Istruzioni per l'uso. Famiglia Dynal AllSet + e CombiSet + SSP

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1 Istruzioni per l'uso Famiglia Dynal AllSet + e CombiSet + SSP 0088

2 SOMMARIO Pagina USO PREVISTO.. 3 RIEPILOGO E SPIEGAZIONE PRINCIPI DELLA PROCEDURA REAGENTI... 4 Reagenti inclusi nel kit di tipizzazione Conservazione... 4 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 5 MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO DA DYNAL BIOTECH.. 5 PROCEDURA Raccolta e Preparazione dei Campioni Preparazione dei Reagenti per la PCR Amplificazione Analisi delle reazioni di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio... 9 LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA RISULTATI ATTESI. 10 Controllo di Qualità Controllo Interno Interpretazione dei Risultati Interpretazione mediante Dynal SSPTool GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI BIBLIOGRAFIA GARANZIA.. 14 MARCHI DI FABBRICA UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO 14 BREVETTI UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO CONTATTI Pagina 2 di 15

3 Per uso diagnostico in vitro USO PREVISTO Tipizzazione del DNA degli alleli HLA di Classe I o Classe II. RISOLUZIONE Kit a bassa risoluzione: La tipizzazione degli alleli viene eseguita a livello generico, o del gruppo allelico, che in genere corrisponde alle specificità definite sierologicamente. Kit ad alta risoluzione: O kit di subtipizzazione, forniscono una genotipizzazione ad alta risoluzione o a livello di allele. RIEPILOGO E SPIEGAZIONE Quasi tutte le metodiche di tipizzazione tissutale basate sul DNA utilizzano la tecnica PCR 1 per l'amplificazione del locus HLA da analizzare. Nella maggior parte delle metodiche per la tipizzazione tissutale basate sul DNA la tecnica di PCR è impiegata per la fase di amplificazione, prima cioè della tipizzazione effettiva, con lo scopo di aumentare la quantità di DNA bersaglio. Il processo di tipizzazione HLA richiede quindi una fase di post-amplificazione finalizzata alla discriminazione allelica. A differenza di altri metodi basati sulla PCR, la tecnica SSP 2,3,4,5 utilizzata da Dynal Biotech Ltd per gli AllSet + e CombiSet + SSP discrimina i diversi alleli nel corso del processo stesso della PCR. Ciò consente di abbreviare il tempo di analisi dei risultati post-amplificazione riducendolo ad una semplice fase di rivelazione mediante gel-elettroforesi. PRINCIPI DELLA PROCEDURA Il metodo SPP Dynal è una tecnica basata sulla PCR che impiega Sequence Specific Primers (SSP), cioè Primer Sequenza Specifici, per la tipizzazione tissutale basata sul DNA. I prodotti Dynal SSP sono costituiti da miscele diverse di primer, in cui ciascuna miscela contiene una o più coppie specifiche di primer, vale a dire i primer specifici per un allele e/o un gruppo allelico, oltre ad una coppia di primer di controllo per le sequenze non alleliche nel campione. La coppia di primer di controllo ha la funzione di controllo interno della PCR e quindi di verifica dell'efficienza delle amplificazioni. Il metodo Dynal SSP si basa sul principio che un primer perfettamente corrispondente potrà essere utilizzato con maggiore efficienza nella reazione PCR rispetto ad un primer che presenta uno o più mismatch all'estremità 3. La specificità della tipizzazione rientra nella fase di amplificazione e il processo di elaborazione dei risultati dopo l amplificazione è ridotto al minimo. L'assegnazione degli alleli consiste semplicemente nel constatare se si è verificata o meno l'amplificazione, cioè nel visualizzare l'amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio. La tecnica PCR-SSP assicura un elevato grado di risoluzione, in quanto ciascuna coppia di primer identifica due siti polimorfici in cis. Il metodo ha un livello elevato di sensibilità, specificità e riproducibilità. Pagina 3 di 15

