HI-TECH IN SANITA'. MINI-INVASIVITA' 2.0: nuove tecnologie al servizio dell'appropriatezza e della bioetica professionale

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1 HI-TECH IN SANITA'. MINI-INVASIVITA'.0: nuove tecnologie al servizio dell'appropriatezza e della bioetica professionale NGS: IMMUNOGENETICA E TRAPIANTI Michela Mazzocco S.C.Laboratorio di istocompatibilità e IBMDR 8 marzo 06

2 Il trapianto di organi è un intervento chirurgico che consiste nella sostituzione di un organo malato e quindi non più funzionante, con uno sano dello stesso tipo proveniente da un altro individuo che viene chiamato donatore. l trapianto di Cellule Staminali Emopoietiche (TCSE) consiste nell'infusione di CSE normali al fine di sostituire un sistema emopoietico anormale.

3 Il complesso HLA è situato sul braccio corto del cromosoma 6, su un segmento sufficientemente breve perché tutti i geni HLA portati da un cromosoma siano generalmente trasmessi in blocco dai genitori ai figli. Ogni genitore trasmette una serie di geni, il cosiddetto aplotipo. Gli alleli dei due aplotipi di un individuo sono espressi come tratti codominanti, cioè sono tutti espressi negli eterozigoti.

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5 Alleli di classe I Alleli di classe II Elevato polimorfismo dei geni HLA

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8 Cosa si definisce Campione di partenza Metodica Livello di risoluzione Molecolare Alleli DNA SBT, SSOP, SSP High-Resolution Typing Molecolare Gruppi allelici equivalenti agli antigeni DNA SSOP, SSP Low-Resolution Typing Sierologica Antigeni Cellule CDC CDC: complement-dependent cytotoxicity SBT: sequence-based typing SSOP: reverse sequence-specific oligonucleotide probe SSP: sequence-specific primer

9 Dal 005 S G N ION X E N G N I C N E U Q SE T A R E N E G T

10 Fragmentation Adaptor ligation Library preparation Target generation Flusso di lavoro per la tipizzazione HLA in NGS Clonal amplification Sequencing Data analysis

11 NGSgo - AmpX Amplification primer Amplified exon exon not amplified DQA HLA-A (. kb) HLA-B (. kb) HLA-C (. kb) 5 6 HLA-DRB (.7-.8 kb) 5 6 HLA-DQB (.7-. kb) HLA-DPB (5.0 & 5.7 kb) HLA-DPA (.7 kb) HLA-DQA ( kb) 5 6 HLA-DRB (.8 kb) 5 6 HLA-DRB (0. &. kb) 5 6 HLA-DRB5 (.0 kb) 5

12 Shotgun sequencing Target Amplification Fragment Adapter Target generation Amplify Sequence Analyse

13 Target 5 Fragment fragmentation Shotgun sequencing Adapter Amplify Sequence Analyse

14 Target Shotgun sequencing Adapter ligation Fragment Adapter Amplify Sequence Analyse

15 Target Shotgun sequencing indexing Fragment Adapter Amplify Sequence Analyse

16 Target generation Clonal amplification: (platform dependent strategies) Fragmentation Isolation of a single DNA fragment PCR amplification to generate clonal amplicon Adapter ligation Clonal amplification Sequencing Data analysis

17 Target Clonal amplification: Illumina approach Fragment Adapter Amplify Sequence Analyse

18 Target generation Massive parallel sequencing of millions of clonal amplicons: Fragmentation Platform dependent strategies Adapter ligation Clonal amplification Sequencing Data analysis

19 Target Illumina approach: sequencing by synthesis Fragment Adapter Amplify Sequence Analyse

20 Target Fragment Adapter NGS data analysis Software Alignment Haplotype phasing Genotype determination Amplify Sequence Analyse

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22 Target NGS data analysis Phasing Fragment Adapter Amplify G T C C R A G A G G G G A G C C G C G G G M G C C.... A A G C... Sequence.... A C G A... Analyse??

23 Considerazioni su HLA e NGS NGS è sicuramente un ottima evoluzione del tradizionale metodo di sequenziamento Sanger permette un amplificazione clonale e riduce le ambiguità nelle regioni sequenziate, non ci sono alleli alternativi grandi potenzialità di lettura di molte reads in poco tempo utilizzo del barcoding permette processazione di molti campioni contemporaneamente si ottengono alte risoluzioni con un bassissimo tasso di errore (accuratezza >99,9%) in un unica metodica velocità di interpretazione dei risultati grazie a software dedicato presto sarà economicamente ancora più vantaggioso con NGS è possibile indagare sui meccanismi attraverso cui i geni HLA sono modulati nella loro espressione

24 NGS E TRAPIANTI LO STUDIO DEI GENI HLA IERI: sierologia

25 LO STUDIO DEI GENI HLA OGGI: SBT LASTRE AUTORADIOGRAFICHE SEQUENZIATORE ABI 70 a 96 capillari

26 LO STUDIO DEI GENI HLA DOMANI: NGS Illumina Applied Biosystems Ion Torrent Sequenziamento di Terza Generazione Oxorfor Nanopore Technologies PacBio RS II

27 ª Convention Galliera - 06 Grazie per l'attenzione!