Dott.ssa Marina Rodolfi Sondrio 2 ottobre 2013

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1 Dott.ssa Marina Rodolfi Sondrio 2 ottobre 2013

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3 Nella maggior parte dei casi la DP premette di rassicurare Rendere le persone in grado di scegliere in modo autonomo, per questo è necessario la conoscenza Gold standard: avere un medico genetista a disposizione

4 La percentuale di aborti spontanei, nella tri 21, tra la 10 sett. e il termine era del 31%. (Halliday et al.) Il rischio per la tri 13 e 18 aumenta con l età materna e diminuisce con l età gestazionale, con letalitàintruterina tra la 14 e la 40 sett. di circa l 80%

5 Gli esami di screening consentono di selezionare, nella popolazione generale, un ristretto gruppo di persone ad alto rischio per una determinata patologia alle quali offrire esami diagnostici più specifici

6 Gli esami di screening prenatale per la SD si avvalgono di marcatori che possono essere biochimici o ecografici. Marcatori biochimici: Alfa feto proteina: a sett. èpiùbassa del 30% nella tri21. Free betahcg: concentrazioni circa doppie per un lungo periodo (10-20 sett.). Estriolo libero piùbasso di circa il 30% nei feti affetti tra 15-20sett.. Inibina A: tra sett. ha valori aumentati di circa 70/80% nei feti affetti. Proteina plasmatica A (PAPP-A): prodotta dal trofoblasto in quantitàmolto minori (circa 60%) nel feto affetto.

7 Marcatori ecografici: Translucenza nucale: indica i tessuti molli retronucali del feto. La misura dello spessore della NT èil marcatore ecografico piùutilizzato essendo noto che tale spessore nei feti affetti è prevalentemente aumentato ( circa il doppio per pari età gestazionale) Altri marcatori ecografici nel primo trimestre ritenuti validi sono: La valutazione dell osso nasale Il rigurgito della tricuspide Il rigurgito del dotto venoso La misurazione dell angolo facciale Il loro utilizzo èrivolto soprattutto ai casi risultati a rischio aumentato

8 Nello specifico della Sindrome di Down, la paziente informata del rischio aumentato potràdecidere se sottoporsi a diagnosi invasiva in modo da identificare oppure escludere quella anomalia per cui il rischio era aumentato In Italia il limite della positività è stabilito per legge in 1/250 al momento del test.

9 Epoca gestazionale tra 11.0 e 13.6 sett. CRL tra 45 e 84mm. Scansione sagittale del profilo fetale Posizione neutrale del feto Solo la testa e la parte superiore del torace nella foto Ingrandimento tale che gli spostamenti del caliper siano di 0.1 mm

10 La croce del caliper non deve sporgere nello spazio fluido della NT Misurare la NT nel massimo spessore Abbassare il guadagno ad alti ingrandimenti Attenzione alla membrana amniotica Attenzione al cordone omb. intorno al collo Prendere diverse misure e utilizzare la maggiore Conservare copia della foto Con i risultati dell ecografia si procede quindi al ricalcolo del rischio di SD mediante un sistema operativo messo a punto dalla FMF da parte di operatori accreditati e sottoposti a verifica continua di qualità

11 Posizionamento calibri corretto Testa iperestesa

12 Ingrandimento adeguato Profilo corretto Calibri ben posizionati

13 FISIOPATOLOGIA DELLA NT AUMENTATA ANOMALIE CARDIACHE CONGESTIONE VENOSA NEL COLLO E NELLA TESTA ALTERATA COMPOSIZIONE DELLA MATRICE EXTRACELLULARE INSUFFICIENZA DEL DRENAGGIO LINFATICO ANEMIA FETALE IPOPROTEINEMIA FETALE INFEZIONE FETALE In presenza di NT > del 95 centile (3mm) e cariotipo normale ènecessario eseguire una ecocardiografia fetale precoce. La NT aumenta con il CRL La sensibilità della sola translucenza è intorno al 75%

14 GESTIONE DEI FETI CON NT PATOLOGICA DETERMINAZIONE CARIOTIPO CORREDO NORMALE ECOCARDIOGRAFIA PRECOCE ( WKS) ECOGRAFIA MORFOLOGICA PRECOCE ANCHE CON APPROCCIO TRANSVAGINALE

