Parte generale. Laurea specialistica in Biotecnologie Molecolari,corso di Immunologia Molecolare. Francesco Mainini

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1 IL-5 Parte generale Laurea specialistica in Biotecnologie Molecolari,corso di Immunologia Molecolare Francesco Mainini

2 L il-5 ha un peso molecolare che va dai 45-60kDa ed è formata da due monomeri. Il primo monomero (in rosso) è composto da tre α-eliche (A,B,C) mentre il secondo è composto solo dalla elica D. Tra A/B e C/D è presente una piccola struttura di congiunzione a β-foglietti Rif.[5]

3 Amminoacidi coinvolti nel binding con il recettore IL-5rα Rif.[5]

4 Caratteristiche dell IL-5 -Il gene dell IL-5 è localizzato sul cromosoma 5 -E prodotta principalmente da Th2 attivati ma anche dalle mast cell e dagli eosinofili -Il suo recettore è un eterodimero composto da una subunità α (espressa principalmente sulla membrana degli eosinofili) e da una subunità β comune ai recettori dell IL-3 e GM-CSF -La trasduzione del segnale del recettore attiva numerose proteine tra cui la famiglia di Src, JAK, STAT-1 e STAT-5

5 Funzioni dell IL-5 -L IL-5 è importante nei processi biologici che riguardano sia l immunità innata che l immunità adattativa -L IL-5 è principalmente implicata nello sviluppo, differenziazione, reclutamento e attivazione degli eosinofili e in parte minore anche dei basofili -IL-5 promuove anche il differenziamento terminale delle cellule B indirizzando la produzione di Ig inizialmente verso IgM e IgA e successivamente verso IgG1 -Inoltre stimola le cellule CD34+ presenti nel midollo che esprimono il IL-5Rα facendole cosi differenziare in eosinofili

6 Gli eosinofili -Gli eosinofili sono cellule granulocitarie multifunzionali che contengono e producono numerose sostanze ad attività biologica. -La loro presenza è spesso correlata con infezioni di parassiti e manifestazioni allergiche -Al loro interno sono presenti proteine basiche altamente tossiche per gli elminti (specialmente nello stato di larva) -Esprimono IL-5Rα e mediano la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC) in quanto esprimono il recettore per il frammento cristallizzabile delle IgE e IgG

7 Ruolo fisiologico dell IL-5 -L IL-5 è una citochina pro-infiammatoria prodotta da linfociti TH2 differenziati -Promuove la migrazione verso il sito di infiammazione e l attivazione degli eosinofili (immunita innata) -Gli eosinofili sono in grado, attraverso l ADCC, di lisare eventuali parassiti mediante il rilascio di sostanze contenute nelle vescicole al loro interno -L IL-5 è ha un ruolo nel differenziamento terminale dei linfociti B, i quali tramite la produzione di IgA, IgM e successivamente di IgG1, partecipano all eliminazione del patogeno (immunità adattativa) -L inalazione di allergeni aumenta la produzione di IL-5 nelle vie respiratorie incrementando cosi sia il numero di eosinofili nel circolo periferico, sia il differenziamento di cellule staminali ematopoietiche verso gli eosinofili

8 Bibliografia 1: Paul M. O Byrne, Cytokines or Their Antagonists for the Treatment of Asthma, CHEST, 130; ,2006 2: Kay AB, Menzies-Gow A., Eosinophils and Interleukin-5, Am J Respir Crit Care Med, 167(12):1586-7, : Paul M. O Byrne, Reassessing the Th2 cytokine basis of asthma, Trends Pharmacol Sci., 25(5):244-8, :Alan Daugherty, IL-5 links adaptive and natural immunity in reducing atherosclerotic disease, J Clin Invest, 114(3):317-9, :J.-L. Verscheldea, Analysis of three human interleukin 5 structures suggests a possible receptor binding mechanism, FEBS Lett., 424(3):121-6,1998

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10 Università degli Studi di Torino, Scuola per le Biotecnologie Corso di Immunologia molecolare Prof. Forni, prof. Cavallo IL-5 RECETTORE, PATHWAYS INTRACELLULARI E APPLICAZIONI TERAPEUTICHE Laura Lattanzio Torino, 9 novembre 2006

11 LA MOLECOLA Punti cruciali per il legame con il recettore Martinez-Moczygemba M et al., J Allergy Clin Immunol, 2003 Uings I and McKinnon M, Curr Pharm Des, 2002

