C. trachomatis PCR Kit. Diagnostica quantitativa in vitro per l'impiego con ABI PRISM Sequence Detection Systems (Applied Biosystems)

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1 C. trachomatis PCR Kit Diagnostica quantitativa in vitro per l'impiego con ABI PRISM Sequence Detection Systems (Applied Biosystems) Manuale d uso Luglio 2004

2 Indice 1. Contenuto Conservazione Materiali e dispositivi addizionali richiesti Precauzioni generali Informazioni sull agente patogeno Principio della real-time PCR Descrizione del prodotto Protocollo Fase preanalitica: prelievo, conservazione e trasporto dei campioni Prelievo dei campioni Conservazione dei campioni Trasporto dei campioni Isolamento del DNA Raccomandazioni per la purificazione dei campioni di urina e dei tamponi con QIAamp Viral RNA Mini Kit Raccomandazioni per la purificazione dei tamponi e dei campioni di sperma con QIAamp DNA Mini Kit Raccomandazioni per la purificazione di campioni liofilizzati con QIAamp DNA Mini Kit Controllo interno Quantificazione Preparazione della PCR Programmazione di ABI PRISM SDS Programmazione di ABI PRISM 7000 SDS Preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR Creazione/selezione dei rilevatori Assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie...24 IT041006

3 Creazione del profilo della temperatura Come salvare la corsa di PCR Avvio della corsa di PCR Programmazione di ABI PRISM 7700 SDS Preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR Selezione dei coloranti di fluorescenza ed assegnazione del tipo di campione Assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie Creazione del profilo della temperatura Altre impostazioni importanti Come salvare la corsa di PCR Avvio della corsa di PCR Programmazione di ABI PRISM 7900HT SDS Preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR Creazione/selezione dei rilevatori Assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie Creazione del profilo della temperatura Come salvare la corsa di PCR Avvio della corsa di PCR Analisi dei dati Risoluzione dei problemi Specifiche Sensibilità Specificità Precisione Robustezza Riproducibilità Valutazione diagnostica Avvertenze speciali per l utilizzo del prodotto Riferimento bibliografico... 54

4 14. Spiegazione dei simboli... 55

5 per l'impiego con ABI PRISM 7000, 7700 e 7900HT Sequence Detection Systems (Applied Biosystems). Attenzione: non può essere utilizzato né in combinazione con il GeneAmp 5700 SDS né con il formato piastra 384 di ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Contenuto Etichettatura e contenuto List No. 3K reazioni List No. 3K reazioni Blu C. trachomatis Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Rosso Rosso Rosso Rosso C. trachomatis QS 1 1 x 10 4 cop/µl C. trachomatis QS 2 1 x 10 3 cop/µl C. trachomatis QS 3 1 x 10 2 cop/µl C. trachomatis QS 4 1 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Verde C. trachomatis IC 1 x 1000 µl 1 x 1000 µl Bianco Water (PCR grade) 1 x 1000 µl 1 x 1000 µl QS = Standard di quantificazione IC = Controllo interno Applied Biosystems è un marchio registrato e ABI PRISM Corporation negli USA e/o in altri paesi specifici. è un marchio di Applera 1

6 2. Conservazione I componenti di devono essere conservati a -20 C e possono essere utilizzati fino alla data di scadenza riportata sull etichetta. Evitare di scongelarli e congelarli più di due volte, poiché ciò potrebbe provocare una riduzione della sensibilità. In caso di utilizzo non regolare è necessario aliquotare i reagenti. Qualora fosse necessario conservare i componenti a +4 C, non superare l intervallo massimo di cinque ore. 3. Materiali e dispositivi addizionali richiesti Guanti da laboratorio senza talco Kit di isolamento del DNA (vedi 8.2 Isolamento del DNA) Pipette (regolabili) Puntali con filtro sterili per pipette Miscelatore vortex Centrifuga da banco con rotore per provette di reazione da 2 ml Centrifuga con rotore per piastre da microtitolazione (facoltativo) Piastra di reazione da 96 pozzetti/provette di reazione per misurazioni ottiche con i relativi materiali di chiusura ottici (vedi 8.5 Preparazione della PCR) Telaio di supporto bipartito da 96 pozzetti per l'impiego con provette di reazione ottiche (96-Well Tray/Retainer Set, N. cat , Applied Biosystems), vedi 8.5 Preparazione della PCR Compression pad per l'impiego con pellicole ottiche adesive (Optical Cover Compression Pads, N. cat , Applied Biosystems), vedi 8.5 Preparazione della PCR Applicatore per la chiusura delle piastre di reazione con l'impiego di pellicole ottiche adesive (Adhesive Seal Applicator Kit, N. cat , Applied Biosystems) L'utilizzo di provette di reazione per misurazioni ottiche con tappi a cupola è ammesso solo per ABI PRISM 7700 SDS e richiede la modifica del tempo di esposizione (vedi Programmazione di ABI PRISM 7700 SDS, Altre impostazioni importanti). 2

7 ABI PRISM 7000, 7700 o 7900HT SDS (Applied Biosystems) Attenzione: all'atto della messa in funzione degli strumenti è assolutamente necessario eseguire una taratura valida dei coloranti (Pure Spectra Component File) e del fondo (Background Component File). 4. Precauzioni generali L utente deve sempre attenersi a quanto segue: Utilizzare puntali con filtro sterili per pipette. Estrarre e conservare il materiale positivo (campioni, controlli, ampliconi) separatamente da tutti gli altri reagenti e aggiungerlo alla mix di reazione in luogo separato. Prima dell inizio del test scongelare tutti i componenti a temperatura ambiente. Una volta scongelati miscelare i componenti e sottoporli a breve centrifugazione. Operare rapidamente in ghiaccio o nel blocco di raffreddamento. 5. Informazioni sull agente patogeno I batteri del genere Chlamydia (C.) sono significativi a livello mondiale da un punto di vista epidemiologico. Il batterio Chlamydia trachomatis (sierotipi D-L) è tra i più comuni agenti patogeni di malattie a trasmissione sessuale (STD - sexually transmitted diseases). I 16 sierotipi del batterio C. trachomatis sono responsabili di varie malattie: i sierotipi A, B, Ba e C provocano il tracoma, una malattia recidiva e cronica, diffusa ai tropici, che colpisce le congiuntive e la cornea. I sierotipi D - K causano infezioni urogenitali a trasmissione sessuale, infezioni agli occhi nonché infezioni ai neonati trasmesse per via perinatale. I sierotipi LGV I - III sono responsabili del lymphogranuloma venereum, una malattia a trasmissione sessuale, che si riscontra prevalentemente ai tropici. Il tracoma si manifesta quasi esclusivamente nei paesi tropicali, in presenza di cattive condizione igieniche. È la malattia agli occhi più diffusa a livello 3