4 REAGENTI Reagenti inclusi in tutti i kit Dynal AllSet + SSP o CombiSet + SSP Articolo 1. Vassoi PCR con miscele di primer SSP disidratati pre- aliquotati Descrizione Ciascuna provetta del vassoio per la PCR contiene una miscela disidratata di SSP composta da primer specifici per un allele e/o un gruppo allelico e una coppia di primer di controllo per le sequenze non alleliche. La coppia di primer di controllo amplifica un gene presente in tutti i campioni. 2. Tappi Tappi per la chiusura ermetica dei vassoi per la PCR 3. Master Mix (il numero di flaconi compresi nei kit dipende dal numero di reazioni di PCR per test ved. tabella corrispondente) N. di reazioni di PCR per No. di flaconi di Master Mix inclusi nei kit (tutti da 1,8 ml) Concentrazione 1x pronta all'uso. La Master Mix è stata ottimizzata per l'impiego con la DNA polimerasi AmpliTaq (Roche Molecular Systems, Inc.) Informazioni sulla formulazione sono disponibili all'indirizzo hla@dynalbiotech.com 4. Istruzioni per l'uso del prodotto/opuscolo informativo sul lotto specifico del prodotto Istruzioni per l'uso e opuscolo informativo sul lotto specifico del prodotto (BSPI). 5. Foglio di Lavoro per Interpretazione Modulo di registrazione delle reazioni positive ottenute con le diverse miscele di primer. Conservazione 1. I vassoi per la PCR e la Master Mix devono essere conservati a 2-8 C. 2. Non congelare i reagenti 3. Se conservati in modo corretto, reagenti e miscele di primer sono stabili fino alla data di scadenza indicata nell'opuscolo informativo allegato ad ogni prodotto. Pagina 4 di 15

5 AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Per uso diagnostico in vitro 2. Per l esecuzione dei test con i kit Dynal AllSet + e CombiSet + SSP è necessario attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle linee guida stabilite ad es. negli standard EFI, nelle direttive CPA o in altre direttive locali. 3. Avvertenza - Rischio biologico: Manipolare tutti i campioni come potenzialmente in grado di trasmettere malattie. Eseguire tutte le operazioni indossando guanti e protezioni adeguate. 4. Avvertenza - Rischio biologico: Per la preparazione dei campioni utilizzare sempre provette con tappo a vite, al fine di evitare fuoriuscite e potenziali casi di contaminazione. 5. Avvertenza - Rischio biologico: Tutti i campioni devono essere manipolati come potenzialmente infettivi utilizzando procedure di laboratorio sicure come quelle indicate in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6 e nel documento NCCLS M29-T 7. Pulire e disinfettare con cura tutte le superfici di lavoro utilizzando candeggina (NaClO) all'1%. Sterilizzare in autoclave qualsiasi apparecchiatura o materiale che sia entrato in contatto con campioni clinici prima di procedere allo smaltimento. 6. Avvertenza - Rischio biologico: Il bromuro di etidio utilizzato per la colorazione del DNA è un potenziale agente cancerogeno. Durante l'impiego di gel colorati e bromuro di etidio, indossare sempre guanti in nitrile. 7. Cautela: Indossare una protezione anti-uv per gli occhi e non guardare direttamente la fonte di luce UV a occhio nudo durante l'analisi o la fotografia dei gel. 8. Cautela: Le pipette utilizzate per le operazioni post-pcr non devono essere utilizzate per le operazioni pre-pcr. 9. Cautela - Contaminazione: Evitare la contaminazione batterica dei reagenti durante il prelievo di aliquote dalle provette dei reagenti. Indossare sempre i guanti per evitare qualsiasi rischio di contaminazione dei campioni. Si consiglia di utilizzare pipette e puntali con filtro monouso e sterili. Non utilizzare reagenti con evidenti tracce di torbidità o contaminazione batterica. 10. Cautela - Smaltimento: Smaltire i reagenti non utilizzati e le sostanze di scarto in conformità con le normative comunitarie, nazionali, regionali e locali. 11. La scheda dei dati di sicurezza dei materiali (MSDS) è disponibile per il download all'indirizzo oppure su richiesta presso il rappresentante locale di Dynal Biotech (Ved. i numeri di telefono elencati nell'ultima pagina del presente inserto.) MATERIALE RICHIESTO NON FORNITO DA DYNAL BIOTECH: 1. Pipette calibrate per uso manuale (ad es. Eppendorf, Gilson) 2. Puntali con filtro per pipette sopra indicate 3. Vortex 4. Microcentrifuga 5. Vassoio per la conservazione delle microprovette di PCR 6. Perkin-Elmer GeneAmp 9600 o 9700 o qualsiasi altro amplificatore approvato con specifiche equivalenti 7. Piastra scaldante/forno a microonde per la preparazione dei gel di agarosio 8. Apparecchiatura per elettroforesi (ad es. ABgene Electro-Fast Stretch 108 Complete, AB- 0708) 9. Transilluminatore UV 10. Sistema di documentazione per immagini/macchina fotografica per i gel 11. Taq polimerasi ricombinante (Dynal raccomanda AmpliTaq ) 12. Agarosio per gel 13. Bromuro di etidio Pagina 5 di 15