12 IL RECETTORE Catena α specifica per ogni citochina Catena β comune Geijsen N et al., Cytokine Growth Factor Rev, 2001 IL-5R appartiene alla superfamiglia dei recettori di classe I delle citochine

13 IL RECETTORE CARATTERISTICHE: Il recettore (IL-5R) è espresso solo su cellule della linea basofila/eosinofila, sui precursori delle cellule B (CD34+) nel midollo osseo e sulle cellule B mature E un complesso eterodimerico che presenta una subunità α specifica che lega l IL-5 ad alta affinità ed una subunità β a bassa affinità per l interleuchina, necessaria per la trasduzione del segnale mediata dall IL-5 Sono necessarie entrambe le subunità per la trasduzione del segnale STRUTTURA: SUBUNITA α: - il gene per la catena α è sul cr.3 (6 nel topo) CMR ( cytokine receptor module) di ~100 aa con fibronectina di tipo III contenenti cisteine che ponti disolfuro WSXWS vicino alla membrana - 1 dominio domini di formano - 1 dominio SUBUNITA β: - il gene per la catena β è sul cr.22 - porzione extracellulare formata da 2 CMR con cisteine che formano ponti disolfuro - molto più lunga, contiene i residui necessari per la trasduzione del segnale intracellulare (proline, tirosine..)

14 IL RECETTORE Carr PD et al., Cell, 2001

15 IL RECETTORE Carr PD et al., Cell, 104: 291, 2001

16 SPLICING DEL RECETTORE (βc) Tavernier J et al., Blood, 2000 FORMA TRANSMEMBRANA: FORMA SOLUBILE DI TIPO I: FORMA SOLUBILE DI TIPO II: Esclusione esone 11, inclusione esoni 12, 13, 14 Include e termina all esone 11 Generata in assenza di splicing

17 ATTIVAZIONE DEL RECETTORE Per l attivazione del recettore è necessaria la dimerizzazione, che porta allla transfosforilazione delle tirosine della βc Guthridge M et al., Stem Cells, 1998 Martinez-Moczygemba Carr PD et al., Cell, 2001M et al., J Allergy Clin Immunol, 2003 In realtà studi recenti hanno dimostrato che è sufficiente un monomero per avere l attivazione del recettore e del pathway intracellulare, anche se il legame con l IL-5 avviene con un affinità molto inferiore

18 PATHWAYS INTRACELLULARI I tre principali pathway attivati dall IL5 sono: 2. JAK/STAT 3. MAPK 4. PI3K Sono molto importanti anche i meccanismi di terminazione del segnale Martinez-Moczygemba M et al., J Allergy Clin Immunol, 2003

19 STRATEGIE PER INIBIRE L ATTIVITA DELL IL-5 PREVENIRE l ATTIVAZIONE IMMUNITARIA: immunomodulatori, citochine anti-infiammatorie INIBIRE L ESPRESSIONE DELL IL-5: oligonucleotidi antisenso, inibitori dei fattori di trascrizione SEQUESTRO DELLE CITOCHINE CIRCOLANTI: recettori solubili, anticorpi neutralizzanti ANTAGONISMO DEL LEGAME DEL RECETTORE: piccole molecole, peptidi, proteine mutanti BLOCCO DEL SIGNALING INTRACELLULARE: inibitori del signaling e bloccanti della catena β Uings I and McKinnon M, Curr Pharm Des, 2002

20 IL-5 e PATOLOGIE: ASMA ASMA: disordine infiammatorio cronico della mucosa delle vie respiratorie. La patologia si presenta in 2 stadi: 2. Sensitizzazione all allergene, con sviluppo di TH2 antigene-specifici 3. L infiammazione viene estesa alle vie respiratorie più basse, dove provoca alterazioni della struttura delle mucose e iperrisposta delle vie respiratorie. Durante l infiammazione si ha un aumento notevole di diversi tipi di citochine e fattori di crescita IL-5 è coinvolta nella patologia dell asma in quanto regola proliferazione, differenziamento, maturazione e attivazione degli eosinofili, cellule chiave nella patogenesi delle infiammazioni allergiche. Kips JC, Eur Respir J, 2001 Nelle vie respiratorie si ha un aumento dell espressione dell mrna dell IL-5 Topi che overesprimono IL-5: aumenta il numero di eosinofili e di cellule CD34+ Topi KO per IL-5: diminusce il numero di eosinofili circolanti e la risposta eosinofila ad infezioni e infiammazioni

