Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche. Neisseria meningitidis Patogenesi e Diagnosi. Oliviero E. Varnier
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1 Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche Neisseria meningitidis Patogenesi e Diagnosi Oliviero E. Varnier Sezione di Microbiologia Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)
2 Neisseria meningitidis 2 2 di 52
3 MALATTIA MENINGOCOCCICA: 7 NOTE 1. La prima descrizione di una malattia meningococcia risale al 16 secolo 2. La prima identificazione della malattia è del 1805 (Vieusseux M et al. J Med Chir Pharmacol, 1805) 3. Il primo isolamento di Neisseria meningitidis avvenne nel 1887 (Weichselbaum A. Fortschr Med, 1887) 4. È la causa principale delle meningiti batteriche e delle sepsi negli USA e di epidemie nell Africa sub-sahariana 5. La vaccinazione dei soggetti a rischio è attualmente una delle migliori strategie di sanità pubblica per il controllo di una grave epidemia 6. Vaccini coniugati simili a quello per Haemophilus influenzae di tipo B sono in fase avanzata di sviluppo e di sperimentazione 3 di 52
4 Epidemiologia 1 v I sierogruppi B e C sono responsabili della maggior parte dei casi in Europa e nelle Americhe, mentre A e C sono predominanti in Asia e Africa. v Il gruppo B ha causato il 68% dei casi in Europa dal 1993 al 1996 ed epidemie in paesi in via di sviluppo con un incidenza di 5-50 casi per persone. v In assenza di un efficace vaccino per il gruppo B, un epidemia più diffusa potrebbe avere morbilità e mortalità molto elevate. v Nella cintura delle meningiti africana, che va dall Etiopia al Senegal, da oltre 100 anni il gruppo B è un dramma sanitario ricorrente. L incidenza della malattia meningococcica è molte volte maggiore in questa regione che nei paesi industrializzati: la mortalità è molto superiore al 10% in quanto i pazienti muoiono prima di arrivare all ospedale! 4 di 52
5 Epidemiologia 2 v Le infezioni causate da Hib, S. pneumoniae, e N. meningitidis sono la causa dell alta morbidità e mortalità nei bambini nell Africa Sub-Sahariana. L Hib causa da 100,000 a 160,000 decessi infantili ogni anno nella regione africana controllata dall WHO. Lo S.pneumoniae causa da 250,000 a 400,000 morti pediatriche per anno. La N.meningitidis è responsabile di grandi epidemie (che causano migliaia di morti) in molti stati dell Africa Orientale e Centrale. v Le epidemie si osservano ogni 8-12 anni con incidenza da 500 a 1000 casi per persone. La più grande epidemia mai descritta è stata nel 1996 con casi e 15,783 decessi. 5 di 52
6 Epidemia negli USA " Negli ultimi decenni si sono osservati da 0,9 a 1,5 casi per persone per casi all anno. 6 6 di 52
7 Epidemiologia 3 " La malattia meningococcica si osserva durante tutto l anno, la maggior parte dei casi si ha durante l inverno e l inizio della primavera. " L incidenza della malattia è più elevata nei neonati, nei quali non si sono ancora prodotti anticorpi neutralizzanti. " L incidenza diminuisce dopo l infanzia, aumenta durante l adoloscenza e nella prima giovinezza. " Nonostante i casi diminuiscano nei giovani adulti, si hanno più casi nel gruppo di età dai 23 ai 64 anni: dal 1992 al 1996, il 28% dei pazienti aveva da 12 a 29 anni 7 di 52
8 Patogenesi " L uomo è l unico ospite naturale della N. meningitidis " Il nasofaringe è il sito dal quale i meningococchi si trasmettono mediante aereosol o secrezioni 8 di 52
9 Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco Funzione CAPSULA Classificazione Protegge dalla fagocitosi e batteriolisi 13 sierogruppi: A, B, C, E-29,H, I, K, L, M, W-135, X, Y, Z 9 di 52
10 Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco Proteine esterne della membrana Componente Porine PorA/ PorB Opacity associated proteins Opa Opc Funzione Creano pori attraverso i quali passano piccoli soluti idrofilici Promuovono adesività alle cellule ospiti e ai leucociti Promuovono adesività alle cellule ospiti 10 di 52