6 PROCEDURA NOTA: Questa procedura deve essere eseguita in due aree distinte del laboratorio (pre-amplificazione e post-amplificazione) come indicato nelle istruzioni seguenti. RACCOLTA E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Attenzione: Manipolare tutti i campioni come potenzialmente in grado di trasmettere agenti infettivi. a) NON UTILIZZARE SANGUE IN EPARINA 8 b) Il DNA può essere estratto da cellule nucleate umane utilizzando il metodo di preferenza c) Per ottenere risultati ottimali di amplificazione e di tipizzazione utilizzare DNA con un elevato grado di purezza (rapporto OD 260:280 compreso tra 1,6 e 1,8). d) La concentrazione finale del DNA prima della PCR deve essere di circa 50 ng/µl e) Il DNA estratto deve essere diluito in dh 2 0 f) Il DNA può essere conservato a -20 C o a temperature inferiori per periodi più prolungati (> 1 anno) senza influire sulla qualità dei risultati. Se conservato a +4 per lunghi periodi il DNA si degrada, dando luogo ad una maggiore quantità di artefatti, come ad esempio amplificazioni non specifiche. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PER LA PCR (eseguita nell'area di pre-amplificazione) Per eseguire una singola tipizzazione preparare la seguente miscela di PCR. Per i volumi necessari (in funzione del numero di reazioni di PCR per test), consultare la tabella riportata nella pagina seguente. Master Mix DNA del campione (50 ng/µl) AmpliTaq DNA polimerasi (5 u.i./µl ) Miscelare accuratamente Dispensare 10 µl della miscela PCR in ciascuna provetta della piastra Dynal AllSet + o CombiSet + SSP Apporre i tappi e chiudere accuratamente in modo da sigillare perfettamente le provette. Si possono utilizzare chiudiprovette appositi. È inoltre possibile utilizzare le apposite pellicole sigillanti. I campioni sono ora pronti per l'amplificazione. Conservare i reagenti del kit di tipizzazione non utilizzati a 2-8 C Pagina 6 di 15

7 Tabella per la Preparazione della Miscela di PCR: Reazioni di PCR per test Master Mix (µl ) DNA (µl ) AmpliTaq (µl ) NOTA: Le reazioni di PCR in numero dispari non vengono riportate nella tabella, fare riferimento al numero pari successivo (ad es., nel caso di un test con 13 reazioni di PCR fare riferimento ai volumi indicati per 14 reazioni di PCR). Pagina 7 di 15

