esecutive a livello frontale e deficit di memoria ad una demenza globale simile fvftd, ma non ad AD (Grigsby et al., 2006, Grigsby et al.,2007) Ai disturbi cognitivi spesso si associano segni psichiatrici quali disturbi comportamentali, emotivi e del tono dell umore (Bacalman et al.,2006; Hessl et al., 2005)

16 Dal punto di vista neuroradiologico Alla risonanza magnetica cerebrale si osserva un quadro molto caratteristico (anche in fase precoce) dato dall iperintensità dei peduncoli cerebellari medi definita MCPsign

17 Iperintensità dei MCPs Perdita di volume con un aumento dell intensità di segnale nella sostanza bianca a livello frontale e parietale In fase avanzata ed in presenza di declino cognitivo, si osserva una diffusa atrofia corticale. Brunberg et al., 2002

18 Dal punto di vista neuropatologico Inclusioni eosinofile intranucleari in cellule neuronali ed astrocitarie in diverse regioni cerebrali. Tutto ciò fa si che la FXTAS sia definita dal punto di vista neuropatologico un disordine legato alle inclusioni. Greco et al., 2002; Brain

19 Inclusioni neuronali ed astrocitarie sono presenti anche nelle femmine affette da FXTAS (evento raro dovuto ad una inattivazione sbilanciata del cromosoma X) Hagerman et al.,2004b

20 Le inclusioni presenti in FXTAS sono simili a quelle presenti nei disordini con repeat CAG FXTAS: espansione CGG repeat SCA3: espansione CAG repeat

21 CRITERI DIAGNOSTICI* Criterio clinico (CC) Maggiore (M) Minore (m) -Tremore intenzionale - Atassia - Parkinsonismo - Deficit medio-grave di memoria a breve termine - Deficit delle funzioni esecutive Criterio radiologico (CR) Maggiore (M) Minore (m) - MCP sign - Lesioni della sostanza bianca cerebrale alla risonanza magnetica - Atrofia cerebrale generalizzata moderata-grave Categorie diagnostiche Definita Probabile Possibile 1CCM e 1CRM 2CCM/1CCm e 1CRM 1CCM e 1CRm *In presenza di premutazione Hagerman and Hagerman, 2004

22 Qual è la base molecolare del FXTAS? Presenza di espansione da 55 a 200 ripetizioni CGG nella regione non tradotta 5 -UTR di FMR1. Questa regione e polimorfica: varia da 7 a 52 ripetizioni. L allele più frequente ha 30 ripetizioni, stabili nella trasmissione e interrotte da 2 triplette AGG. Le triplette AGG prevengono eventi di scivolamento nella replicazione avendo così un ruolo stabilizzante.

23 Espressione del gene FMR1 Lo stato di premutazione nel gene FMR1 non comporta la mancata produzione della proteina come in FXS, ma livelli proteici leggermente inferiori alla norma. Questa ridotta efficienza viene in parte compensata da una maggiore produzione di mrna. Questo dettaglio è importante perché è la causa della FXTAS alla quale i maschi portatori di premutazione possono andare incontro

24 Si è ipotizzato che l espansione di CGG nel trascritto FMR1 impedisce la migrazione della subunità ribosomiale 40S, con conseguente alterata traduzione; Di conseguenza la cellula nervosa produce bassi livelli di FMRP; per compensare questi bassi livelli proteici viene aumentata la trascrizione del gene FMR1. La cellula nervosa tenta di eliminare le eccessive quantità di mrna di FMR1 utilizzando il pathway ubiquitina-proteosoma, ma non sempre ci riesce ed il risultato è la formazione di inclusioni intranucleari, con conseguente neurodegenerazione.

25 La patogenesi della FXTAS è associata ad un eccessiva produzione di mrna, alla precipitazione del medesimo all interno del nucleo e alla conseguente formazione di corpi inclusi con effetto tossico che porta alla morte cellulare (RNA gain-of-function model) Tassone et al.,2000; Hargerman et al.,20001; Greco et al., 2002 Iwahashi et al, 2002

26 Chi è affetto dalla FXTAS? Premutazione ( repeats) sono trovate in 1:259 F e 1:813 M. La premutazione è instabile quando viene trasmessa per via materna Sebbene siano stati descritti sia pazienti maschi che femmine, la FXTAS colpisce prevalentemente i maschi di età superiore ai 50 anni. La prevalenza della malattia in questa popolazione è stata stimata in circa 1: FXTAS rappresenta il 2.2% delle atassie dell età adulta; 4.4% delle atassie ad esordio > 50 aa Un piccolo sottogruppo di femmine portatrici della premutazione sviluppano lievi difficoltà di apprendimento, ansia, depressione. Il 20% femmine portatrici sviluppano menopausa precoce POF (premature ovarian failure): cessazione del ciclo mestruale prima dei 40 anni in presenza di elevati livelli di FSH Alcuni bambini maschi con premutazione presentano ritardo mentale ed autismo PJ Hargerman and RJ Hargerman, 2004