8 mondiale ed è la causa più frequente di cecità dopo la cataratta. Si suppone che gli individui infetti siano circa 150 milioni. Di questi, quasi 6 milioni sono diventati ciechi. Nei paesi industrializzati le clamidie sono i più comuni agenti patogeni batterici responsabili delle infezioni urogenitali. In Germania si contano ogni anno circa nuove infezioni genitali. L incidenza del lymphogranuloma venereum (linfogranuloma inguinale, malattia di Durand- Nicolas-Favre) sta diminuendo in tutto il mondo. Questa malattia a trasmissione sessuale è comunque ancora endemica in Asia, Africa, Sud America e parte dei Caraibi. 6. Principio della real-time PCR Per la diagnosi tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) vengono amplificate specifiche regioni del genoma dell agente patogeno. Per la real-time PCR la rilevazione richiede l impiego di sostanze fluorescenti, di solito associate a sonde oligonucleotidiche, che si legano specificatamente al prodotto di amplificazione. La rilevazione dell intensità di fluorescenza durante la real-time PCR consente di identificare e quantificare i prodotti senza dover riaprire le provette dei campioni al termine della PCR. 7. Descrizione del prodotto è un sistema pronto all uso per la rilevazione del DNA di C. trachomatis tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR) con ABI PRISM 7000, 7700 e 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). C. trachomatis Master contiene reagenti ed enzimi per l amplificazione specifica di una regione pari a 100 bp del genoma di C. trachomatis. La rilevazione dell'amplicone avviene misurando la fluorescenza FAM in ABI PRISM SDS. contiene anche un secondo sistema di amplificazione eterologo per la rilevazione di una possibile inibizione della PCR, che viene rilevato come Controllo interno (IC) misurando la fluorescenza VIC. In questo modo non viene ridotto il limite di rilevabilità della PCR analitica di C. trachomatis (vedi 11.1 Sensibilità). La dotazione comprende controlli positivi esterni (C. trachomatis QS 1-4), che 4

9 consentono di determinare la carica dell agente patogeno. A tale proposito consultare il paragrafo 8.4 Quantificazione. 8. Protocollo 8.1 Fase preanalitica: prelievo, conservazione e trasporto dei campioni Attenzione: tutti i campioni devono essere trattati come potenzialmente infettivi. Sono ammessi solo i seguenti campioni, per il cui prelievo, conservazione e trasporto devono essere rigorosamente rispettate le regole e le disposizioni specificate più sotto: 1. urina (donne e uomini). 2. tamponi oftalmici, endocervicali ed uretrali. 3. sperma Per garantire una buona qualità dei campioni, il trasporto al laboratorio d'analisi dovrebbe avvenire il più rapidamente possibile. I campioni devono essere trasportati alle condizioni di temperatura indicate di seguito Prelievo dei campioni 1. Campioni di urina Il / la paziente non deve avere urinato nelle due ore precedenti! Raccogliere ml dell urina di primo getto in un contenitore in polipropilene pulito senza conservanti. Non utilizzare campioni di urina che sono stati raccolti in contenitore con conservanti! Chiudere ed etichettare i contenitori di urina. Osservare le disposizioni per la conservazione ed il trasporto. 5

10 2. Tamponi Per il prelievo con tamponi oftalmici, endocervicali ed uretrali utilizzare i materiali indicati di seguito: Utilizzare solo tamponi con estremità in Dacron, rayon o alginato di calcio su spatola in plastica o altro materiale che non sia alluminio. Non utilizzare tamponi con spatola in legno o alluminio! Campioni oftalmici, endocervicali e uretrali possono essere trasportati in 1 3 ml di uno dei seguenti strumenti: AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.) Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation) Cervical Sampler (Digene Corporation) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) Venturi Transystem (adatto per aerobio e anaerobio), provette sterili per trasporto di tamponi (SARSTEDT AG & Co.) SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Inc.) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ClamTrans CTM (Bartels, Inc.) Tamponi per chlamydia (MAST DIAGNOSTICA) Lasciare il tampone nel mezzo di trasporto della coltura. Chiudere ed etichettare i contenitori dei campioni. Osservare le disposizioni riguardanti la conservazione ed il trasporto. Dopo aver eliminato la mucosa cervicale prelevare le cellule epiteliali cilindriche o squamose avvalendosi della procedura raccomandata. Biosafety in Microbiological Laboratories Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC)

11 3. Campioni di sperma Il prelievo del campione deve avvenire solo due o tre giorni dopo l ultima eiaculazione. Il campione di sperma deve essere prelevato nello stesso giorno nel quale viene spedito al laboratorio. Utilizzando i procedimenti di laboratorio di routine il campione di sperma può essere prelevato in uno dei seguenti modi: attraverso masturbazione direttamente in un contenitore per campioni sterile, pulito e asciutto. Assicurarsi che tutto il campione giunga direttamente nel contenitore. Se parte del campione dovesse perdersi annotarlo sul protocollo del prelievo. attraverso masturbazione utilizzando un preservativo. Dopo l eiaculazione rimuovere il preservativo. E importante chiuderne bene la parte superiore con un elastico per trattenere il campione di sperma nel preservativo. Porre di seguito il preservativo nel contenitore da trasporto. Importante: utilizzare solo contenitori per campioni senza conservanti e/o preservativi senza spermicidi e senza additivi artificiali (per esempio coloranti). Porre i campioni di sperma al buio da 30 a 45 minuti (per esempio in un cassetto o in un armadio) finché non risulta fluidificato. Subito dopo la fluidificazione congelare il campione in una provetta criogenica a -20 C o a una temperatura inferiore. Riferimenti bibliografici: 1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine ( 2) Andrology Institute of America ( 7

12 8.1.2 Conservazione dei campioni I risultati dei test possono essere compromessi dal congelamento di routine o da una conservazione prolungata dei campioni. 1. Campioni di urina Se l analisi dei campioni di urina avviene entro 24 ore, essi possono essere conservati a temperatura ambiente (20 C). Nel caso di un analisi entro sette giorni dal prelievo i campioni devono essere conservati refrigerati a 2-8 C. Campioni di urina che non vengano utilizzati entro sette giorni possono essere conservati a -20 C o temperatura inferiore per un periodo non superiore a 30 giorni. 2. Tamponi La conservazione dei campioni deve avvenire a una temperatura di 2-8 C. (Se i tamponi devono essere spediti ad un laboratorio, devono essere inviati quanto prima possibile dopo il prelievo, in accordo con le disposizioni del laboratorio per il trasporto di campioni di clamidie). I tamponi che non vengono analizzati subito dopo l'arrivo al laboratorio devono essere conservati a 2-8 C e utilizzati entro sette giorni. I tamponi che non possono essere utilizzati entro sette giorni dal prelievo, devono essere conservati a -20 C o temperatura inferiore ed essere analizzati entro 30 giorni dalla data del prelievo. 3. Campioni di sperma La conservazione dei campioni avviene a -20 C o a una temperatura inferiore. I campioni di sperma che non vengano analizzati subito dopo l arrivo in laboratorio devono essere conservati a -20 C o temperatura inferiore e essere analizzati entro 30 giorni dalla data del prelievo. 8

13 8.1.3 Trasporto dei campioni 1. Campioni di urina I campioni d urina da spedire devono essere conservati refrigerati a 2-8 C fino alla spedizione. I campioni devono essere spediti nel rispetto delle disposizioni locali e statali vigenti per il trasporto di materiali potenzialmente patogeni. 2. Tamponi I tamponi devono essere conservati refrigerati. Se i tamponi devono essere spediti in laboratorio, devono essere spediti quanto prima possibile dopo il prelievo, in accordo con le disposizioni del laboratorio per il trasporto dei campioni refrigerati. I campioni devono essere spediti nel rispetto delle disposizioni locali e statali vigenti per il trasporto di materiali potenzialmente patogeni. 3. Campioni di sperma Se i campioni di sperma devono essere spediti in laboratorio devono essere spediti lo stesso giorno del prelievo in accordo con le disposizioni del laboratorio per il trasporto di campioni di clamidie. Inoltre osservare che i campioni di sperma devono essere spediti congelati. I campioni devono essere spediti nel rispetto delle disposizioni locali e statali vigenti per il trasporto di materiali potenzialmente patogeni. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition,