8 CONFIGURAZIONE DEL VASSOIO L orientamento corretto del vassoio è assicurato dalla miscela di primer della provetta numero uno (identificata anche dalla presenza di un colorante blu), contrassegnata dal numero di lotto stampato di lato e.g HLA-X QUALSIASI ALTRO NUMERO STAMPATO SUL VASSOIO IN PLASTICA, AD ES. 1, 2, 3, DEVE ESSERE IGNORATO AMPLIFICAZIONE (eseguita nell'area di post-amplificazione) 1. Collocare il vassoio AllSet + o CombiSet + SSP nel termociclatore Impostare i seguenti parametri: Fasi Temperatura Tempo Azione ( C) (sec.) Denaturazione Denaturazione 10 cicli cicli Denaturazione Allineamento Estensione Denaturazione Allineamento Estensione Per informazioni specifiche sul termociclatore fare riferimento al manuale del produttore 2. Dare inizio al programma 3. A programma ultimato togliere i campioni dal termociclatore NOTA: Non portare il DNA amplificato nell'area di pre-amplificazione. Pagina 8 di 15

9 ANALISI DELLE REAZIONI DI PCR MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO Nota: Si raccomanda di utilizzare lo stesso tampone per la preparazione del gel e del tampone di corsa; ciò significa che se si utilizza TBE 0.5x per il gel è necessario utilizzare TBE 0.5x anche come tampone di corsa. 1. Preparare un gel di agarosio al 2% (p/v) (ad es.abgene MultiABgarose, AG-0100c) in tampone TBE 0.5x a) Far sciogliere l'agarosio (2 g/100 ml di tampone TBE 0.5x) mediante ebollizione nel forno a microonde fino al completo scioglimento Lasciarlo raffreddare a 60 C. Aggiungere bromuro di etidio alla concentrazione finale di 0.5 µg/ml di gel b) Versare il gel nell apposito vassoio in modo da ottenere 3-4 mm di spessore e pozzetti profondi 3 mm. Lasciare solidificare per almeno 15 minuti. 2. a) Trasferire il gel di agarosio nella cella elettroforetica. Il gel deve essere coperto da TBE 0.5x per almeno 1-2 mm. Rimuovere con cautela il pettine Caricare in sequenza tutto l amplificato di ogni reazione in ogni pozzetto del gel 3. Far correre i gel nel tampone TBE 0.5X Far correre i minigel (gel con una distanza <10 cm tra i due elettrodi) per 10 minuti a 15 V/cm, i gel più grandi per 15 minuti a 10 V/cm. Per calcolare il voltaggio misurare la distanza (in centimetri) tra gli ELETTRODI della cella elettroforetica (la lunghezza del gel NON È IMPORTANTE). 4. Esaminare il gel al transilluminatore UV e scattare la fotografia. 1. Lo stesso tampone TBE 0.5x può essere utilizzato più volte anche se l'impiego del tampone fresco aumenta la nitidezza dei segnali. AVVERTENZA: Il bromuro di etidio è un potente agente mutageno. Indossare guanti in nitrile e proteggere adeguatamente gli occhi durante la manipolazione dei gel o delle soluzioni contenenti bromuro di etidio. Pagina 9 di 15