11 Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco Proteine esterne della membrana Componente Funzione Lipooligosaccaride Potente attività endotossica Pili Adesione iniziale alle cellule epiteliali ed endoteliali e agli eritrociti 11 di 52
12 PATOGENESI PATOGENESI dell INFEZIONE MENINGOCOCCICA 1. Colonizzazione del naso-faringe 2. Invasione dell epitelio 3. Invasione del sangue 4 disseminazione Liquor e Tessuti di 52
13 La Colonizzazione del Nasofaringe 1) I pili sono le principali adesine che possono legarsi al recettore CD46, una proteina cofattore di membrana; 2) di seguito, le opacity associated proteins (Opa e Opc) si legano ai recettori CD66e (antigene carcinoembrionale) e ad altre molecole. 3) questo legame stimola l intrappolamento da parte delle cellule epiteliali dei meningococchi, che quindi attraversano l epitelio mucosale mediante vacuoli fagocitari. 4) La sopravvivenza dei meningococchi nelle cellule epiteliali può essere promossa da una proteasi IgA1 e da porb. 13 di 52
14 Colonizzazione I meningococchi: 1. superano le difese dell ospite 2. si attaccano alle cellule cilindriche epiteliali non cigliate della mucosa del nasofaringe, 3. si moltiplicano in esse (colonizzazione) 14 di 52
15 Meningococcemia Il 5-10% degli adulti sono portatori nasofaringei asintomatici di ceppi di N. meningitidis, la maggior parte dei quali non sono patogeni. In un numero limitato di persone, la N. meningitidis penetra nella mucosa e arriva nel circolo sanguigno, causando una malattia sistemica. Nella maggior parte delle persone, lo stato di portatore è un processo di immunizzazione che comporta una risposta anticorpale protettiva di 52
16 FATTORI DI RISCHIO Fattori favorenti la sopravvivenza intravascolare LA CAPSULA " I meningococci comprendono organismi diversi: la maggior parte dei quali sono batteri commensali nell uomo. " Solo una minoranza dei ceppi del nasofaringe causa una malattia invasiva. " I meningococchi associati con la malattia invasiva producono una capsula, che protegge dalla batteriolisi mediata dal complemento, dalla fagocitosi, dalla disidratazione durante la transmissione e contribuisce a evadere i meccanismi immunitari dell ospite. 16 di 52
17 Fattori di Rischio " meccanismi di acquisizione di sostanze nutritive: ferro da lattoferritina, transferrina ed emoglobina umane " le adesine (i pili) " liberazione di vescicole derivate dalla membrana esterna contenenti lipooligosaccaride (endotossina), proteine della membrana esterna, fosfolipidi e polisaccaridi capsulari Neisseria meningitidis liberazione di endotossina dalla membrana esterna di 52
18 PATOGENESI Meningococchi vanno incontro ad autolisi con rilascio di DNA e componenti della parete cellulare, che inducono una cascata infiammatoria. 18 di 52
19 VIRULENZA " I meningococchi hanno la capacità di scambiare il materiale genetico responsabile per la produzione della capsula e pertanto di passare dal sierogruppo B a quello C e viceversa: " questo scambio di capsula può diventare un importante meccanismo di virulenza con l ampio uso di vaccini che forniscono una protezione sierogruppospecifica. 19 di 52
20 Eterogeneicità Antigenica delle Neisserie di 52
21 " Colonizzazione di Neisseria meningitidis nel nasofaringe " entrata nel circolo sanguigno " Entrata nel liquido cefalorachidiano SEPSI e MENINGITE di 52
22 Manifestazioni cutanee della Meningococcemia: petecchie 22 di 52
23 DIAGNOSI La classica diagnosi di laboratorio di malattia meningococcica su basa su: " Esame colturale: scarsa sensibilità, in particolare quando eseguito dopo l inizio di una terapia antibiotica " Esame microscopico dopo colorazione con Gram: è importante e può essere utile " Metodi non colturali: ricerca antigeni polisaccaridici: rapidi, specifici, possono fornire una diagnosi gruppo specifica. Possibili falsi positivi. 23 di 52