15 Nei feti con NT aumentata e cariotipo normale, vi èun rischio aumentato di esiti perinatali sfavorevoli (aborto, anomalie congenite, sindromi geniche). Il rischio è maggiore quanto maggiore èlo spessore della nuca. E necessario proporre un accurato follow-up ecografico per poter escludere la presenza di anomalie maggiori. In assenza di questi la prognosi di questi feti ènella maggior parte dei casi favorevole. Consiste nel calcolo del rischio di avere un feto affetto da SD mediante la combinazione dei valori di NTcon i valori su sangue materno nel I trimestre di free-betahcg e PAPP-A

16 Screnning del II trimestre determina la concentrazione ematica materna di alfa-fetoproteina (AFP) estriolo non coniugato (ue3) gonadotropina corionica totale (hcg) tra la 15 e 18 sett. Sensibilitàdel 65% con 5% di falsi positivi Screnning del II trimestre èun miglioramento rispetto al triplotest con una sensibilitàdell 80% e 5% di falsi positivi. Risulta dall associazione di etàmaterna triplotest e inibina A nel sangue materno Difficoltà: difficile dosaggio della inibina e alti costi, quindi utilizzo limitato

17 Integrazione tra NT, PAPP-A e quadruplo test. Problematiche: oltre a quelle del quadruplo test la compliance dell operatore che difficilmente riesce omettere il risultato alterato del primo test in attesa del secondo prelievo Sensibilitàdel 87% con 1% di falsi positivi Si utilizzano il test combinato del I trimestre e il quadruplo del II trimestre: -graduale o stepwise in cui il risultato del I trim. viene utilizzato come base per il quadruplo, sensibilità del 75% -contingente in cui solo i casi a rischio intermedio del I trim. vengono passati al quadruplo, sensibilità del 85%

18 Test Metodo Sensibilità Combinato Combinato + osso nasale NT+PAPP-A+free betahcg (bitest) 85-90% NT+bi-test+ osso nasale 85-95% Integrato NT+PAPP-A+quadruplo 85-92% Sequenziale Stepwise Combinato+quadruplo 75% Sequenziale contingente Combinato+quadruplo 85% Riguardano più aspetti: Le modalitàdi accesso al test Il periodo di gravidanza Il tipo di popolazione Le metodiche utilizzabili La presenza di operatori qualificati ed esperti La possibilitàdi poter effettuare rapidamente un counselling preliminare al cariotipo

19 Ad esempio i risultati cambiano in funzione del cut-off di riferimento, influenzando la sensibilitàe i falsi positivi e di conseguenza il numero di procedure invasive. Se passo da un cut-off di 1/300 a 1/100 ottengo un abbassamento della sensibilitàma un miglioramento dei falsi positivi e viceversa Il test che risponde meglio ai criteri elencati risulta essere il test combinato a cui sono stati associati recentemente i marcatori ecografici e che permettono di arrivare piùprecocemente ad una diagnosi

20 Il test integrato èil test con il miglior rapporto beneficio/danno, poichéoffre la migliore accuratezza diagnostica e risulta associato a una perdita inferiore di feti sani. Meno indagata risulta la fattibilità, in riferimento agli aspetti organizzativi e all accettabilitàdel test. Riguardo all accettabilità, la preferenza delle donne si orienta per i test la cui esecuzione prevede un singolo stadio. Nel secondo trimestre, il quadruplo test ha la migliore performance, ma la sua fattibilitàèlimitata in quanto la determinazione dell inibina A può non essere disponibile.

21 Nel primo trimestre il test combinato èrisultato accurato per la sindrome di Down e per altre anomalie fetali. Il percorso per la diagnosi prenatale della sindrome di Down deve essere offerto a tutte le donne entro 13+6 settimane. Se la donna si presenta al primo incontro a un epoca che non consente l offerta del test del primo trimestre, un test come il triplo test deve essere offerto in epoca piùtarda (per esempio tra 15+0 settimane e 20+0 settimane La misurazione isolata della translucenza nucale non èraccomandata per individuare la sindrome di Down

22 Cosa fare quando un test di screening da un risultato di rischio aumentato? Rispiegare alla coppia che un rischio aumentato non corrisponde ad una diagnosi di certezza Offrire una diagnosi invasiva ecografia morfologica precoce Offrire un DNA fetale? PROCEDIMENTI INVASIVI Diagnosi prenatale invasiva INDICAZIONI PER LE INDAGINI CITOGENETICHE PER ANOMALIE CROMOSOMICHE FETALI Etàmaterna uguale o superiore a 35 anni. Genitori con precedente figlio affetto da patologia cromosomica. Genitore portatore di riarrangiamento strutturale non associato ad effetto fenotipico. Genitore con aneuploidie dei cromosomi sessuali compatibili con la fertilità. Anomalie malformative evidenziate ecograficamente. Probabilitàdi 1/250 o maggiore che il feto sia affetto da Sindrome di Down (o alcune altre anueploidie) sulla base dei parametri biochimici valutati su sangue materno o ecografici, attuati con specifici programmi regionali in centri individuati dalle singole Regioni e sottoposti a verifica continua della qualit (Circolare Bindi)