10 LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA 1. L'elevata sensibilità analitica della PCR rende necessario procedere con estrema cautela al fine di preservare la purezza dei reagenti del kit o delle miscele di amplificazione. Assicurarsi che il flusso di lavoro all'interno del laboratorio sia unidirezionale e che gli ampliconi della PCR non vengano portati nell'area di preparazione dei reagenti per la PCR. La purezza dei reagenti può essere preservata solo attenendosi alle Buone Pratiche di Laboratorio. I risultati attesi possono essere garantiti se si osservano rigorosamente le procedure descritte nel presente inserto. 2. I prodotti Dynal AllSet + e CombiSet + sono stati sviluppati utilizzando esclusivamente campioni di sangue intero non eparinato o campioni di DNA purificati. Non sono stati valutati risultati con altre tipologie di campioni. 3. Il campione di DNA costituisce lo stampo per il processo di amplificazione e la sua qualità deve rientrare nei valori indicati sia in termini di purezza che di concentrazione. 4. Con questi prodotti è possibile utilizzare qualsiasi termociclatore approvato, a condizione che le specifiche dello strumento siano equivalenti a quelle dello strumento Perkin-Elmer GeneAmp PCR 9600 o Verificare che tutti gli strumenti e le apparecchiature siano calibrati in base alle specifiche del produttore. RISULTATI ATTESI Controllo di Qualità Il Controllo di Qualità e l'aggiornamento dei prodotti per la tipizzazione tissutale basata sul DNA sono estremamente importanti. Gli oligonucleotidi di sintesi devono essere sottoposti a numerosi test con DNA di linee cellulari note. Le soluzioni dei primer devono essere testate con DNA positivi e negativi con sequenze molto simili. La procedura del controllo di qualità si svolge nel modo seguente: Test dei primer sintetizzati con un pannello di DNA di linee cellulari ben caratterizzate Test di una soluzione di primer specifica con un pannello di DNA positivi e negativi Test del set di SSP completo Test del prodotto finale Controllo Interno La coppia dei primer di controllo 9 viene inserito per verificare l'efficienza della reazione PCR. La sua presenza conferma che la mancanza di un'amplificazione specifica in una determinata reazione è effettivamente dovuta all'assenza di quel polimorfismo nel campione di DNA e non al fallimento della reazione di PCR. A causa delle diverse concentrazioni e delle differenti temperature di ibridazione della coppia di primer specifici rispetto alla coppia di primer di controllo: - L'intensità della banda di controllo spesso diminuisce in presenza di un'amplificazione specifica e - I primer del controllo interno sono più sensibili a condizioni di PCR non ottimali e possono essere utilizzati per monitorare l'efficienza della PCR. L assenza di amplificazione del controllo interno in reazioni senza amplificazioni specifiche deve essere interpretata come segno che il sistema in cui si opera non è in condizioni ottimali. Per l identificazione delle possibili cause e delle azioni correttive da eseguire fare riferimento alla Guida alla risoluzione dei problemi. Le informazioni specifiche riguardanti il Controllo Positivo Interno sono contenute nell'opuscolo informativo che accompagna ogni kit. Pagina 10 di 15