14 8.2 Isolamento del DNA Sono disponibili kit per l isolamento del DNA di diversi produttori. Attenendosi al protocollo del produttore prescelto utilizzare la quantità di campione indicata e eseguire l isolamento del DNA conformemente alle istruzioni. Si raccomanda l utilizzo dei seguenti kit d isolamento: Campione urina, tamponi sperma, tamponi Kit di isolamento Numero di catalogo Produttore Carrier RNA * PureArt Viral RNA Mini Kit (50) artus incluso QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) QIAGEN incluso PureArt DNA Mini Kit (50) artus non incluso QIAamp DNA Mini Kit (50) QIAGEN non incluso Se il kit di isolamento prescelto non contiene carrier RNA, si raccomanda di aggiungere carrier RNA (RNA-Homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences) alla miscela campione/buffer di lisi. Il carrier RNA deve essere ad una concentrazione di 10 µg/ml di buffer di lisi soprattutto quando si estraggono acidi nucleici da fluidi corporei privi di cellule e/o da materiali a basso contenuto di DNA/RNA. Nell ambito dell isolamento del DNA con metodi automatici si raccomanda il seguente sistema: Campione Sistema di isolamento Kit di isolamento Produttore urina, tamponi ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation Per ricevere una lista dei materiali d uso e un protocollo validato per l isolamento, contattare l assistenza tecnica all indirizzo techsupport@artus-biotech.com Applied Biosystem, Foster City, U.S.A. Prodotto da QIAGEN GmbH, D Hilden, per artus GmbH. Produttore secondo il regolamento relativo ai dispositivi medici per la diagnostica in vitro: artus GmbH, D Hamburg. 10

15 Nelle procedure di isolamento del DNA che richiedono l utilizzo di buffer di lavaggio contenenti etanolo, assicurarsi di eseguire una fase di centrifuga aggiuntiva prima dell eluizione, onde rimuovere residui di etanolo. Ciò impedisce eventuali inibizioni della PCR. non deve essere utilizzato con procedure di isolamento del DNA basate su fenolo. Importante: il Controllo interno di può essere impiegato direttamente nella procedura di isolamento (vedi 8.3 Controllo interno) Raccomandazioni per la purificazione dei campioni di urina e dei tamponi con QIAamp Viral RNA Mini Kit. Il buffer AVL contenuto in QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) è stato sviluppato specificatamente per rendere inattivi gli inibitori contenuti nell urina. Perciò raccomandiamo espressamente l uso del protocollo di QIAamp Viral RNA Mini Kit per l estrazione del DNA cellulare, batterico o virale dall urina. Equilibrare i campioni a temperatura ambiente (15 25 C). Poiché nei campioni di urina spesso sono presenti solo minime quantità di batteri, raccomandiamo la concentrazione del materiale da analizzare. A questo scopo i campioni di urina (10-30 ml) vanno centrifugati per minuti a x g. Il surnatante va scartato e il pellet di nuovo interamente sospeso mediante vortex a intervalli (15 30 secondi) in µl 1 x PBS. Il volume di rispospensione dipende dalla quantità del campione iniziale. In caso di impiego di tamponi secchi agitarli per almeno un ora a temperatura ambiente in 500 µl 1 x PBS. I tamponi che sono stati conservati nel mezzo di trasporto devono essere miscelati accuratamente mediante vortex. Rimuovere delicatamente i tappi dalle provette facendo attenzione a non contaminare i guanti utilizzati. In caso di contaminazione sostituire i guanti con un nuovo paio prima di proseguire con il 11

16 campione successivo. Pigiare i tamponi contro la parete della provetta per far fuoriuscire il liquido. Prelevare con il tampone eventuali residui mucosi del campione e pigiare il tampone nuovamente contro la parete della provetta per far fuoriuscire il rimanente liquido. Allontanare e gettare via il tampone con gli eventuali residui mucosi ancora presenti. Per l isolamento del DNA dovrebbero essere utilizzati 140 µl di campione cosí trattati. Seguire le indicazioni del protocollo di QIAamp Viral RNA Mini Spin (QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) a partire dalla fase 1. Assicurarsi assolutamente di eseguire la fase opzionale 9a del protocollo per eliminare i residui di etanolo. Si raccomanda un volume di eluizione di 60 µl Raccomandazioni per la purificazione dei tamponi e dei campioni di sperma con QIAamp DNA Mini Kit. Equilibrare i campioni a temperatura ambiente (15 25 C). I tamponi che sono stati conservati nel loro mezzo di trasporto devono essere miscelati accuratamente mediante vortex. Rimuovere delicatamente i tappi delle provette e fare attenzione a non contaminare i guanti utilizzati. In caso di contaminazione sostituire i guanti con un nuovo paio prima di proseguire con il campione successivo. Pigiare i tamponi contro la parete della provetta per far fuoriuscire il liquido. Prelevare con il tampone eventuali residui mucosi dal campione e pigiare nuovamente il tampone contro la parete della provetta per far fuoriuscire il rimanente liquido. Allontanare e gettare via il tampone con gli eventuali residui mucosi ancora presenti. Precipitare (pellettare) i batteri mediante centrifugazione per 10 minuti a 5000 x g (7500 rpm). Risospendere il pellet batterico in 180 µl di buffer ATL (QIAamp DNA Mini Kit). I tamponi secchi vanno posti direttamente in una 12

17 provetta di reazione per microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugati mediante vortex per 15 secondi con 180 µl di buffer ATL. Per l estrazione del DNA dai campioni di sperma diluire, in una provetta di reazione per microcentrifuga da 1,5 ml, 60 µl di campione con 80 µl 1 x PBS. Dopo averlo miscelato accuratamente mediante vortex, pipettare 100 µl del prodotto diluito con 180 µl di buffer ATL. Miscelare per secondi mediante vortex a intervalli. Aggiungere 20 µl di protineasi K al campione, miscelare mediante vortex e incubarlo a 56 C per 1 12 ore. Durante l incubazione miscelare ogni tanto il campione mediante vortex o inserirlo in un termomixer. E necessario utilizzare la proteinasi K. La proteasi QIAGEN possiede un attività ridotta in presenza del buffer ATL. In caso di utilizzo di tamponi secchi ricordarsi di far fuoriuscire il liquido presente nel tampone pigiandolo contro la parete della provetta. Allontanare e buttare via il tampone. Attenersi al Tissue protocol (QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit, 02/2003, pag. 34) dalla fase 3. Assicurarsi assolutamente di aver eseguito la fase opzionale 7a del protocollo per eliminare residui di etanolo. Si raccomanda un volume di eluizione di 50 µl di buffer AE Raccomandazioni per la purificazione di campioni liofilizzati con QIAamp DNA Mini Kit Equilibrare i campioni a temperatura ambiente (15 25 C). Con lievi oscillazioni della mano risospendere accuratamente il campione liofilizzato in 500 µl 1 x PBS. Di seguito agitare il campione almeno 30 minuti a temperatura ambiente per discioglierlo completamente. Pipettare 200 µl del campione disciolto con 360 µl di buffer ATL in una provetta di reazione per microcentrifuga da 1,5 ml e miscelare accuratamente mediante vortex. 13