23 early o mid Cariotipo fetale Analisi genetiche molecolari Dosaggio di analiti ( αfp, etc) Diagnosi di malattie infettive fetali tardiva Maturità polmonare fetale Evacuazione polidramnios Amnioinfusione

24 Amniocentesi: fase preliminare Accurato counselling della gestante su tutti gli aspetti dell esame per un consenso realmente informato Ecografia Procedura 1. Disinfezione cutanea; 2. Infissione eco-guidata di un ago sterile munito di mandrino (20-22G di diametro e 7-12 cm di lunghezza) mediante tecnica a mano libera, in cui l operatore tiene in una mano la sonda e nell altra l ago in modo da dirigere il fascio d ultrasuoni sul piano d inserzione dello stesso e visualizzarlo in tutta la sua lunghezza, oppure ago-guidata, in cui l ago è fissato al trasduttore e percorre una traiettoria fissa (l operatore visualizza solo la punta dell ago);

25 Rischi materni Infezioni Iso-RH Ansia Rischi fetali Danni diretti: perdite fetali, traumi Abortivitàcirca 1% Morbilità da rimozione del LA: respiratoria, ortopedica esperienza dell operatore In uno studio danese su 3000 gravidanze Leschot 1985 ha trovato una FLR di 1.53% per le prime 1500 A e di 0.47% per le successive

26 Percorso Storico VILLOCENTESI Diagnosi prenatale invasiva Procedimento invasivo ecoguidato di elezione nel I trimestre per la diagnosi prenatale di anomalie cromosomiche e altre malattie ereditarie -Utilizzata per la prima volta nel 1965 in Cina per la determinazione del sesso fetale. -Nel 1968 si tentò il prelievo transcervicale in 12 pazienti conun ago di 6 mm di diametro. (esitarono in aborto la metà delle pazienti) (Mahnemann-Mohr 1968) -Nel 1973 si utilizzò un ago di 5 mm per la via transcervicale, con successiva morte di due pazienti per sepsi. (Kullander e Saudahl 1973) -Nel 1974 si arrivò all utilizzo di un isteroscopio con diametro di 2,5 mm nel I trimestre (elevata frequenza di rottura di membrana) -Nel 1980 acquisìl attuale sviluppo grazie alla diffusione dell ecografia ecoguidata e di adeguate strumentazioni VILLOCENTESI Diagnosi prenatale invasiva Studi randomizzati hanno dimostrato che il rischio di aborto dopo CVS nel I trimestre èuguale a quello dell amniocentesi nel II trimestre. Se eseguita prima della 10^ settimana si associa più frequentemente ad anomalie degli arti, micrognatia, microglossia (1,6% a 6-7 s.g. vs 0,1% a 8-9 sg) Settimane preferibili:11^-13^ 13^ Esistono due vie d accesso: transcervicale transaddominale la transaddominale è la più utilizzata Localizzazione placenta Localizzazione utero

27 VILLOCENTESI TRANSCERVICALE TRANSADDOMINALE Diagnosi prenatale invasiva Paziente in posizione ginecologica Disinfezione del canale cervicale Prelievo sotto guida ecografica Introduzione della pinza fino alla placenta con successiva aspirazione Non uso di eparina Movimento di avanzamento e retrazione Limite: 2 tentativi Paziente in posizione supina Disinfezione dell addome Utilizzo di terreno di coltura nella siringa Prelievo sotto guida ecografica con entrata rapida (< dolore e < movimento uterino) Introduzione di un ago da 20 G con successiva creazione del vuoto o uso di una guida da 18 G Movimento di avanzamento e retrazione Limite: 2 tentativi Tasso di successo in gruppi esperti 95% VILLOCENTESI Diagnosi prenatale invasiva DIFFICOLTA Localizzazione della placenta Dimensioni materne Caratteristiche placentari COMPLICANZE Dolore nella sede di inserzione addominale Spotting lieve e transitorio Infezione (<1%) Tasso di morte fetale circa dell 1% Il rischio di morte per un feto a 10 s.g. senza che la madre si sottoponga ad alcun esame ècirca del 2-3%; la villocentesi aggiunge a questo un 1-2% che diventa 3-6% in caso di CVS transcervicale (Medical Research Council Working Party on the Evaluation of Chorion Villus sampling, 1994)