11 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L'assegnazione degli alleli viene eseguita in base alla presenza di uno specifico prodotto di PCR. Un'amplificazione specifica indica che i campioni di DNA contengono l'allele, oppure uno degli alleli del gruppo definito dalla coppia di primer in quella determinata reazione di PCR. La tabella di interpretazione fornita con ciascun lotto può essere utilizzata per assegnare l'allele o il gruppo di alleli identificato dalle rispettive soluzioni di primer. Nella maggior parte dei kit Dynal AllSet + o CombiSet + SSP, non in tutti, ciascun allele o gruppo di alleli è amplificato da più di una soluzione di primer. È importante verificare che tutte le soluzioni dei primer che dovrebbero risultare positive in quanto portatrici di quell'allele o gruppo di alleli lo siano effettivamente. Sebbene gli alleli vengano assegnati in base alla presenza del prodotto di PCR, le dimensioni relative dei prodotti di PCR possono essere di aiuto nell'interpretazione delle tipizzazioni mediante SSP. Le dimensioni approssimative dei prodotti di PCR specifici possono essere utilizzate per distinguere un'amplificazione positiva vera e propria da: - artefatti di oligomeri (primer dimer) - carry over da pozzetti adiacenti - amplificazioni non specifiche Nella tabella di interpretazione fornita con ciascun kit Dynal AllSet + e CombiSet + SSP viene indicata la sequenza dei tre nucleotidi terminali, che determinano la specificità dell'estremità 3 sia del primer forward che del primer reverse. Per i prodotti HLA di Classe I viene indicata la posizione del nucleotide negli esoni 2, 3 o 4 corrispondente all'estremità 3 dei primer. Per i kit HLA AllSet + SSP di Classe II, viene indicata la posizione del codone corrispondente all'estremità 3 dei primer. Se si dispone della sequenza di un nuovo allele non elencato nella tabella di interpretazione, le informazioni sulla sequenza del primer possono essere utilizzate per scoprire il pattern di amplificazione del nuovo allele. In questo caso si prega di contattare il Servizio Tecnico via hla@dynalbiotech.com o via fax: Interpretazione mediante Dynal SSPTool Dynal SSPTool è un software appositamente concepito come supporto nell'interpretazione dei risultati. Le tabelle di interpretazione di ogni lotto specifico dei kit AllSet + e CombiSet + SSP vengono inserite nel database del software. Il database viene aggiornato in concomitanza con la produzione di nuovi lotti. Per qualsiasi richiesta di assistenza e di informazioni riguardanti l'inserimento dei risultati e l'utilizzo del software fare riferimento alla sezione Help del programma SSPTool. Per ordinare una copia gratuita del Dynal SSPTool (codice prodotto ), rivolgersi al rappresentante locale di Dynal Biotech. Pagina 11 di 15