18 Aggiungere 20 µl di proteinasi K al campione. Mescolare mediante vortex e incubare a 56 C per 1 12 ore. Durante l incubazione miscelare ogni tanto il campione mediante vortex o inserirlo in un termomixer. E necessario utilizzare la proteinasi K. La proteasi QIAGEN possiede un attività ridotta in presenza del buffer ATL. Centrifugare brevemente le provette di reazione da 1,5 ml per evitare, durante l apertura, delle contaminazioni incrociate dovute a spruzzi di liquido di campione nella parte interna del tappo. Aggiungere 400 µl di buffer AL al campione, miscelare energicamente per 15 secondi in vortex e incubare il campione per 10 minuti a 70 C Aggiungere 400 µl di etanolo ( %) al campione e miscelare nuovamente in un vortex per 15 secondi. Porre delicatamente la miscela (compreso il precipitato) - senza bagnarne il bordo superiore - nella colonna QIAamp (in un collection tube di 2 ml). Chiudere il tappo e centrifugare per un minuto a 6000 x g (8000 rpm). Inserire di seguito la colonna QIAamp in un collection tube di 2 ml (contenuto nel kit) e eliminare il collection tube utilizzato e il filtrato. Ripetere questo punto ponendo nella colonna la soluzione rimanente dalla miscela di campione. Attenersi al Tissue protocol (QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit, 02/2003, pag. 34) dalla fase 6. Assicurarsi assolutamente di aver eseguito la fase opzionale 7a del protocollo per eliminare residui di etanolo. Si raccomanda un volume di eluizione di 50 µl di buffer AE. 14

19 8.3 Controllo interno La dotazione comprende un Controllo interno (C. trachomatis IC), che consente di verificare sia la procedura di isolamento del DNA sia una possibile inibizione della PCR (vedi Fig. 1). Per tale applicazione durante l isolamento aggiungere il Controllo interno in un rapporto di 0,1 µl per 1 µl del volume di eluizione. Ad esempio, se si utilizza QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) e il DNA è diluito in 200 µl di buffer AE, aggiungere 20 µl di Controllo interno. Se l eluizione avviene in 100 µl, aggiungere il corrispondente volume di 10 µl. La quantità del Controllo interno impiegato dipende solo dal volume di eluizione. Considerare che il Controllo interno deve essere aggiunto alla miscela di buffer di lisi e di campione. Non aggiungerlo direttamente al buffer di lisi o al campione! Per verificare che l isolamento sia avvenuto con successo, il valore Ct del Controllo interno in ABI PRISM 7000 SDS, in ABI PRISM 7700 SDS e ABI PRISM 7900HT SDS deve essere Ct = 22 ± 3 (threshold: 0,05). La dispersione indicata di massimo 3 valori di Ct è dovuta a una varianza dello strumento e nell isolamento. Uno scarto maggiore indica problemi nell isolamento. In questo caso esso deve essere verificato e eventualmente nuovamente validato. In caso di domande o problemi contattare l assistenza tecnica techsupport@artus-biotech.com In alternativa è possibile utilizzare il Controllo interno esclusivamente per il controllo di una possibile inibizione della PCR (vedi Fig. 2). A tale scopo aggiungere per ogni reazione 0,5 µl di Controllo interno direttamente a 15 µl di C. trachomatis Master. Per ogni reazione di PCR utilizzare 15 µl di Master Mix, preparata come descritto sopra, quindi aggiungere 10 µl di campione purificato. Se si desidera effettuare una corsa di PCR per più campioni, aumentare le quantità di C. trachomatis Master e del Controllo interno in base al numero dei campioni (vedi 8.5 Preparazione della PCR). L aumento di volume determinato dall aggiunta del Controllo interno durante la preparazione della PCR è trascurabile. La sensibilità del sistema di rilevazione non viene influenzata. 15

20 8.4 Quantificazione Gli Standard di quantificazione in dotazione (C. trachomatis QS 1-4) vengono trattati come campioni già purificati e se ne utilizza lo stesso volume (10 µl). Per creare una curva standard in un ABI PRISM Sequence Detection System, utilizzare tutti e quattro gli Standard di quantificazione in dotazione e definirli come standard indicando le rispettive concentrazioni (vedi 8.6 Programmazione di ABI PRISM SDS). Non è possibile importare curve standard da corse precedenti con il software di ABI PRISM 7000, 7700 e 7900HT SDS. Attenzione: gli Standard di quantificazione vengono definiti in copie/µl. Per convertire in copie/ml di campione i valori ottenuti con l aiuto della curva standard, utilizzare la formula seguente: risultato (copie / ml) = risultato (copie / µl) x volume di eluizione (µl) volume del campione (ml) Se prima dell estrazione degli acidi nucleici il campione è stato concentrato, per esempio attraverso centrifugazione, nella formula sopraindicata utilizzare il volume campione originario. Importante: per semplificare l analisi quantitativa dei sistemi in ABI PRISM 7000 SDS consultare la guida Technical Note for Quantitation on ABI PRISM 7000 SDS all indirizzo Internet 16

21 8.5 Preparazione della PCR Preparare il numero di provette di reazione necessario per le reazioni programmate e/o la piastra di reazione da 96 pozzetti. La tabella riportata di seguito fornisce un elenco dei materiali raccomandati: Articolo Denominazione Numero di catalogo Produttore Telaio di supporto Compression pad Piastra ottica di reazione da 96 pozzetti 96-Well Optical Reaction Plate Applied Biosystems no - Pellicola adesiva ottica Optical Adhesive Covers Applied Biosystems - sì Provette di reazione ottiche ABI PRISM Optical Tubes, 8 Tubes/Strip Applied Biosystems sì - Provette di reazione ottiche MicroAmp Optical Tubes N Applied Biosystems sì - Tappi ottici (piatti) ABI PRISM Optical Caps, 8 Caps/Strip Applied Biosystems - no Attenzione: l'impiego di provette di reazione per misurazioni ottiche con tappi a cupola è ammesso solo per lo strumento ABI PRISM 7700 SDS e richiede una regolazione del tempo di esposizione (vedi Programmazione di ABI PRISM 7700 SDS, Altre impostazioni importanti). Nella preparazione della PCR assicurarsi per ciascuna corsa di PCR siano eseguiti parallelamente almeno uno Standard di quantificazione e un controllo negativo (Water, PCR grade). Per la creazione di una curva standard, utilizzare per ogni PCR tutti gli Standard di quantificazione forniti (C. trachomatis QS 1-4). Prima di iniziare il test, tutti i reagenti devono essere scongelati completamente a temperatura ambiente, miscelati con cura In caso di impiego del telaio di supporto bipartito è necessario aprire le provette di reazione sia all'atto dell'inserimento che dell'estrazione. Per evitare contaminazioni da ciò dipendenti, utilizzare solo la parte inferiore del telaio di supporto. 17