21 TH2, IL-5 e ASMA Hamelmann E and Gelfand EW, Immunol Rev, 2001 Nella patogenesi dell asma si verigica uno squilibrio (aumento) della risposta mediata dai TH2 che producono elelvati livelli di diversi tipi di citochine: - IL-4 stimola la produzione di IgE che legano i R sui mastociti che secernono IL-5. Induce il differenziamento delle cellule TH naive in TH2 aumentando ulteriormente il rilascio di citochine - IL-5 induce il differenziamento e la crescita degli eosinofili ( e dei precursori degli eosinofili nel midollo), stimolando il rilascio di sostanze che intervengono nella risposta infiammatoria

22 APPLICAZIONI TERAPEUTICHE Queste citochine sono ottimi target utilizzabili nelle terapie contro l asma e le patologie polmonari croniche. Tra le terapie già in atto ci sono: Anticorpi bloccanti le citochine specifiche (es: mepolizumab, Fool-Page PT et al., O Byrne PM et al., 2006) Antagonisti dei recettori (es: isotiazolone, Roche) Piccole molecole che inibiscono il recettore Inibitori della sintesi delle citochine Inibitori dei pathway intracellulari(es: Dynamin, Gorska MM et al.,2006) Uso di citochine anti-infiammatorie che down-regolano l infiammazione allergica (IL-10, IL-12..) Questi farmaci presentano problemi soprattutto per il metodo di somministrazione e il delivery, ostacoli non indifferenti in terapie croniche quali quelle per l asma. Sono in corso diversi studi per superare questi fattori limitanti e migliorare le terapie a favore dei pazienti. Negli ultimi anni la terapia più utilizzata è stata quella basata sull uso di anticorpi che bloccano le diverse interleuchine. Più recentemente si stanno sviluppando farmaci antagonisti in grado di bloccare i recettori specifici di ogni citochina

23 UN ESEMPIO: YM YM inibisce il legame tra IL-5 e IL-5R e influenza gli effetti dell IL-5 sulla sopravvivenza cellulare e sul signaling intracellulare Studio sugli effetti del farmaco antagonista su: 4. Legame IL-5 e recettore 5. Sopravvivenza degli eosinofili 6. Pathways intracellulari Morokata T et al., Int Immunopharmacol, 2002

24 YM-90709: effetti sul legame IL-5/IL-5R Stimolando con IL-5 e somministrando YM90709 a dosi crescenti si ha una diminuzione del numero di molecole di IL-5 che si lega al recettore Non trattate Trattate con YM Morokata T et al., Int Immunopharmacol, 2002

25 YM-90709: effetti sulla sopravvivenza degli eosinofili Non trattate Stimolando con IL-5 e somministrando YM90709 a dosi crescenti viene inibita la sopravvivenza degli eosinofili Trattate con YM90709 Morokata T et al., Int Immunopharmacol, 2002

26 YM-90709: effetti sui pathways intracellulari Stimolando con IL-5 e somministrando YM90709 a dosi crescenti si ha una diminuzione della fosforilazione della JAK2 Morokata T et al., Int Immunopharmacol, 2002 QUINDI: l antagonista blocca l interazione tra l IL-5 e il suo recettore e di conseguenza le funzioni dell interleuchina sugli eosinofili, modulando la risposta infiammatoria in vivo. Sono in corso trial clinici per verificare l uso di questo farmaco nelle terapie delle infiammazioni eosinofiliche, quali l asma

27 BIBLIOGRAFIA Martinez-Moczygemba M and Houston DP, Biology of common β receptorsignaling cytokines: IL-3, IL-5, and GM-CSF, J Allergy Clin Immunol, 112 : 653, 2003 Uings I and McKinnon M, Development of IL-5 Receptor antagonists, Curr Pharm Des, 8 : 1837, 2002 Geijsen N et al., Specificity in cytokine signal transduction: lessons learned from the IL-3/IL-5/GM-CSF receptor family, Cytokine and Growth Factor Rev, 12 : 19, 2001 Carr PD et al., Structure of the complete extracellular domain of the common β subunit of the human GM-CSF, IL-3 and IL-5 receptors reveals a novel dimer configuration, Cell, 104 : 291, 2001 Tavernier J et al., Interleukin 5 regulates the isoform expression of its own receptor a-subunit, Blood, 95 : 1600, 2000 Guthridge M et al., Mechanism of the activation of the GM-CSF, IL-3 and IL-5 family of receptors, Stem Cells, 16 : 301, 1998