12 GUIDA ALLA RISOLUZIONE DEI PROBLEMI PROBLEMA CAUSA AZIONE Amplificazione assente (né amplificazione del controllo interno, né amplificazione specifica) Quantità insufficiente del DNA Il DNA contiene inibitori della PCR, ad es. proteine, etanolo (dalle fasi di precipitazione). Il DNA è stato estratto da sangue eparinato Controllare che il volume e la concentrazione del DNA siano corretti. Determinare la qualità del DNA. Seguire esattamente il metodo di estrazione del DNA indicato dai fornitori. Provare un metodo alternativo per l'estrazione del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA Utilizzare sangue non eparinato, oppure provare il trattamento con eparinasi (ved. rif. 8) Il DNA è sospeso in tampone contenente EDTA Ripetere l'estrazione del DNA e sospenderlo in acqua sterile I tappi delle provette di PCR non chiusi ermeticamente sono Accertarsi che tutti i tappi siano chiusi ermeticamente. Episodi casuali di mancata causa di evaporazione e successivo fallimento Utilizzare gli appositi chiudiprovette amplificazione dell amplificazione Controllare che siano stati caricati correttamente i pozzetti e che Errori di caricamento del gel ciascuno contenga una quantità simile di miscela di PCR Calibrare regolarmente tutte le pipette in base alle indicazioni dei Utilizzo di pipette non calibrate fornitori Errori di pipettamento Eseguire con maggiore attenzione il pipettamento Il DNA, la Taq polimerasi o la miscela di PCR non sono Miscelare brevemente mediante vortex miscelati adeguatamente prima dell'impiego Determinare la qualità del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA Controlli Interni deboli DNA impuro con soluzioni appena preparate. Amplificazione non specifica (ladder o smear) Quantità di DNA insufficiente Temperatura di ibridazione eccessiva, il termociclatore non è calibrato Quantità insufficiente di DNA polimerasi termostabile DNA polimerasi termostabile di bassa qualità DNA non pulito (Alcune miscele di primer presentano una maggiore tendenza a dare luogo ad amplificazione non specifica, ved. note a piè di pagina delle Tabelle di Specificità) Determinare la concentrazione del DNA e diluirlo a 50 ng/µl Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP deve essere calibrato ogni 6 mesi. Utilizzare una quantità maggiore di enzima nelle reazioni di PCR Utilizzare Amplitaq Perkin-Elmer Tutti i frammenti di dimensioni maggiori rispetto al controllo interno possono essere ignorati Controllare la qualità del DNA Ripetere l'estrazione del DNA L'assenza di DNA può anche causare smear Preparare una nuova soluzione di bromuro di etidio in modo tale da ottenere una migliore colorazione del gel. Segnali di amplificazione La soluzione di etidio bromuro per la colorazione del gel di progressivamente più deboli agarosio è vecchia Una delle lampade UV è rotta Controllare l'apparecchiatura di illuminazione UV. Amplificazioni false-negative Amplificazioni false-positive Pattern di amplificazione anomalo Temperatura di ibridazione eccessiva, il termociclatore non è calibrato Potrebbero essere causate da contaminazione DNA non pulito Temperatura di ibridazione troppo bassa Il termociclatore non è calibrato È stata utilizzata la tabella di interpretazione sbagliata Il pattern di amplificazione contiene un "falso-positivo" Nuovo allele, non compreso nella tabella di interpretazione Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR impostato. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP deve essere calibrato ogni 6 mesi. Utilizzare guanti, puntali con filtro, eseguire le operazioni di pre e post-pcr in aree separate. Manipolare con cura i campioni in tutte le fasi. Controllare l'eventuale contaminazione utilizzando primer per il controllo della contaminazione Dynal (codice prodotto ) Determinare la qualità del DNA. Ripetere l'estrazione del DNA con soluzioni appena preparate. Calibrare il termociclatore e controllare il programma di PCR impostato. Un termociclatore utilizzato di routine per PCR-SSP deve essere calibrato ogni 6 mesi. Controllare che il numero di lotto del prodotto utilizzato corrisponda a quello della tabella di interpretazione. Controllare che tutte le amplificazioni siano delle dimensioni corrette o se un artefatto (carry-over, dimero) è stato erroneamente interpretato come un'amplificazione Ripetere la tipizzazione. Se il nuovo pattern di amplificazione è riproducibile, si prega di contattare il rappresentante locale Dynal Biotech per informazioni sul pattern di amplificazione di alleli di recente descrizione. Utilizzare il tampone TBE consigliato. Far correre il gel ad un voltaggio inferiore Bande sfocate e indistinte Il tampone di elettroforesi può essere caldo Il pettine utilizzato ha i denti troppo spessi Utilizzare pettini con denti sottili (4 x1mm) Corsa non adeguata dell'amplicone Il tampone di corsa e il tampone utilizzati presentano una concentrazione differente Tampone di corsa non compatibile con l'amplicone Bolle d'aria nella pipetta Utilizzare lo stesso tampone per il gel e per il tampone di corsa Si consiglia TBE 0.5x Pipettare adeguatamente Pagina 12 di 15