22 (pipettamento ripetuto oppure breve agitazione in un vortex) ed infine centrifugati. Se si desidera utilizzare il Controllo interno per controllare sia la procedura di isolamento che una possibile inibizione della PCR, il Controllo interno è stato già aggiunto alla procedura di purificazione (vedi 8.3 Controllo interno). In tal caso attenersi al seguente schema di pipettamento (vedi anche panoramica schematica, Fig. 1): 1. Preparazione della Master Mix 2. Preparazione reazione PCR Numero di campioni 1 12 C. trachomatis Master 15 µl 180 µl C. trachomatis IC 0 µl 0 µl volume totale 15 µl 180 µl Master Mix 15 µl 15 µl ciascuno campione 10 µl 10 µl ciascuno volume totale 25 µl 25 µl ciascuno Se si desidera utilizzare il Controllo interno esclusivamente per la verifica di un inibizione della PCR, è necessario aggiungerlo direttamente a C. trachomatis Master. In tal caso attenersi al seguente schema di pipettamento (vedi anche panoramica schematica, Fig. 2): 1. Preparazione della Master Mix 2. Preparazione reazione PCR Numero di campioni 1 12 C. trachomatis Master 15 µl 180 µl C. trachomatis IC 0,5 µl 6 µl volume totale 15,5 µl 186 µl Master Mix 15 µl 15 µl ciascuno campione 10 µl 10 µl ciascuno volume totale 25 µl 25 µl ciascuno Pipettare in ogni provetta e/o in ogni pozzetto della piastra di reazione da 96 pozzetti 15 µl della Master Mix. Quindi aggiungere 10 µl di DNA estratto. Accertarsi che le due soluzioni vengano ben miscelate con pipettamento L aumento di volume determinato dall aggiunta del Controllo interno durante la preparazione della PCR è irrilevante. La sensibilità del sistema di rilevazione non viene influenzata. 18

23 ripetuto. Chiudere le provette di reazione con i rispettivi tappi e/o in caso di utilizzo di una piastra di reazione da 96 pozzetti usare in alternativa una pellicola di chiusura ottica (optical adhesive covers, Applied Biosystems). Per raccogliere il volume di reazione sul fondo della provetta e/o della piastra, centrifugare le provette di reazione (in un rack di conservazione specifico per provette PCR) e/o la piastra di reazione da 96 pozzetti in una centrifuga con rotore per piastre da microtitolazione per 30 secondi a 1780 x g (4000 rpm.). Se non è disponibile una centrifuga di questo genere, preparare le reazioni di PCR accertandosi di pipettare sul fondo delle provette di reazione o delle unità di reazione (pozzetti) sia la Master Mix che il volume campione. Conservare i preparati della reazione a +4 C finché lo strumento ABI PRISM SDS non è programmato (vedi 8.6 Programmazione di ABI PRISM SDS) e quindi trasferirli nello strumento. Attenzione: In caso di utilizzo di provette di reazione ottiche con tappi ottici inserire sempre un telaio di supporto (96-Well Tray/Retainer Set, Applied Biosystems) nello strumento (ABI PRISM 7000, 7700 e 7900HT SDS). In caso di utilizzo del telaio di supporto bipartito è necessario aprire le provette di reazione sia per l'inserimento che per l'estrazione. Per evitare contaminazioni conseguenti, utilizzare solo la parte inferiore del telaio di supporto. L'impiego di una piastra ottica di reazione da 96 pozzetti in combinazione con pellicole adesive ottiche richiede l'applicazione di un compression pad (Optical Cover Compression Pads, Applied Biosystems). 19

24 Aggiunta del Controllo interno alla procedura di purificazione purificazione miscela di buffer di lisi/campione + 0,1 µl di IC* per 1 µl di volume di eluizione 10 µl di campione purificato* 15 µl di Master* piastra/provette di reazione ottiche ABI PRISM SDS Fig. 1: schema del ciclo di lavoro per il controllo dell isolamento del DNA e dell inibizione della PCR. * Per ogni fase del pipettamento è necessario che le soluzioni da utilizzare vengano completamente scongelate, ben miscelate e sottoposte a breve centrifugazione. 20

25 Aggiunta del Controllo interno alla soluzione Master 0,5 µl di IC* 15 µl di Master* purificazione 15,5 µl di Master Mix* 10 µl di campione purificato* 15 µl di Master Mix* piastre/provette di reazione ottiche ABI PRISM SDS Fig. 2: schema del ciclo di lavoro per il controllo dell inibizione della PCR. * Per ogni fase del pipettamento è necessario che le soluzioni da utilizzare vengano completamente scongelate, ben miscelate e sottoposte a breve centrifugazione. 21

26 8.6 Programmazione di ABI PRISM SDS Prima di avviare la corsa di PCR, il software di ABI PRISM 7000, 7700 e 7900HT Sequence Detection Systems (SDS) necessita di alcune informazioni aggiuntive. La metodica applicata nella programmazione cambia enormemente da uno strumento all altro; pertanto segue una trattazione in capitoli separati Programmazione di ABI PRISM 7000 SDS Per rilevare il DNA di C. trachomatis creare nel proprio ABI PRISM 7000 SDS un profilo rispettando le sei fasi operative riportate di seguito ( ). Tutte le indicazioni fanno riferimento a ABI PRISM 7000 SDS Software Version Per i dettagli riguardanti la programmazione di ABI PRISM 7000 SDS consultare l ABI PRISM 7000 SDS User Guide. Per una panoramica migliore le impostazioni da effettuare sono evidenziate nelle figure da riquadri neri Preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR Selezionare in ABI PRISM 7000 SDS la voce di menu New in File ed inserire per il nuovo documento le seguenti impostazioni di base (Fig. 3). Un template precedentemente salvato (SDS Template [*.sdt]) è a disposizione nella lista Template oppure selezionandolo con la funzione Browse (vedi Come salvare la corsa di PCR). Confermare i dati inseriti (OK). Fig. 3: preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR (New Document). 22

27 Creazione/selezione dei rilevatori Con l'ausilio del sottomenu Detector Manager che si trova in Tools assegnare al documento i rispettivi coloranti di rilevazione. Per la rilevazione del DNA di C. trachomatis ed anche del Controllo interno con l'impiego del devono essere definiti i reporter/quencher indicati nella tabella che segue: Rilevazione Reporter Quencher DNA di C. trachomatis FAM TAMRA Controllo interno (C. trachomatis IC) VIC none Per creare questi rilevatori selezionare l'opzione File che si trova in basso a sinistra nel Detector Manager e di seguito l opzione New. Fig. 4: creazione del rilevatore specifico di C. trachomatis (Detector Manager). Fig. 5: creazione del rilevatore specifico del Controllo interno (Detector Manager). Per la rilevazione del DNA di C. trachomatis definire nella finestra visualizzata (analogamente a Fig. 4 e Fig. 5) la combinazione reporter/quencher FAM/TAMRA, mentre per la rilevazione del Controllo interno selezionare la combinazione VIC/none. Con la conferma dei dati inseriti (OK) si torna al Detector Manager. Evidenziare i rilevatori appena creati e trasferire al Well Inspector ogni selezione, facendo clic sull'opzione Add to Plate Document, (vedi Fig. 6). Chiudere la finestra (Done). 23

28 Fig. 6: selezione dei rilevatori (Detector Manager) Assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie Aprire l'opzione Well Inspector che si trova in View. In questo modo si ritrovano i rilevatori selezionati in (vedi Fig. 7). Fig. 7: assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie (Well Inspector). Selezionare le posizioni della piastra destinate alla rilevazione del DNA di C. trachomatis. Assegnare a queste posizioni i rilevatori selezionati attivando con un clic l'opzione Use dei due rilevatori. Compare un piccolo segno di spunta. Per l'identificazione delle singole miscele di reazione, selezionare la posizione corrispondente sulla piastra e registrare il nome in Sample Name. E importante ricordare che le miscele con Sample Name identico e assegnazione di rilevatore identico vengono identificate dal software come 24

