simultanea di deossinivalenolo e nivalenolo nel frumento

Transcript

1 Work kshop MIC CPRINCEM Micotossine principali ed emergenti nei cereali Sviluppo e validazione di un metodo UPLC-DAD per la determinazione i simultanea di deossinivalenolo e nivalenolo nel frumento M. Pascale, G. Panzarini, A. Visconti ISPA-CN NR, Bari Roma, 18 aprile 2013

2 Coinvolgimento o dell ISPA-CNR nel WP1. Definizione e validazione di metodiche analitiche utili per la determinazione di micotossine nei cereali WP3. Valutazione dell'incidenza delle principali micotossine utile per la costruzione di un sistema nazionale di valutazione del rischio WP4. Analisi della diffusione nelle aree a rischio dell incidenza delle principali specie fungine potenzialmente micotossigene. Verifica della correlazione tra presenza del fungo sulla pianta e contaminazione da micotossine Task 1.2 Definizione i i delle metodiche analitiche per la determinazione di micotossine emergenti nei cereali Task 1.3 Studio di metodi rapidi e/o innovativi di indagine per l'accertamento delle micotossine i e delle fitopatie i fungine (in collaborazione con CRA QCE) Task 3.3 Valutazione dell'incidenza di micotossine emergenti in frumento, mais e orzo nei diversi areali agro-climatici italiani (in collaborazione con CRA QCE e CRA-MAC) Task 4.2 Analisi delle principali specie fungine produttrici di tossine T-2 e HT-2 in Italia (in collaborazione con CRA PAV)

3 Deossinivaleno lo/nivalenolo Cereali H 3 C CH 2CH3 Deossinivalenolo (DN) a rischio contaminazione frumento mais orzo seg gale avena H 3 C FUNGHI PRDUTTRI CH 2CH3 Nivalenolo (NIV) DN Fusarium graminearum F. culmorum NIV Fusarium graminearum F. culmorum F. poae F. crookwellense

4 DN e NIV: effetti t ossici sugli animali Inibizione i della sintesi i del DNA, RNA e delle proteine Effetti neurotossici ed immunosoppressivi Vomito Rifiuto cibo Riduzione peso corp poreo Ritardo nella crescit ta DN TDI 1 µg/kg b.w./day NIV t-tdi 0.7 µg/kg b.w./day Scientific Committee on Food, European Union (2002)

5 Frequenza di contam minazione da tossine di Fusarium in Europa Scientific Coope eration (SCP) Task (Aprile 2003) micotossina n. ca ampioni campioni analizzati positivi Deossinivalenolo % Nivalenolo % Tossina T % Tossina HT % Zearalenone % Fumonisina B % Fumonisina B %

6 DN in Livelli di DN n cereali in Europa Scientific Cooperation (SCP) - Task % media positivi (µg/kg) Pae ese Media (µg/kg) Paese Max. (µg/kg) Frumento Svezia 1427 Francia Mais Francia 1056 Francia 8500 rzo landa 153 Finlandia 619 Avena Finla andia 628 Finlandia 5004 Segale landa 150 Francia 595 Turner, 2010

7 Livelli di NIV in cereali in Europa Scientific Cooperation (SCP) - Task % media positivi (µg/kg) Pae ese Media (µg/kg) Paese Max. (µg/kg) Frumento Finlandia 199 Danimarca 440 Mais Francia 340 rzo 8 15 Finlandia 55 Finlandia 351 Avena Aus stria 197 Austria 1860 Segale Danimarca 48 - non fornito dallo SCP Turner, 2010

8 Livelli di DN in frumento duro prodotto o in Italia (rete naziona le ) 2008) Risultati del MICCER NRD CENTR SUD-ISLE ANNI n. cam. n. pos. Media pos. (ppb) max. (ppb) n. cam. n. pos. Media pos. (ppb) max. (ppb) n. cam. n. pos. Media pos. (ppb) max. (ppb) (65%) (5 0%) (15%) (97%) (7 2%) (57%) (100%) (8 0%) (33%) totale (88%) (6 4%) (36%) - - metodo di analisi ELISA, LD = 18,5 ppb Aureli et al., 2009