13 BIBLIOGRAFIA 1) Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 20 dic. 1985;230(4732): ) Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K. e Wallace, R. B. (1989). Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A 86(8), ) Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J. C. & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 17(7), ) Olerup, O. & Zetterquist, H. (1992). HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation [ved. commenti]. Tissue Antigens 39(5), ) Bunce, M., O'Neill, C. M., Barnardo, M. C. N. M., Krausa, P., Browning, M. J., Morris, P. J. e Welsh, K. I. (1995b). Phototyping: Comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens 46(5), ) Richmond, Y. e McKinney, W. (ed.) Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. HHS Publication N. (CDC) ) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Tentative Guideline. NCCLS Document M29-T Villanova, PA:NCCLS, ) Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, Bunce M, Bell JI.Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet. 11 giugno 1994;343(8911): ) Bein G, Glaser R, Kirchner H. Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue Antigens. feb. 1992;39(2):68-73 Pagina 13 di 15

14 GARANZIA I prodotti sono garantiti per l'acquirente originale solo per essere conformi alla quantità e al contenuto indicati sul flacone o sulle etichette esterne per la durata indicata. L'obbligo di Dynal Biotech e l'unico risarcimento per l'acquirente previsti dalla presente garanzia si limitano alla sostituzione, a spese di Dynal Biotech, di qualsiasi prodotto che presenti difetti di produzione e che sia restituito a Dynal con pagamento anticipato del trasporto, o a discrezione di Dynal Biotech, al rimborso del prezzo di acquisto. I reclami per merci danneggiate durante il trasporto devono essere presentati allo spedizioniere. La presente garanzia non verrà applicata a prodotti che abbiano subito alterazioni al di fuori di Dynal Biotech, né a prodotti sottoposti a uso improprio o cattivo uso. TUTTE LE ALTRE GARANZIE, ESPRESSE, IMPLICITE O LEGALI, SONO SPECIFICATAMENTE ESCLUSE, INCLUSE MA NON LIMITATAMENTE AD ESSE, LE GARANZIE DI COMMERCIABILITÀ O IDONEITÀ A SCOPI PARTICOLARI. La responsabilità massima di Dynal Biotech è limitata in ogni caso al prezzo dei prodotti venduti da Dynal Biotech. IN NESSUN CASO DYNAL BIOTECH SARA RESPONSABILE PER DANNI PARTICOLARI, INCIDENTALI O DIRETTI. Alcuni stati non pongono limiti a garanzie o risarcimenti in caso di violazioni in determinate transazioni. In tali stati, i limiti di cui sopra potrebbero non essere applicati. Il presente prodotto non può essere in alcun modo reimballato, riformulato o rivenduto senza il consenso scritto di Dynal Biotech Ltd, UK. MARCHI DI FABBRICA UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/ PRODOTTO Dynal è un marchio registrato di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia AllSet e AllSet + sono marchi registrati di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia DynaMix è un marchio di DYNAL BIOTECH Ltd., U.K. CombiSet e CombiSet + sono marchi di DYNAL BIOTECH., U.K. SSPTool è un marchio di DYNAL BIOTECH A.S.A, Oslo, Norvegia AmpliTaq è un marchio registrato di Roche Molecular Systems, Inc. USA. Electro-Fast è un marchio registrato di Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene ) GeneAmp è un marchio di Roche Molecular Systems, Inc. USA BREVETTI UTILIZZATI NEL PRESENTE DOCUMENTO/PRODOTTO * I prodotti Dynal SPP sono venduti sul licenza concessa da ZENECA Ltd. ARMS in base al brevetto europeo N e dei corrispondenti brevetti internazionali. ARMS è un marchio registrato di ZENECA Ltd. ** Questo prodotto è STATO ottimizzato per l'impiego nel processo di reazione a catena della polimerasi (PCR ) protetto da brevetti di proprietà di Roche Molecular Systems Inc. e F. Hoffmann-La Roche Ltd (Roche ). Con l'acquisto di questo prodotto, all'acquirente non viene concessa alcuna licenza espressa o implicita di utilizzo del processo di PCR coperto da tali brevetti. Per ulteriori informazioni sull'acquisto di licenze per l utilizzo del processo di PCR, contattare il Director of Licensing presso Roche Molecular Systems,, Inc.,1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, per quanto riguarda gli Stati Uniti e il PCR Licensing Manager, F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basilea, Svizzera, per gli altri paesi. Prodotto da Dynal Biotech Ltd.,U.K. Sviluppato da Dynal Biotech Ltd.,U.K. Pagina 14 di 15

15 CONTATTI Dynal Biotech Ltd., 11 Bassendale Road, Croft Business Park, Bromborough, Wirral, CH62 3QL, U.K. Tel: , Fax: Internet: Dynal Biotech A.S.A DYNAL BIOTECH GmbH PO Box 114 Smestad, Bramfelder Chaussee 41 N-0309, Oslo, Norvegia Hamburg, Germania Tel: Tel: Fax: Fax: Internet: Dynal Biotech Inc. Dynal Biotech A.S.A HLA Diagnostics Division Centre de Transfert de I'U.T.C., 555 Andorra Glen Court 66 Avenue de Landshut Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, USA Compiègne, Francia Toll Free: DYNAL TT ( ) Tel: Tel: Fax: Fax: dynal.france@wanadoo.fr hla.us.cust.serv@dynalbiotech.com Dynal Biotech Pty PO Box 204, Carlton South, Victoria 3053, Australia Tel: Tel: Fax: Numero verde NZ: techserv@dynal.com.au Per informazioni sui distributori Dynal a livello mondiale, contattare Dynal Biotech Ltd. Copyright 2003 Dynal Biotech Ltd., U.K. Tutti i diritti riservati Stampato Rev. 000 Pagina 15 di 15