29 replica e, rispetto alla lora carica patogena quantificata, ne viene calcolata la media. Selezionare quindi per ogni tipo di campione la rispettiva funzione (Task) in base alla tabella riportata di seguito: Tipo di campione Funzione (Task) Concentrazione (Quantity) Reporter Quencher campione Unknown - FAM TAMRA controllo negativo NTC - FAM TAMRA standard Standard vedi 1. Contenuto FAM TAMRA Per creare una curva standard utilizzare per ogni corsa di PCR tutti gli Standard di quantificazione in dotazione (C. trachomatis QS 1-4) ed inserire le rispettive concentrazioni (vedi 1. Contenuto) per ogni singolo standard (Quantity). Occorre ricordare che per una corsa di PCR con deve essere impostato ROX come riferimento passivo (Passive). La distribuzione uniforme del colorante ROX su tutte le reazioni di PCR di un lotto mediante miscelazione di C. trachomatis Master garantisce l'identificazione e il calcolo di variazioni tube-to-tube (differenze di fluorescenza tra le diverse reazioni di PCR) grazie al Sequence Detection Software (normalizzazione) Creazione del profilo della temperatura Per inserire il profilo della temperatura passare nel software dal livello Setup al livello Instrument. Inserire conformemente a Fig. 8 il profilo di temperatura valido per rilevare il DNA di C. trachomatis. Per eliminare la fase da 50 C memorizzata nelle preimpostazioni, evidenziarla con l'impiego del tasto sinistro del mouse tenendo contemporaneamente premuto il tasto Shift, quindi cancellarla con il tasto Backspace. Controllare che il volume di reazione sia impostato su 25 µl. L'opzione 9600 Emulation dovrebbe essere attivata, mentre le preimpostazioni di Auto Increment dovrebbero rimanere invariate (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 25

30 Fig. 8: creazione del profilo della temperatura Come salvare la corsa di PCR A questo punto le impostazioni inserite (Setup) possono essere salvate come maschera ed essere quindi nuovamente utilizzate per applicazioni successive in forma invariata o modificata. Salvando le impostazioni come SDS Template (*.sdt) nella cartella Template Directory (disco locale [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates creato dalla Applied Biosystems), questo file è direttamente selezionabile dall'elenco a tendina del Template all'interno della finestra New Document. I modelli salvati in altre cartelle devono essere aperti mediante Browse. Prima di avviare la corsa di PCR, accertarsi di salvarla di nuovo come SDS Document (*.sds). In questo modo si garantisce che i dati raccolti nel corso della PCR vengano salvati. 26

31 Avvio della corsa di PCR Avviare la corsa di PCR selezionando l'opzione Start nella voce di menu Instrument o il campo Start al livello Instrument. 27

32 8.6.2 Programmazione di ABI PRISM 7700 SDS Per rilevare il DNA di C. trachomatis creare nel proprio ABI PRISM 7700 SDS un profilo rispettando le sette fasi operative riportate di seguito ( ). Tutte le indicazioni fanno riferimento a ABI PRISM 7700 SDS Software Version Per i dettagli riguardanti la programmazione di ABI PRISM 7700 SDS consultare l ABI PRISM 7700 SDS User s Manual. Per una panoramica migliore le impostazioni da effettuare sono evidenziate nelle figure da riquadri neri Preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR Selezionare in ABI PRISM 7700 SDS la voce di menu New Plate in File ed inserire per il nuovo documento le seguenti impostazioni di base (Fig. 9). Confermare i dati inseriti (OK). Fig. 9: preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR (New Plate). 28

33 Selezione dei coloranti di fluorescenza ed assegnazione del tipo di campione Con l'impiego del Sample Type Setup (Livello Setup: Sample Type/Sample Type Setup) assegnare al documento i rispettivi coloranti di rilevazione e il tipo di campione corrispondente. Per la rilevazione del DNA di C. trachomatis ed anche del Controllo interno con l'impiego di devono essere definiti i reporter/quencher indicati nella tabella seguente: Rilevazione Reporter Quencher DNA di C. trachomatis FAM TAMRA Controllo interno (C. trachomatis IC) VIC TAMRA Per misurare il DNA di C. trachomatis con l'impiego di selezionare il colorante reporter FAM analogamente a quanto indicato nella tabella. La stessa procedura è valida per gli standard (STND), i campioni (UNKN) ed anche per i controlli negativi (UNKN). Per la misurazione del Controllo interno (IPC+) provvedere alla rispettiva definizione come reporter VIC. Impostare come quencher TAMRA. L'assegnazione dei coloranti e dei tipi di campioni nella finestra Sample Type Setup è illustrata in Fig. 10. Fig. 10: selezione dei coloranti di fluorescenza ed assegnazione del tipo di campione (Sample Type Setup). 29

34 L'assegnazione del tipo di campione ad una rispettiva funzione (Acronym) avviene in base alla tabella riportata di seguito: Tipo di campione Funzione (Acronym) Concentrazione (Quantity) Reporter Quencher campione UNKN - FAM TAMRA controllo negativo UNKN - FAM TAMRA standard STND vedi 1. Contenuto FAM TAMRA Assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie Per l'assegnazione dei rilevatori e dei tipi di campioni alle singole posizioni della piastra selezionare i rispettivi campi. Aprire al livello Setup la finestra di dialogo Dye Layer ed effettuare l'assegnazione ai rispettivi reporter. Attivare il menu pop-up Sample Type; in questo modo è possibile ritrovare nella lista visualizzata i tipi di campioni assegnati al reporter nel Sample Type Setup (vedi Fig. 11). Selezionare il tipo di campione adeguato (vedi tabella in ) e determinare, avvalendosi dei menu Dye Layers e Sample Type, l'assegnazione alle restanti posizioni della piastra. Nel campo Sample Name è possibile assegnare un nome a ciascun campione. Dei campi definiti come Replicate (inserimento del nome del campione di riferimento nella colonna Replicate) il software calcola la media dei rispettivi valori della carica patogena quantificata e ne calcola anche la rispettiva deviazione standard. Fig. 11/12: assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie. Per creare una curva standard utilizzare per ogni corsa di PCR tutti gli Standard di quantificazione in dotazione (C. trachomatis QS 1-4) ed inserire 30

35 le rispettive concentrazioni (vedi 1. Contenuto) per ogni singolo standard (Quantity, vedi Fig. 12). Tuttavia ciò è possibile solo se le posizioni occupate con gli standard sono state precedentemente definite come tali con l'impiego del menu Sample Type Creazione del profilo della temperatura Per inserire il profilo della temperatura passare al menu Thermal Cycler Conditions nella videata Setup. Inserire conformemente a Fig. 13 il profilo della temperatura valido per la rilevazione del DNA di C. trachomatis. Controllare che il volume di reazione sia impostato su 25 µl. Le preimpostazioni dei tempi Ramp e di Auto Increment rimangono immutate (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). Fig. 13: creazione del profilo della temperatura. Nel menu Thermal Cycler Conditions è disponibile anche l'opzione Show Data Collection. Selezionando questa opzione si passa alla finestra illustrata in Fig. 14. Ogni singola temperatura di Ramp e di Plateau è provvista di un simbolo di acquisizione dei dati (Data Collection Icon), che mostra l'acquisizione dei dati nel momento presente della corsa. Facendo clic 31

