Polymerase chain reaction (PCR) qualche ora

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1 Lezione 3 Metodologie di sequenziamemento di DNA ed RNA. Da Sanger sequencing ad High Throughput (HTS) o di Next Generation (NGS) o di seconda generation

2 Polymerase chain reaction (PCR) qualche ora

3 25 Aprile 1953 James D. Watson e Francis Crick pubblicano la struttura del DNA (Watson JD, Crick FHC "A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid", Nature vol. 171, pp ; 1953) fondando il campo della genetica molecolare. Premio Nobel nel Doppia elica

4 Metà degli anni 50: Arthur Kornberg inizia a studiare il meccanismo di replicazione del DNA. Nel 1957 identifica la prima DNA polimerasi. L enzima copia in una sola direzione e richiede degli inneschi preesistenti (primer) per iniziare a copiare il filamento. Premio Nobel nel Doppia elica 1957 DNApol Primi 60 Codice genetico Oligonucleoti di sintetici (primers) All inizio degli anni 60 Gobind Khorana chiarisce molti aspetti del codice genetico. Successivamente inizia un progetto per la sintesi in vitro di un gene umano e in questi esperimenti getta le basi per l utilizzo di oligonucleotidi sintetici (usati sia come blocchi per la costruzione del gene, sia come inneschi per la DNA polimerasi) Premio Nobel per il suo lavoro sul codice genetico.

5 1969 Thomas D. Brock isola un nuovo batterio dalle sorgenti calde dello Yellowstone National Park. Nel 1976 viene islata la DNA polimerasi di T. aquaticus (taq) in grado di mantenere la sua attività oltre i 75 C. Biotechnology in Yellowstone 1953 Doppia elica 1957 DNApol Primi 60 Codice genetico Oligonucleoti di sintetici (primers) 1969 taq 1975 Sanger sequencing 1975 Frederick Sanger sviluppa un metodo per determinare la sequenza del DNA. (Sanger F, Nicklen S, Coulson AR "DNA sequencing with chainterminating inhibitors" Proc Natl Acad Sci vol. 74(12) pp ; 1977). 1980: Premio Nobel. Nel 1980 tutti i componenti per fare un amplificazione con PCR sono conosciuti dalla comunità scientifica

6 K. Mullis C

7 Dal prodotto di PCR al sequenziamento di Sanger C C C

8 Dal prodotto di PCR al sequenziamento di Sanger Verifica dell avvenuta reazione (e possibile quantificazione), ad esempio per elettroforesi su gel di agarosio Prodotto di reazione Marker (frammenti a lunghezza nota) Purificazione del prodotto di PCR: Esempio Exo/SAP (dobbiamo pulire da dntps e primers residui)

9 Il sequenziamento di Sanger Elongation Strand Separation Primer Annealing Termination

10 Termination Standard Nucleotides Dye-labeled dideoxynucleotides ddntp incorporation leads to chain growth termination

11 Capillary Electrophoresis ABI 3730, 96-capillary

12 Un programma specifico opera il BASECALLING (converte i picchi in A, T, G, C) cromatogramma

13 Molto importante!!! Good quality I file prodotti dai sequenziatori automatici sono specifici e di solito hanno un estensione.seq oppure.abi Bad quality (background noise)

14 Apro il file.abi con un programma apposito che legge cromatogrammi (es. Chromas; BioEdit) Questi programmi hanno molte funzioni, quando sono soddisfatto delle mie correzioni posso esportare la sequenza in un formato di testo leggero e leggibile da molti altri programmi (es. programmi di allineamento): FORMATO FASTA Copy FASTA formatted