9 Metodi di analisi per la determinazione simultanea d i DN e NIV clean-up vantaggi svantaggi GC-ECD, MS MycoSep Analisii simultanea di tricoteceni Buona sensibilità Conferma dell analita (MS) Derivatizzazione Effetto matrice Effetto memoria Interferenze di matrice Scarsa accuratezza e precisione i HPLC-UV MycoSep Buona precisione Interferenze di matrice Bassa sensibilità s HPLC-FLD SPE Buona Buona sensibilità precisione Derivatizzazione Interferenze di matrice LC-MS MycoSep, SPE Analisii simultanea di micoto ossine Buona sensibilità Conferma dell analita Strumentazione costosa Effetto matrice Curva di calibrazione in matrice o uso di standard isotopici

10 Determinazione simult tanea di di DN e NIV Nuova colonna ad immunoaffinità H 3 C Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC ) CH 2CH3 H 3 C CH 2CH3 Anticorpo monoclonale l Nuova fase stazionaria (dimensioni delle particelle <2,0 µm). specifico per DN e NIV in grado Vantaggi (prestazioni migliori rispetto HPLC): di isolare simultaneamente le due - migliorata risoluzione; micotossine dall estratto - migliorata sensibilità; - migliorata velocità; - ridotto uso di solventi organici. Tempi delle corse cromatografiche fino a 9 volte inferiori a quelli HPLC.

11 Metodo di analisi Estrazione doppia filtrazione (filtro di carta e filtro a microfibra di vetro) Purificazione dell estratto con colonna ad immunoaffinità (DN-NIV NIV TM WB, Vicam) Strumentazione: Acquity UPLC (Waters) Colonna: Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 100 2,1 mm i.d.).) Volume iniettato: 10 µl Fase mobile: H 2 :CH 3 (85:15) Flusso: 0,4 ml/min Rivelatore: PDA ( =220 nm) Analisi UPLC /PDA

12 ttimizzazione della pr rocedura di estrazione (campione artificialm mente contaminato) Livello di contaminazione: µg/kg DN e 1000 µg/kg NIV Condizioni di estrazione acqua (agitazione orbitale, 1 h) metanolo:acqua, 80:20 (agitazione orbitale, 1 h) DN NIV Rec. RSD* Rec. RSD* (%) (%) (%) (%) 93,9 a 2,9 89,0 a 3,6 92,0 a 2,1 87,6 a 2,3 * RSD, deviazioni standard relative (n=3); valori seguiti dalla stessa lettera nella stessa colonna non sono significativamente differenti a P<0.001 (test di Student Newman Keuls)

13 ttimizzazione della pr rocedura di estrazione (campione di frumento na aturalmente contaminato) Condizioni di estrazione Media ( µg/kg) DN RSD* (%) Media (µg/kg) NIV RSD* (%) acqua blending, 3 min acqua agitazione orbitale, 1 h metanolo:acqua, 80:20 blending, 3 min metanolo:acqua, 80:20 agitazione orbitale, 1 h 663 a 1,0 491 a 1,0 673 a 2,3 501 a 1,6 384 b 5,8 334 b 4,3 449 c 2,6 441 c 3,1 * RSD, deviazioni standard relative (n=6); valori seguiti dalla stessa lettera nella stessa colonna non sono significativamente differenti a P<0.001 (test di Student Newman Keuls)

14 ttimizzazione della pr rocedura di estrazione (materiale di riferi mento certificato) ERM BC600 DN ± SD * NIV ± SD * (µg/kg) (µg/kg) Valore certificato 102 ± ± 130 Valore trovato acqua (agitazione orbitale, 1h) Valore trovato t metanolo:acqua, 80:20 (agitazione orbitale, 1h) 110 ± ± ± ± 17 * Deviazione standard, n=5