36 rimuovere tutti i simboli fino a quello corrispondente al momento della fase Annealing-Extension (Stage2/Step2), per evitare inutili misurazioni della fluorescenza e così da mantenere quanto più basso possibile il tempo di corsa totale e la quantità di dati. Fig. 14: raccolta dati (Data Collection) Altre impostazioni importanti Per impostare il tempo di esposizione (eccitazione dei coloranti di fluorescenza) ed anche per selezionare i file Pure Spectra/Background passare dal livello Setup al livello Analysis. Selezionare la sottovoce Advanced Options ora attivata che si trova nel menu Instrument sotto Diagnostics. Eseguire le impostazioni in base alla Fig. 15. Disattivando la funzione opzionale Spectra Components (Analysis), la nuova analisi delle corse già analizzate utilizza automaticamente i file di taratura attuali, che sono stati archiviati nella cartella Spectra Components al momento della generazione dei dati. Per effettuare un'analisi di corse precedenti con l'impiego di Spectra Components di nuova lettura, attivare tutti e due i campi. Occorre ricordare che per una corsa di PCR con deve essere impostato ROX come riferimento passivo (Reference). La distribuzione 32

37 uniforme del colorante ROX su tutte le reazioni di PCR di un lotto mediante miscelazione di C. trachomatis Master garantisce l'identificazione e il calcolo di variazioni tube-to-tube (differenze di fluorescenza tra le diverse reazioni di PCR) grazie al Sequence Detection Software (normalizzazione). Attenzione: in caso di utilizzo di piastre da 96 pozzetti per misurazioni ottiche con pellicole ottiche adesive (optical adhesive covers) o di provette di reazione ottiche con tappi piatti, il tempo di esposizione (Exposure Time) è di dieci millisecondi. In caso di utilizzo di provette di reazione ottiche con tappi a cupola, commutare il tempo su 25 millisecondi. Fig. 15: altre impostazioni importanti (Advanced Options). 33

38 Come salvare la corsa di PCR A questo punto le impostazioni inserite (Setup) possono essere salvate come maschera e quindi nuovamente utilizzate per applicazioni successive in forma invariata o modificata. A tale scopo salvare questo file in Stationary File Format. Prima di iniziare la corsa di PCR attualmente programmata assicurarsi di salvarla nuovamente in Normal File Format. In questo modo si garantisce che i dati raccolti nel corso della PCR vengano salvati Avvio della corsa di PCR Avviare la corsa di PCR selezionando l'opzione Run sotto la voce di menu Instrument o il campo Run al livello Analysis. 34

39 8.6.3 Programmazione di ABI PRISM 7900HT SDS Per rilevare il DNA di C. trachomatis creare nel proprio ABI PRISM 7900HT SDS un profilo rispettando le sei fasi operative riportate di seguito ( ). Tutte le indicazioni fanno riferimento a ABI PRISM 7900HT SDS Software Version 2.1. Per dettagli sulla programmazione di ABI PRISM 7900HT SDS consultare l ABI PRISM 7900HT SDS User Guide. Per una panoramica migliore le impostazioni da effettuare sono evidenziate nelle figure da riquadri neri Preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR Selezionare in ABI PRISM 7900HT SDS la voce di menu New in File ed inserire per il nuovo documento le seguenti impostazioni di base (Fig. 16). Un template precedentemente salvato (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) è a disposizione nella lista Template oppure selezionandolo con la funzione Browse (vedi Come salvare la corsa di PCR). Confermare i dati inseriti (OK). Attenzione: non può essere utilizzato con il formato piastra 384 di ABI PRISM 7900HT SDS. Fig. 16: preimpostazioni per la creazione di una nuova corsa di PCR (New Document). 35

40 Creazione/selezione dei rilevatori Con l'ausilio del sottomenu Detector Manager che si trova in Tools (in alternativa: selezionare livello Setup/funzione Add Detector) assegnare al documento i rispettivi coloranti di rilevazione. Per la rilevazione del DNA di C. trachomatis ed anche del Controllo interno con l'impiego del devono essere definiti i reporter/quencher indicati nella tabella seguente: Rilevazione Reporter Quencher DNA di C. trachomatis FAM TAMRA Controllo interno (C. trachomatis IC) VIC Non Fluorescent Per creare questi rilevatori selezionare l'opzione New che si trova in basso a sinistra nel Detector Manager. Fig. 17: creazione del rilevatore specifico di C. trachomatis (Detector Manager). Fig. 18: creazione del rilevatore specifico del Controllo interno (Detector Manager). Per la rilevazione del DNA di C. trachomatis definire nella finestra visualizzata (analogamente a Fig. 17 e Fig. 18) la combinazione reporter/quencher FAM/TAMRA, mentre per la rilevazione del Controllo interno selezionare la combinazione VIC/Non Fluorescent. Con la conferma dei dati inseriti (OK) si torna al Detector Manager. Evidenziare i rilevatori appena creati e trasferire 36

41 ogni selezione facendo clic sull'opzione Copy to Plate Document al livello Setup (vedi Fig. 19). Chiudere la finestra (Done). Fig. 19: selezione dei rilevatori (Detector Manager) Assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie Dopo la chiusura del Detector Manager (Done) i rilevatori selezionati in possono essere ritrovati al livello Setup (Well Inspector), elencati in forma di tabella (vedi Fig. 20). Fig. 20: assegnazione alle posizioni della piastra delle informazioni necessarie. Selezionare le posizioni della piastra destinate alla rilevazione del DNA di C. trachomatis. Assegnare a queste posizioni i rilevatori selezionati e contemporaneamente attivare con un clic l'opzione Use dei due rilevatori. Viene visualizzata una crocetta. Per la denominazione delle singole miscele di reazione selezionare la posizione corrispondente sulla piastra e registrare il nome in Sample Name. E importante ricordare che le miscele con Sample Name identico e assegnazione di rivelatore identico vengono identificate dal software come replica e, rispetto alla loro carica patogena quantificata, ne 37

42 viene calcolata la media. Selezionare quindi per ogni tipo di campione la rispettiva funzione (Task) in base alla tabella riportata di seguito: Tipo campione Funzione (Task) Concentrazione (Quantity) Reporter Quencher campione Unknown - FAM TAMRA controllo negativo NTC - FAM TAMRA standard Standard vedi 1. Contenuto FAM TAMRA Per creare una curva standard utilizzare per ogni corsa di PCR tutti gli Standard di quantificazione in dotazione (C. trachomatis QS 1-4) ed inserire le rispettive concentrazioni (vedi 1. Contenuto) di ogni singolo standard (Quantity). Occorre ricordare che per una corsa di PCR con deve essere impostato ROX come riferimento passivo (Passive Reference). La distribuzione uniforme del colorante ROX su tutte le reazioni di PCR di un lotto mediante miscelazione di C. trachomatis Master garantisce l'identificazione e il calcolo di variazioni tube-to-tube (differenze di fluorescenza tra le diverse reazioni di PCR) grazie al Sequence Detection Software (normalizzazione) Creazione del profilo della temperatura Per inserire il profilo della temperatura passare nel software dal livello Setup al livello Instrument. Inserire conformemente a Fig. 21 il profilo di temperatura valido per rilevare il DNA di C. trachomatis. Controllare che il volume di reazione sia impostato su 25 µl. L'opzione 9600 Emulation dovrebbe essere attivata, mentre le preimpostazioni di tempo Ramp e di Auto Increment rimanere invariate (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 38