15 Il segno > contraddistingue il FASTA ed è obbligatorio identifier of the sequence (optional) >XFUS0058 CGTTAGAGGGGACGATTTCTACGTGCCTATGT CCAATGCCACCGGCATTGTTAGGGACCCGTAC GAGTATCCCCAGTACTACCTGGTGGCCCCGTG GGCATACGCCTGCCTGGCAGCGTACATGTTCT TCCTCATTCTCACCGGCTTCCCCGTCAACTTC CTCACCCTGTACGTCACCATCGAGCACAAGAA GCTGCGTACGCCTCTCAACTACATTCTGCTGA ACCTCGCCATTTCCGACCTCTTCATGGTGTTC GGCGGGTTCACCACGACGATGTACACCTCGTT GCACGGCTACTTCGTGTTCGGACGCCTCGGCT GCAACCTGGAAGGCTTCTTCGCGACCCTGGGC sequenza GGTGAAATGGGGCTGTGGTCCCTGGTCGTGCT GGCCTTCGAGAGGTGGATGGTGGTCTGTAAGC CCGTGAGCAACTTCCGCTTCGGAGAGAACCAC GCCATCATGGGCGTGGCCTTCACCTGGGTCAT GGCCTGCTCCTGCGCCGTGCCTCCCCTGGTGG GCTGGTCCCGTTACATCCCCGAGGGCATGCAG TGCTCGTGCGGAGTCGACTACTACACCCGCGC CCCCGGCTACAACAACGAGTCCTTCGTCATCT ACATGTTCATCGTGCACTTCATCATTCCGCTC ATCGTCATATTCTTCTGCTACGGCCGTCTTGT

16 Stranneheim and Lundeberg 2012

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19 2000

20 illumina

21 illumina

22 illumina

23 illumina 1800 Gb maximum output Huma genome: 3.3 Gb Che copertura (coverage) ottengo per un genoma con una run?

24 Ion Torrent

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28 the number of times a nucleotide is read during the sequencing process

29 Applications Espressione genica Caratterizzazione regioni di interazione DNA-proteine Epigenetica

30 Applications: genomes, exomes, transcriptomes

31 Applications

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34 Applications environmental DNA (edna) Can be avoided

35 library Frammentazione Size selection Legame adattatori Template preparation Serve a reggiungere una quantità di DNA stampo sufficiente per la lettura del sequenziamento sequencing Sequencing by synthesis Lettura del segnale

36 Preparazione della library

37 Preparazione della library Il DNA va pre-processato prima di essere sequenziato Passaggi: 1. Frammentazione (fisica o enzimatica) 2. Le estremità dei frammenti vengono riparate e rese «blunt» o con specifici nucleotidi terminali (es A o T) 3. Alle estremità vengono legati degli adattatori specifici per ogni NGS technology

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39 Preparazione della library

40 Preparazione della library

41 Preparazione della library: Illumina

42 Preparazione della library: Illumina

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46 Roche Ion Torrent

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48 Gli adattatori P5 e P7 servono per legare il frammento da sequenziare alla flow cell dove ci sono delle sequenze complementari e servono anche da primer

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56 Release of an H+ during extension (Ion Torrent)

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58 Thermo fisher Summary (NB: i numeri sono indicativi, dipendono molto dalle condizioni che si usano per il sequenziamento, nel caso di Ion Torrent dai chip e di Illumina dai kit usati) Ion Torrent PGM (different chips) S5 series (different chips) Illumina HiSeqSeries Fluorescence: reversible NextSeq terminators 500 Detection Run time Read lenght (bp) Reads per run (millions) Output per run (Gb) H+ release 2-7 h H+ release Max 24 h h - 6 days Max 2 x h Max 2 x MiSeq 4-55 h Max 2 x From Illumina and Life Technologies web sites, 2018

59 Human genome 3.3 gigabases Arabidopsis thaliana 135 megabases (0.135 Gb) Escherichia coli (str. K-12 substr. MG1655) 5.17 megabases ( Gb) Che coverage posso attendermi se sequenzio questi genomi con le seguenti piattaforme 1. HiSeq Illumina 2. NextSeq Illumina 3. MiSeq Illumina 4. PGM Ion torrent Per scegliere la piattaforma devo valutare anche i costi di una corsa!

60 van Dijk et al. TIG 2014 Graph showing the evolution of the cost of sequencing a human genome from 2001 until today. Costs have sharply decreased over the recent years thanks to the appearance of next-generation sequencing (NGS) technologies and their subsequent upgrades. Very recently, the milestone of the US$1000 genome has been reached with Illumina s HiSeq X Ten system