24 Esame Microscopico dopo Colorazione con Gram Neisseria meningitidis (freccia) nel liquor (Gram, x1000). Diplococchi Gram-negativi intracellulari di 52
25 Esame Colturale per N. meningitidis e tipizzazione del sierogruppo B mediante agglutinazione con sieri specifici 25 di 52
26 Ricerca di Antigeni Batterici di 52
27 TEMPI DI REFERTAZIONE DELLA DIAGNOSTICA CLASSICA Primi due casi " 15 marzo 2004 ore 05:00: decesso di PO ore 10.00: decesso di DMS " 16 marzo 2004 ore 12:00: autopsie e raccolta campioni " 17 marzo 2004 ore 09:00: isolamento di N.meningitidis da liquor, saliva e tamponi nasali " 18 marzo re 09:00: tipizzazione N.meningitidis tipo B 27 di 52
28 LightCycler Real Time PCR per N.meningitidis di 52
29 Identificazione di N.meningitidis di 52
30 Identificazione di N.meningitidis mediante Analisi della Temperatura di Melting di 52
31 Tipizzazione di Neisseria meningitidis di tipo B N. meningitidis B - melting curve analisys 31 di 52
32 Tipizzazione di Neisseria meningitidis di tipo C Neisseria meningitidis C - melting curve analisys di 52
33 CASI CLINICI " Nel marzo 2004 sono deceduti in Genova due bambini di 19 (PO) e 21 (DMS) mesi, che frequentavano lo stesso asilo nido nel comune di S. Olcese " Identico il breve decorso della malattia: comparsa di febbre elevata, evoluzione ingravescente con vomito, petecchie ed exitus. 33 di 52
34 34 34 di 52
35 PROTOCOLLO MEALATTIE INFETTIVE CONTAGIOSE Sulla base del sospetto clinico di malattia infettiva contagiosa, l Autorità Giudiziaria dispone l autopsia nominando un articolato gruppo di periti, al fine di: 1. Identificare l agente infettivo 2. Escludere altre cause di morte: a) avvelenamento b) intossicazione c) altra malattia pediatrica 35 di 52
36 TEAM APPROACH 36 di 52
37 PRELIEVI DA EFFETTUARSI IN CORSO DI AUTOPSIA PRIMA DELLA RIMOZIONE O ALL ATTO DELL APERTURA DEGLI ORGANI: 2.A Per esami tossicologici 2.B Per esami Microbiologici 2.C Per indagini metaboliche 2.B Per esami microbiogici 1) un campione di sangue 2) un campione di midollo osseo ottenuto mediante puntato sternale o biopsia della cresta iliaca 3) un campione di contenuto gastrico 4) un campione di feci 5) tampone faringeo 6) tampone bronchiale 7) tampone polmonare 37 di 52
38 Meningite meningococcica (P.O.) Courtesy of Ezio Fulcheri 38 di 52
39 Meningite meningococcica (DM.) Courtesy of Ezio Fulcheri 39 di 52
40 Surrenalite Emorragica Bilaterale Courtesy of Ezio Fulcheri 40 di 52
41 Encefalo e Meningi DIAGNOSI Meningite acuta da Neisseria meningitidis di gruppo B con edema cerebrale, surrenalite emorragica bilaterale e petecchie alla cute ed alle mucose; stasi poliviscerale ed edema polmonare terminale. 41 di 52
42 PROTOCOLLO OPERATIVO DIAGNOSTICO 1. prelievi da effettuarsi prima del riscontro autoptico v v v v Un tampone nasale per ciascuna narice Un tampone orofaringeo Un tampone anale Liquido cefalorachidiano (ottenuto sterilmente con puntura lombare) 2. prelievi da effettuarsi in corso di autopsia prima della rimozione o all atto dell apertura degli organi 3. il riscontro diagnostico con procedura congiunta anatomo-patologica e medico legale 42 di 52
43 Casi Clinici con Sospetta Meningite Batterica 43 di 52
44 44 di 52
45 20 Casi di Sospetta Meningite Batterica v 20 casi di sospetta meningite batterica: 12 maschi e 8 femmine di età da 4 mesi ad 80 anni v 9 deceduti v Neisseria meningitidis è stata identificata in 7 pazienti: 3 ceppi erano di tipo B e i rimanenti 5 di tipo C v Streptococcus pneumoniae è stato identificato in 3 pazienti. v Mycobacterium tuberculosis è stato identificato in 1 paziente. v 3 pazienti sono risultati negativi per la presenza di patogeni infettivi: v S.C. è deceduto per una causa violenta non ancora identificata v IJ è deceduto per una polmonite ab ingestis v ZAM di 80 anni è deceduta per decadimento generale 45 di 52