43 Fig. 21: creazione del profilo della temperatura. Al livello Instrument si trova anche l'opzione Data Collection. Selezionando questa opzione si passa alla finestra illustrata in Fig. 22. Ogni singola temperatura di Ramp e di Plateau è provvista di un simbolo di acquisizione dei dati (Data Collection Icon), che dimostra l'acquisizione dei dati nel momento presente della corsa. Rimuovere tutti i simboli fino a quello corrispondente al momento della fase di Annealing-Extension (Stage2/Step2), per evitare inutili misurazioni della fluorescenza e così da mantenere quanto più basso possibile il tempo di corsa totale e la quantità di dati. 39

44 Fig. 22: raccolta dati (Data Collection) Come salvare la corsa di PCR A questo punto le impostazioni inserite (Setup) possono essere salvate come maschera e quindi nuovamente utilizzate per applicazioni successive in forma invariata o modificata. Salvando le impostazioni come ABI PRISM SDS Template Document (*.sdt) nella cartella Template Directory ([D:]\Program Files\Applied Biosystems\SDS 2.1\Templates creata dalla Applied Biosystems), questo file è direttamente selezionabile dall'elenco Template all'interno della finestra New Document. I modelli salvati in altre cartelle devono essere aperti mediante Browse. Prima di avviare la corsa attuale di PCR accertarsi di salvarla di nuovo come ABI PRISM SDS Document (*.sds). In questo modo si garantisce che i dati raccolti nel corso della PCR vengano salvati Avvio della corsa di PCR Avviare la corsa di PCR selezionando l'opzione Start sotto la voce di menu Instrument o il campo Run al livello Analysis. 40

45 9. Analisi dei dati All'atto della messa in funzione degli strumenti è indispensabile eseguire una taratura attuale dei coloranti (Pure Spectra Component File) e del fondo (Background Component File). Questi file di taratura servono per effettuare un calcolo esatto dei risultati come di seguito indicato: tutti i segnali di disturbo, dipendenti dallo strumento e che influenzano la misurazione, sono eliminati dal Sequence Detection Software di ABI PRISM Sequence Detection System con l'impiego del Background Component File. Inoltre, con le analisi Multicolor, compaiono interferenze tra gli spettri d'emissione dei singoli coloranti di fluorescenza. Il software di ABI PRISM SDS compensa tali interferenze calcolando i dati dello spettro dei singoli coloranti, salvati nel Pure Spectra Component File. Con l'impiego dei Pure Spectra Components il software provvede anche ad assegnare ai rilevatori programmati i dati di fluorescenza, raccolti sull'intero spettro misurabile nel corso della PCR. In seguito i dati di fluorescenza rilevati, appartenenti ai singoli coloranti, vengono divisi per il segnale di riferimento passivo (ROX) al fine di calcolare le variazioni tube-to-tube (differenze di fluorescenza tra le diverse reazioni di PCR). I segnali normalizzati in questo modo possono essere analizzati con l'aiuto dell'amplification Plot. Il back-up dei file di taratura utilizzati per l analisi di una corsa di PCR è eseguito automaticamente. In caso di mancata installazione dei file di taratura, creare i file attenendosi alle istruzioni fornite dalla ABI PRISM SDS User Guide/Manual. In caso di avvenuta integrazione di più di un sistema PCR nella corsa di PCR (osservare il profilo della temperatura!), procedere ad un'analisi singola dei sistemi di analisi. Campioni con denominazione identica (Sample Name) e assegnazione di rilevatore identico vengono identificati automaticamente dall ABI PRISM 7000 e 7900HT SDS software come replica e, rispetto alla loro carica patogena quantificata, ne viene calcolata la media. 41

46 Si possono ottenere i seguenti risultati: 1. Viene rilevato un segnale di fluorescenza FAM. Il risultato dell analisi è positivo: il campione contiene DNA di C. trachomatis. In questo caso la rilevazione di un segnale di fluorescenza VIC (Controllo interno) è irrilevante, dal momento che alte concentrazioni iniziali del DNA di C. trachomatis (segnale di fluorescenza FAM positivo) possono portare ad un segnale di fluorescenza del Controllo interno ridotto o assente (competizione). Se dopo il ciclo 40 appare un segnale positivo, si raccomanda di ripetere la PCR. Se il risultato è nuovamente positivo, il campione deve considerarsi positivo. Se il risultato è negativo non può essere fatta alcuna diagnosi definitiva. In questo caso si raccomanda una ulteriore purificazione del campione. 2. Non viene rilevato alcun segnale di fluorescenza FAM, ma solo un segnale di fluorescenza VIC (segnale del Controllo interno). Nel campione non è possibile rilevare alcun DNA di C. trachomatis. Il risultato dell analisi può essere quindi considerato negativo. In caso di PCR negativa per C. trachomatis il segnale del Controllo interno rilevato esclude la possibilità d inibizione della PCR. 3. Non viene rilevato alcun segnale di fluorescenza FAM né alcun segnale di fluorescenza VIC. Non è possibile formulare una diagnosi. Per informazioni riguardanti le origini degli errori e le possibili soluzioni, consultare 10. Risoluzione dei problemi. Nelle figure 23 / 24 (ABI PRISM 7000 SDS), 25 / 26 (ABI PRISM 7700 SDS) e 27 / 28 (ABI PRISM 7900HT SDS) sono riportati esempi di reazioni positive e negative della PCR. 42

47 Fig. 23: rilevazione degli Standard di quantificazione (C. trachomatis QS 1-4) mediante la rilevazione di un segnale di fluorescenza FAM (ABI PRISM 7000 SDS). NTC: non-template control (controllo negativo). Fig. 24: rilevazione del Controllo interno (IC) mediante la rilevazione di un segnale di fluorescenza VIC (ABI PRISM 7000 SDS) con contemporanea amplificazione degli Standard di quantificazione (C. trachomatis QS 1-4). NTC: non-template control (controllo negativo). 43

48 Fig. 25: rilevazione degli Standard di quantificazione (C. trachomatis QS 1-4) mediante la rilevazione di un segnale di fluorescenza FAM (ABI PRISM 7700 SDS). NTC: non-template control (controllo negativo). Fig. 26: rilevazione del Controllo interno (IC) mediante la rilevazione di un segnale di fluorescenza VIC (ABI PRISM 7700 SDS) con contemporanea amplificazione degli Standard di quantificazione (C. trachomatis QS 1-4). NTC: non-template control (controllo negativo). 44

49 Fig. 27: rilevazione degli Standard di quantificazione (C. trachomatis QS 1-4) mediante la rilevazione di un segnale di fluorescenza FAM (ABI PRISM 7900HT SDS). NTC: non-template control (controllo negativo). Fig. 28: rilevazione del Controllo interno (IC) mediante la rilevazione di un segnale di fluorescenza VIC (ABI PRISM 7900HT SDS) con contemporanea amplificazione degli Standard di quantificazione (C. trachomatis QS 1-4). NTC: non-template control (controllo negativo). 45