27 Penetranza di FXTAS: nei maschi premutati con età superiore ai 50 anni è circa del 40%, con una penetranza età-legata: 17% a 60 aa 38% a 70 aa 47% a 80 aa 75% oltre gli 80 aa Modalità di trasmissione: Jacquemont et al., 2004 JAMA Il locus del gene responsabile della FXTAS e della FXS mappa sul cromosoma X, quindi la modalità di trasmissione dovrebbe essere X-linked, manifestandosi in modo diverso nei due sessi

28 Premutazione trasmessa dalla madre

29 Premutazione trasmessa dal padre

30 Metodi di analisi molecolare del gene FMR1 Ad oggi non esiste un singolo test che permetta da solo di riconoscere tutte le caratteristiche molecolari delle mutazioni presenti nel gene FMR1

31 Metodi di analisi molecolare del gene FMR1 Southern blot di DNA digerito con specifici enzimi di restrizione PCR della sequenza CGG ed analisi dei microsatelliti. Le due tecniche forniscono informazioni complementari, entrambe debbono essere applicate per l identificazione dei soggetti normali, dei premutati e degli affetti.

32 PCR & analisi dei microsatelliti DNA sangue Amplificazione DNA Separazione frammenti di lunghezze diverse ABI 3130 Genescan Analysis Valutazione del numero CGG

33 PCR & analisi dei microsatelliti (1) Richiede piccole quantità di DNA (dell ordine dei nanogrammi), Tempi di esecuzione brevi Il numero di CGG è determinato in modo più preciso rispetto al Southern Molteplici protocolli di analisi sono stati pubblicati usando differenti sets di primers, condizioni di amplificazione e metodi di separazione dei frammenti

34 PCR & analisi dei microsatelliti (2) L amplificazione di grandi frammenti ricchi in GC è particolarmente difficoltosa e richiede l uso di Taq polimerasi specifiche. I metodi pubblicati consentono l amplificazione degli alleli normali e di quelli premutati inferiori a CGG. Ad oggi non permette di identificare le mutazioni complete (assenza amplificato).

35 Southern blot sangue DNA Digestione DNA enzimi di restrizione - DNA + EagI + EcoRI + Buffer 37 o.n. Separazione frammenti di lunghezze diverse + Corsa elettroforetica su gel di agarosio Trasferimento DNA su membrana Southern blot Rilevazione bande specifiche Ibridazione con sonda StB12.3 (marcata con 32 P oppure con digossigenina)

36 Southern blot (2) E la tecnica d elezione per l identificazione di tutte l espansioni. Richiede alta qualità del DNA estratto e quantità considerevoli (5-10 microgrammi) L esecuzione necessita di più giorni (varie tappe) La corsa elettroforetica deve essere sufficientemente prolungata (oltre 20 ore), in modo da permettere il riconoscimento di piccole premutazioni

37 Chi sottoporre al test genetico soggetti con anamnesi familiare positiva per la sindrome dell X Fragile o ritardi mentali da lievi a gravi con eziologia sconosciuta soggetti con menopausa precoce e/o anamnesi familiare positiva per menopausa precoce (mamma, sorella, zia, nonna) soggetti con anamnesi familiare per disturbi neurologici (tremori, FXTAS)

38 Consulenza Genetica La consulenza genetica per i disturbi della FXTAS è impegnativa a causa dell eredità multigenerazionale complessa, per il fenotipo variabile e per le implicazioni sulle famiglie. Tutte le donne con premutazione possono avere figli con mutazione completa e quindi FXS Tutte le figlie di maschi con premutazione saranno portatori obbligati della premutazione. Il pedigree relativo alla famiglia è utile per calcolare il rischio genetico relativo allo stato di portatore, alla possibilità di ammalarsi e alla possibilità di trasmettere la premutazione alla prole. Quando un paziente di sesso maschile con FXTAS è identificato, la madre del paziente è un portatore obbligato. Di conseguenza la prole e i parenti della madre e del paziente potrebbero essere a rischio per la FXS o essere portatori della premutazione. I fratelli del paziente sono a rischio per la FXTAS.

39 Conclusioni (1) La scoperta del gene FMR1 e delle mutazioni responsabili della sindrome dell X fragile ha permesso di comprendere molte caratteristiche delle patologie dovute a espansione di triplette (es. fenomeno dell anticipazione). Tuttavia alcuni punti non sono stati ancora chiariti. Non è noto, infatti, il momento esatto in cui avviene l espansione delle triplette, né si sa con esattezza perché la trasmissione della malattia avvenga esclusivamente per via materna. Inoltre la funzione della proteina FMRP non è stata ancora del tutto chiarita.

40 Conclusioni(2) FXTAS potrebbe essere uno dei più comuni disturbi neurologici progressivi associati ad un difetto genetico nei maschi, ma è attualmente sotto-diagnosticata perché solo recentemente è stata descritta. Inoltre, la manifestazione clinica è spesso non-specifica e i sintomi possono essere ignorati, considerati secondari o semplicemente legati all'invecchiamento. Per una corretta diagnosi di FXTAS l individuazione dello stato di premutazione gioca un ruolo importante e, per questo motivo, i pazienti con le caratteristiche cliniche e neuroradiologiche descritte dovrebbero sottoporsi al test genetico.

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