46 Tempi di Refertazione della Diagnostica Molecolare v Il 17 maggio 2004, alle ore 15.30, è stata autorizzata la raccolta dei seguenti campioni per eseguire gli esami microbiologici: liquor, tampone narice destra e sinistra. v Il DNA è stato estratto dai 3 campioni, ed è stata eseguita una amplificazione genica per l identificazione di Neisseria meningitidis mediante Real Time PCR LightCycler specifica per le sequenze del gene Capsular transport ctra. v Tutti i tre campioni analizzati sono risultati positivi per la presenza di sequenze specifiche di N. meningitidis. v Il 17 maggio 2004, alle ore 18.39, circa tre ore dopo la raccolta dei campioni, i risultati sono stati comunicati telefonicamente e via alle autorità sanitarie regionali. v Il 18 maggio 2004, alle ore 10.00, circa 18 ore dal prelievo dei campioni, la ripetizione delle prove di tipizzazione sui ceppi isolati di Neisseria meningitidis con sieri tipo-specifici è risultata positiva per il gruppo C 46 di 52
47 Tempi di Refertazione della Diagnostica Molecolare LIGHTCYCLER REAL TIME PCR v L assenza di Neisseria meningitidis nel liquor del paziente SC è stata confermata 3 ore dalla raccolta del campione di liquor e ha evitato una inutile profilassi. v L identificazione di Neisseria meningitidis e la tipizzazione del ceppo (C) nel campione di liquor del paziente FG sono state completate in meno di 4 ore. v N.meningitidis è stata diagnosticata nel liquor del paziente FA con esame microscopico dopo colorazione con Gram e ricerca degli antigeni. È stata fatta la profilassi in circa 500 persone esposte e sono stati chiusi due uffici ed una scuola. Poiché la clinica non correlava con la diagnosi, una aliquota del campione di liquor è stata inviata ai nostri laboratori e dopo 3 ore abbiamo refertato la presenza di S.pneumoniae. 47 di 52
48 LightCycler Real Time PCR per N.meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophylus influenzae tipo B N.meningitidis Capsular transport ctra Tm ctra F gctgcggtaggtggttcaa 58,9 C ctra A TgTCgCggATTTgCAACTAA 58,2 C ctra FL TTCgTACTACATTgCCACgTgTCAgC X 64,4 C ctra LC CACATTCgTATCCTgCACATTTgCC p 64,3 C H. influenzae DNA Gyrase (gyra) Tm gyra F AAATCAgCgCgTgTTgT 53.4 C gyra R CCATCATAgTTTggCgAgAA 54.1 C gyra FL gctgcaatgcgttataccgaagt--fl 61.1 C gyra LC CgTATgCAAAAAATTACgCAAgCATTACT--PH 63.7 C S. pneumoniae Pneumolysin gene (ply) Tm ply F TgCAgAgCgTCCTTTggTCTAT 59.6 C ply R CTCTTACTCgTggTTTCCAACTTgA 59.2 C ply TM TggCgCCCATAAgCAACACTCgAA XT--PH 70.1 C di 52
49 DIAGNOSI di Meningite Batterica LightCycler RealTime PCR per: Identificazione e quantificazione di Neisseria meningitidis Tipizzazione di N.meningitidis A, B e C Identificazione di N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae Identificazione di Mycobacterium spp Tipizzazione di M. tuberculosis e M. avium Identificazione e quantificazione di Borrelia burgdorferi sensu lato Tipizzazione di Borrelia afzelii, Borrelia garinii, e B. burgdorferi sensu stricto Identificazione e quantificazione di Listeria monocytoge-nes 49 di 52
50 PROTOCOLLO OPERATIVO DIAGNOSTICO TEAM APPROACH Microbiologia Università v Claudio Giacomazzi v Maddalena Perotti v Isabella Martini v Jennifer McDermott Anatomia Patologica - Università v G. Gaggero v M. Mora v Ezio Fulcheri Malattie Infettive Università v Claudio Viscoli v Matteo Bassetti v Gabriella Pagano Medicina Legale Università v Benedicta Astengo v Francesco Ventura v A. Gianelli Castiglione 50 di 52
51 DOMANI: MENINGITIDIS MULTIPLEX DETECTION " Meningitis is one of the most terrifying diseases. " It can be fatal in hours yet its early symptoms resemble selflimiting conditions like flu and colds.. 51 di 52
52 MENINGITIDIS MULTIPLEX DETECTION 1.Streptococcus pneumoniae 2. Neisseria meningitidis 3. Streptococcus gruppo B 4. Haemopjlus influenzae 5. Listeria monocytogenes 52 di 52
Neisseria meningitidis. 1 di 33
1 Neisseria meningitidis 1 di 33 EPIDEMIOLOGIA negli USA! Negli ultimi decenni si sono osservati da 0,9 a 1,5 casi per 100.000 persone per 2.500-3.000 casi all anno. 2 2 di 33 PATOGENESI! L uomo è l unico
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