28 Diagnosi prenatale invasiva L INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO dipende da: -Risoluzione delle metafasi ottenute (n di bande osservabili) Rischio di non scorgere minime alterazioni strutturali - Contaminazione materna - MOSAICISMO (presenza di piùdi una linea cellulare) Pseudomosaicismo la 2^ linea cellulare appare in una sola coltura Mosaicismo vero Probabile alterazione del coltivo e non del feto -Più linee cellulari interessate -Probabile aberrazione fetale -La rilevanza clinica dipende dalla percentuale di colture alterate -Necessità di consulenza genetica FINALITA : evidenziare la presenza di eventuali anomalie cromosomiche fetali. TECNICA: comporta la coltura delle cellule fetalipresenti nel liquido amniotico o nei villi coriali e la valutazione dell assetto cromosomico tramite l analisi al microscopio dei cromosomi in metafase.

29 Le colture cellulari impongono lunghi tempi di attesa (15-20 giorni), necessari per lo sviluppo delle colonie di cellule fetali. E possibile ottenere una risposta rapida (24/48 ore) preliminaredalle aneuploidie cromosomiche piùcomuni (cromosomi 13, 18, 21, X e Y), mediante la tecnica QF-PCR, ma i risultati sono parzialie comunque necessitano di una conferma dal cariotipo. A volte èpossibile che le cellule poste in coltura non crescano adeguatamente, con conseguente necessitàdi ripetizione del prelievo al fine di allestire nuove colture cellulari. Questo problema avviene 1 volta su 500 in caso di cariotipo da liquido amniotico e 1 volta su 100 in caso di cariotipo da villi coriali.

30 Limiti di risoluzione: l esame standard non riesce ad evidenziare le anomalie strutturali inferiori a Mb. Quindi, le patologie derivanti da alterazioni cromosomiche submicroscopiche (microdelezioni o microduplicazioni), il più delle volte sfuggono alla diagnosi. Necessitàdi approfondimenti diagnostici di 2^ livello: nei casi di anomalie cromosomiche particolari di cui non si conosce l'espressività fenotipica. Markers: piccoli porzioni cromosomiche soprannumerarie; anomalie cromosomiche strutturali come inversioni o traslocazioni, apparentemente bilanciate. Possibilitàdi artefatti "in vitro": il piùdelle volte riferibili a pseudomosaicismi. Questo può avvenire nel 2-3% delle colture.

31 Permette di identificare riarrangiamenti cromosomici coinvolgenti non meno di 3-5 Mb. Abbina la possibilitàdi un analisi del DNA, propria delle tecniche di biologia molecolare, con la struttura cromosomica il cui studio è oggetto della citogenetica classica.

32 Permette un analisi mirata di una regione cromosomica consentendo di mettere in evidenza riarrangiamenti di alcune centinaia di chilobasi. Impiegando una tecnica molecolare, che non necessita di coltura cellulare, con il Cariotipo Molecolare èpossibile ottenere un analisi cromosomica approfondita in soli 3-4 giorni, a differenza dei giorni necessari con la tecnica tradizionale, riducendo al minimo i tempi di attesa dei risultati. Con indubbi vantaggi: Esclusione di patologie cromosomiche entro pochi giorni dal prelievo Riduzione dell ansietà della gestante Possibilitàdi gestire in largo anticipo un eventuale intervento terapeutico, in caso di risultato patologico

33 Il cariotipo tradizionale è limitato nelle sue possibilità diagnostiche dal potere di risoluzione del microscopio. Il cariotipo molecolare, invece, permette: Una risoluzione 100 volte maggiore (~100 Kb) L identificazione di alterazioni cromosomiche submicroscopiche Lo screening di 100 patologie cromosomiche da microdelezione/ duplicazione e di oltre 150 geni La verifica della patogenicitàdell anomalia cromosomica riscontrata mediante una sofisticata analisi bioinformatica È ideale per approfondimenti diagnostici di 2 livello, in casi di: difetti dello sviluppo (ritardo di crescita) e/o della struttura fetale evidenziati tramite ecografia; feto con anomalie cromosomiche individuate attraverso l analisi citogenetica tradizionale quali: - riarrangiamenti sbilanciati -riarrangiamenti de novo apparentemente bilanciati - Markers cromosomici

34 Tecnica completamente automatizzata Non necessita di coltura cellulare Nessun rischio di artefatti " in vitro Massima affidabilità dei risultati Minore quantita di L.A. e villi necessari per diagnosi Il Cariotipo Molecolare, non èsoggetto al rischio di mancata crescita della coltura cellulare e, di conseguenza, di ripetizione del prelievo, garantisce un risultato in quasi la totalità dei casi