15 Metodo di analisi ottimizzato Estrazione (acqua, agitazione orbitale, 1h) doppia filtrazione (filtro di carta e filtro a microfibra di vetro) Purificazione dell estratto con colonna ad immunoaffinità (DN-NIV NIV TM WB, Vicam) Lavaggio con acqua Eluizione con metanolo Analisi UPLC /PDA Limite di rivelabilità (LD) NIV = 20 µg/kg DN =30 µg/kg

16 Capacità della colonna ad immunoaffinità DN NIV + DN NIV La colonna ad immunoaffinità mostra saturazione dei siti dell anticorpo specifici per il DN e NIV a livelli maggiori di 2000 ng (singola micotossina o somma di DN e NIV). Range di applicabilità LD 4000 µg/kg

17 Recuperi e precisione Livello di fortificazione (µg/kg) DN Recupero (%) NIV RSD* Recupero RSD* (%) (%) (%) , , , , ,9 7,0 83,9 6,7 1,9 81,1 2,7 1,2 87,9 1,1 1,8 87,7 3,0 1,8 85,5 2,7 * RSD, deviazioni standard relative (n=4)

18 Validazione del metodo con materiale di rife erimento certificato ERM BC600 DN ± SD * (µg/kg) NIV ± SD * (µg/kg) Valore certificato 102 ± ± 130 Valore trovato ** 110 ± ± 38 *Deviazione standard, ** analisi effettuate per 5 giorni consecutivi (n=5 5)

19 Cromatogrammi UPLC-PDA di estratti di frumento contaminati da DN e NIV (a) AU NIV DN Campione non contaminato (<20 µg/kg NIV and <30 µg/kg DN) Minutes NIV (b) AU DN Campione artificialmente contaminato con NIV (1750 µg/kg) e DN (1750 µg/kg) Minutes NIV (c) AU Campione certificato ERM -BC600 (NIV = 1124 µg/kg, DN = 980 µg/kg) DN Minutes

20 Cromatogrammi Confronto cromatog UPLC-PDA rammi di estratti UPLC vs di HPLC frumento (materiale contaminati di riferimento da certificato DN ERM e NIV BC600) NIV (1,2 min) UPLC Strumentazione: Acquity UPLC (Waters) Colonna: Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 100 2,1 mm) AU Volume iniettato: 10 µl Fase mobile: H 2 :CH 3 (85:15) DN (2,4 min) Flusso: 0,4 ml/min Rivelatore: PDA ( =220 nm) Minutes NIV (4,9 min) HPLC Strumentazione: : Alliance HT (Waters) Colonna: Synergi 4µ Hydro-RP (4 µm, 150 x 3,0 mm) AU Volume iniettato: 50 µl Fase mobile: H 2 :CH 3 (85:15) DN (10,2 min) Flusso: 0,5 ml/min Rivelatore: PDA ( =220 nm) Minutes Tempo (min)

21 Performances del metodo UPLC-PDA per la determinazione di D N e NIV in frumento DN NIV LD 30 µg/kg 20 µg/kg Recuperi (n=4) 85-95% range µg/kg 81-88% range µg/kg Precisione (RSD) <7% 7% Tempo totale t di analisi i Corsa UPLC Capacità della colonna ad immunoaffinità 1 h 4min 2000 ng (singo la micotossina o somma di DN e NIV) Range di applicabilità µg/kg (2 ml of estratto su IMA) (singola micotossina o somma di DN e NIV)

22 Analisidicampioninaturalmente contaminati 20 campioni di frumento duro i rigine: i Nord It talia DN NIV positivi 100% 10% media (µg/kg) valore max. (µg/kg)

23 Work kshop Micotossine i principali i ed emergenti nei cereali Grazie per l attenzione! michelangelo.pascale@ispa.cnr.it Roma, 18 aprile 2013