Microscopia metodi, limiti, possibilità

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1 Microscopia metodi, limiti, possibilità

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3 Incrementando di un fattore 10 la potenza dell occhio umano tramite il suo telescopio, Galileo Galilei è riuscito a studiare la superficie della Luna e scoprire i satelliti di Jupiter

4 Primi microscopi:

5 Microscopio moderno:

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7 Microscopio a fluorescenza Questo tipo di microscopio utilizza radiazioni ultraviolette, per ottenere, nei preparati in cui ciò è possibile, la fluorescenza.

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9 Però c è un limite! La visione distinta di oggetti sempre più piccoli non può essere ottenuta solamente aumentando il potere di ingrandimento. La diffrazione pone un limite inferiore alla distanza di separazione tra due punti in posizioni distinte. Questa distanza minima è data da: d min = 1,2λ / 2n sinα (limite di Abbe) dove λ è la lunghezza d'onda della luce che illumina l'oggetto, n l'indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e obiettivo, α il semi-angolo del cono di raggi utili che ha il vertice nel centro dell'obiettivo. Luce nello spettro visibile: 380nm l 750nm; limite di Abbe 250nm

10 Il Microscopio Elettronico a Scansione (SEM) Il potere risolutivo cresce proporzionalmente al decrescere della lunghezza d onda della radiazione impiegata, infatti la scoperta che gli elettroni hanno una radiazione di bassissima lunghezza d onda ha suggerito la possibilità di usare fasci di elettroni per ottenere poteri risolutivi assai elevati.

11 Cosa è la Microscopia Elettronica Tecnica che permette l osservazione di campioni con ingrandimenti e risoluzione fino a 1000 volte superiore alla microscopia ottica ordinaria.

12 Alcuni cenni storici 1897: J. Thomson scopre l elettrone 1924: L. de Broglie propone la teoria ondulatoria della materia 1926: H. Busch dimostra che i campi elettrici e magnetici a simmetria assiale si comportano come lenti per gli elettroni Nascita dell ottica elettronica

13 1934: E. Ruska primo prototipo di TEM 1938: von Ardenne primo prototipo STEM 1942 Zworykin realizza il primo prottipo di SEM capace di analizzare campioni massivi Everhart e Thornley introducono il loro rivelatore per elettroni secondari, basato su scintillatore e tubo fotomoltiplicatore 1965: Cambridge Instruments produce e commercializza il primo SEM 1986: Ruska vince il Nobel

14 IL SEM In linea di principio un microscopio elettronico opera come un normale microscopio ottico qualora si usasse luce con lunghezza d onda bassissima. Poiché però i normali dispositivi ottici non deviano gli elettroni, si ricorre a lenti elettrostatiche o a lenti magnetiche che, agendo sulla carica elettrica degli elettroni, ne provocano la deviazione.

15 IL SEM Il Microscopio Elettronico a Scansione sfrutta la generazione di un fascio elettronico ad alta energia nel vuoto. Il fascio viene focalizzato da un sistema di lenti e deflesso per scandire una area del campione. L interazione fascio-campione genera vari segnali che vengono acquisiti da opportuni detectors e successivamente elaborati fino a formare una immagine a livelli di grigio.

16 SEM moderno:

17 I pregi del SEM Da indicazioni su: morfologia della superficie del campione composizione chimico fisica difettosità elettriche contaminazione delle superfici misura dei potenziali superficiali

18 Alta risoluzione (limite 1nm) Alti ingrandimenti (fino a x) Alta profondità di campo Abbastanza facile preparazione del campione La combinazione di alti ingrandimenti, alta risoluzione, larga ampiezza del fuoco e facile preparazione e osservazione del campione rende il SEM uno degli strumenti più affidabili e più semplici da utilizzare per lo studio della morfologia di vari campioni.

19 Confronto tra microscopie MO SEM TEM Range di ingrandimento Risoluzione Ordinaria 5mm 50nm 5nm Per osservazioni accurate 0,2mm 5nm 0.5nm Limite 0,1mm 1nm 0.1nm Profondità di campo 0,1mm a 10x 10mm a 10x limitata allo spessore del film 1mm a 100x 1mm a 100x limitata allo spessore del film Ambiente versatile richiede il vuoto (0,03Pa) richiede il vuoto (0,03Pa)

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21 Grano di pepe (Piper nigrum)

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23 tarantola messicana

24 Foglia di menta

25 Foglia di canapa indiana

26 Pollini di Compositae al microscopio elettronico a scansione

27 Creste delle cellule vegetali Coccolithophore (alga) Emiliania huxleyi

28 Peli sul fusto di una pianta di tabacco Tricomi sulla pianta Juglandales Juglandaceae

29 Tricoma sulla foglia di Arabidopsis thaliana Fusto di bamboo

30 Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

31 Caratteristiche del TEM Potere risolutivo altissimo (0,2 nm), dell ordine delle molecole. Fino a X. Richiede sezioni sottilissime, colorate solitamente con metalli e mantenute sotto vuoto: artefatti inevitabili. Non si possono osservare strutture viventi, né in 3D.

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33 TEM vs SEM

34 Microscopio ottico Microscopio a raggi X Microscopi elettronici e ionici - Microscopio elettronico a scansione (SEM) - Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) - Microscopio elettronico a diffrazione - Microscopio elettronico ad emissione di campo - Microscopio ionico Microscopi a scansione di sonda (SPM) - Microscopio a scansione per effetto tunnel (STM) - Microscopio ottico a scansione in campo prossimo (SNOM) - Microscopio a forza atomica (AFM) Altre tipologie di microscopio - Microscopio acustico - Microscopio confocale + forza atomica + riflessione interna totale in fluorescenza

35 SEM UNIVPM (Dipartimento SIMAU): SEM PHILIPS XL20 con EDS

36 Microscopio a forza atomica Dipartimento Di.S.C.O.

37 Erythrocytes, contact mode scan field 40 µm * 40 µm z-range µm Superficie della castagna, tapping mode scan field 30 µm * 30 µm z-range 0 6 µm

38 Microtomografia computerizzata a raggi X o radiazione di sincrotrone: Strumento desktop Skyscan: risoluzione tipica nell ordine dei micron.

39 European Synchrotron Radiation Facility (ESRF), Grenoble, France fr

40 Schematic set up of microct system installed at ID19 in ESRF

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42 Visualizzare la struttura interna del legno utilizzando microtomografia computerizzata ricostruzione 3D del legno

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44 Radiografia neutronica:

45 Differenza tra una radiografia neutronica e una a raggi X: i liquidi vengono visualizzati molto bene utilizzando neutroni.

46 Tomografia neutronica:

47 L assorbimento dell acqua nelle piante l assorbimento di D 2 O in 5 min