35 LIMITI I limitidi tale tecnica in ambito prenatale sono rappresentati dall impossibilità di identificare: Riarrangiamenti cromosomici bilanciati (non patologici); Mosaicismi(cioèla presenza cioèdi due linee cellulari con differente assetto cromosomico) con una linea cellulare scarsamente rappresentata (inferiore al 10% circa). Cariotipo Molecolare Vs. QF-PCR

36 Quantitative Fluorescent - Polimerase Chain Reaction o QF-PCR : è una tecnica molecolare che permette di ottenere una risposta rapida (24/48 ore) preliminaresulle aneuploidie cromosomiche piùcomuni (es. Trisomia 21, 18, 13, Monosomia X, Klinefelter - XXY). I risultati della QF-PCR sono parziali(limitati ai soli cromosomi 13, 18, 21, X, Y). La QF-PCR non permette di evidenziare alterazioni cromosomiche submicroscopiche, ma si limita a determinare il numero di alcuni cromosomi. La QF-PCR necessita di una confermadal cariotipo (con i risultati della QF-PCR non èpossibile ricorrere alla interruzione volontaria della gravidanza). la tecnica QF-PCR, talvolta, viene erroneamenteidentificata con il cariotipo molecolare. DIAGNOSI NON INVASIVA DI DIFETTI CROMOSOMICI La valutazione citogenetica di cellule fetali derivate da sanguematerno periferico dimostrò essere potenzialmente utilizzabile come testdiagnostico non invasivo (Bianchi 2000) Il target piùappropriato sembrano essere i globuli rossi nucleati fetaliper specifici antigeni (Adinolfi 1995) La grossa difficoltàèlegata al piccolo di cellule fetali (0 a 20 in 20 ml di sangue materno) e la loro bassa concentrazione (1 cellula fetaleper milioni di materne) (Bianchi, 94, 97, 99) La proporzione può essere arricchita sino a 1 su mediante Magnetic Cell Sorting (MACS) o Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) per reazione tra anticorpi marcati con fluorescenza con un marker specifico per la superficie delle cellule fetali

37 DIAGNOSI NON INVASIVA DI DIFETTI CROMOSOMICI Nonostante i limiti citati, numerosi sono gli studi condotti con successo in merito. (Cruz 1998) Attualmente ricerca di DNA fetale libero nel plasma materno(dati idscordanti in feti con trisomia 21) Tutt oggi non sembra ancora adatto per le tradizionali analisi citogenetiche quanto piuttosto per la valutazione del rischio di difetti cromosomici, con una sensibilitàpari a quella degli screening su siero materno. Test si esegue almeno a 10 settimane. E un semplice prelievo ematico Risposta in circa 3 settimane Durante la gravidanza, alcuni frammenti del DNA del feto circolano nel sangue materno. Il DNA fetale consiste in corti frammenti di DNA (145/200 bp) presenti nel plasma in percentuali variabili a seconda del periodo gestazionale e derivanti dai trofoblasti placentari. Tramite un analisi complessa di laboratorio, viene isolato il DNA fetale dal sangue materno al fine di identificare eventuali aneuploidie

38 L analisi non èsostitutiva della diagnosi prenatale invasiva (Villocentesi o Amniocentesi)

39 sensibilità falsi positivi Trisomia % 0.1% Trisomia 18 97% 0.1% Trisomia 13 79% 0.1% Identifica solo una minima parte delle anomalie Anomalie x linked emofilia A e B distrofia muscolare di Duchenne e di Becker sindrome dell X fragile tri 21,18 e 13 sesso

40 American college Scelta di coppia No in donne a basso rischio Test negativo non significa bambino sicuramente sano Necessario integrarlo con eco del 1 e 2 trim. Gli studi, al momento, solo su donne a rischio 66% di diagnosi invasiva in meno 38% di diagnosi in più

41 Noninvasive prenatal testing as a screening tool that requires a confirmatory amniocentesis is costeffective compared with its use as a diagnostic tool and leads to far fewer losses of normal pregnancies John Wiley & Sons, Ltd. The introduction of NIPT resulted in a significant decrease in invasive diagnostic testing. Additionally, fewer women declined further testing when NIPT was available John Wiley & Sons, Ltd.

42 Prenatal tests, including new methods using cell-free fetal DNA, are not currently regulated by government agencies, and limited professional guidance is available. In the absence of regulation, companies and clinicians should cooperate to adopt responsible best ethical practices in the provision of these tests John Wiley & Son,Ltd.