FACOLTA DI BIOTECNOLOGIE

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1 Università degli studi di Torino FACOLTA DI BIOTECNOLOGIE Corso di laurea di secondo livello in Biotecnologie Curriculum Biomolecolare Relazione del seminario di Biochimica: p53 E L APOPTOSI Referente: Scuoppo Claudio Studente: Aramu Simona Anno Accademico 2004/2005

2 INTRODUZIONE: L apoptosi è la morte programmata cellulare ed è un meccanismo intrinseco di autodistruzione della cellula. Si tratta di un fenomeno molto importante durante l embriogenesi (es. nella regressione delle pliche interdigitali); nella metamorfosi e durante la vita dell adulto (es. per il mantenimento dell omeostasi numerica tissutale; nella selezione clonale negativa dei linfociti T autoreattivi; in presenza di atrofia dovuta ad assenza di stimolazione; nella distruzione di quelle cellule il cui DNA risulta danneggiato o mutato). L apoptosi, la cui prima descrizione morfologica risale al 1842 da parte di Vogt, ha inizio con la perdita dei microvilli e delle giunzioni intercellulari, la riduzione del volume cellulare e alterazioni morfo-funzionali del nucleo (addossamento della cromatina) e termina con la frammentazione della cellula in corpi apoptotici. Si tratta di un processo attivo che richiede energia, trascrizione genica e sintesi proteica e risulta dal bilancio tra i segnali di morte e di sopravvivenza. Per quanto riguarda le caratteristiche biochimiche, la morte programmata è caratterizzata dall esternalizzazione della fosfatidilserina ad opera della flippasi e dall attivazione di enzimi come le caspasi, cistein-proteasi iniziatrici ed effettrici, attivate in seguito ad auto-clivaggio e responsabili, a loro volta, del clivaggio di substrati a valle; le transglutaminasi, che creano legami molto forti tra le proteine per formare uno scaffold protettivo nella membrana cellulare per la resistenza ad agenti litici; le endonucleasi, che degradano la cromatina in frammenti caratteristici tutti multipli di 200 pb (ladder pattern). L apoptosi può essere innescata tramite due vie: la via estrinseca o recettoriale e la via intrinseca o mitocondriale. La prima via passa attraverso l attivazione di specifici recettori (Fas, CD95, Killer/DR5), i cui domini di morte (death domain o DD) nella porzione intracellulare sono in grado di reclutare specifiche molecole adattatrici, come FADD, i cui domini effettori di morte (death effector domain o DED) sono, a loro volta, in grado di reclutare i DED domain di specifiche caspasi iniziatrici come la caspasi 8: a questo punto, due caspasi 8 vengono a trovarsi vicine e si auto-clivano secondo la logica trans e danno origine a un tetramero attivo, con attività cistein-proteasica nei confronti di caspasi effettrici e di altri specifici substrati a valle (Fig 1B). La via intrinseca, invece, è innescata, da una parte, tramite l attivazione di specifiche proteine pro-apoptotiche come Bid, Bad, Bak e Bax e dall altra, tramite l inattivazione di proteine anti-apoptotiche come Bcl-2 e Bcl-X L. Il bilancio tra le prime e le seconde proteine determina il prevalere dell apoptosi o della

3 sopravvivenza cellulare. Quando nella cellula prevalgono le proteine pro-apoptotiche, si ha un aumento della permeabilità mitocondriale e il conseguente rilascio del citocromo c, che attiva e fa assumere una conformazione distesa ad Apaf-1, i cui CARD domain sono in grado di interagire con i CARD domain di caspasi iniziatrici, come la caspasi 9 (Fig 1A). Fig.1 Le due vie apoptotiche sono strettamente correlate e dipendenti l una dall altra: l attivazione della via estrinseca, e quindi della caspasi 8, porta al clivaggio della proteina pro-apoptotica Bid, dando origine alla forma tronca tbid, che agisce direttamente a livello mitocondriale sulle proteine Bax e Bak, inducendo la loro oligomerizzazione. Gli oligomeri di Bax e Bak, che si sono così formati, danno origine alla formazione di veri e propri pori sulla membrana esterna del mitocondrio, favorendo l aumento della permeabilità mitocondriale e il conseguente rilascio del citocromo c, dell endonucleasi G, di Smac/Diablo (proteina che lega e inibisce le XIAP, cioè le proteine che inbiscono l apoptosi), di AIF (il fattore che induce apoptosi) e di altri fattori apoptotici (Fig.2).

4 Fig.2 P53 E L APOPTOSI: p53 è un oncosoppressore essenziale per prevenire una proliferazione inappropriata delle cellule e per mantenere l integrità del genoma in seguito all attivazione di specifici oncogeni o in seguito a vari stimoli di stress genotossici. I livelli di p53 sono tenuti bassi dal suo normale turnover di proteolisi da parte dell ubiquitina ligasi MDM2. Una volta attivata, p53 può indurre, a seconda delle circostanze, l arresto del ciclo cellulare o l apoptosi. Ma da cosa dipenda l attivazione dell uno o dell altro fenomeno non è ancora chiaro. Ci sono diversi modelli che danno possibili spiegazioni riguardo l azione di p53 nell induzione di questi fenomeni; due di questi modelli sono: p53 dumb e p53 smart (K.H.Vousden, Cell 2000). Secondo il primo modello, l induzione da parte di p53 dei geni per l arresto del ciclo cellulare e dei geni apoptotici è la stessa in tutte le condizioni. In base al modello p53 smart, invece, l espressione differenziale delle due categorie di geni sarebbe causata da p53 stessa: in particolare, è stato visto che alti livelli di p53 attivano preferenzialmente i geni apoptotici, i cui promotori, infatti, sono legati da p53 a bassa affinità. Inoltre, modificazioni post-traduzionali di p53, ad esempio, la fosforilazione sul residuo di serina 46, favorirebbero la trascrizione dei geni apoptotici: questo sarebbe dovuto al fatto che tali modificazioni alterano la specificità di legame di p53 ai promotori apoptotici e a co-attivatori specifici per l apoptosi (Fig.3).

5 Fig.3 Tra i co-attivatori specifici per l apoptosi vi sono: ASPP1, p63, p73 e STAT1; perché le cellule vadano in apoptosi, p21, ossia l inibitore delle chinasi, cicline-dipendenti, deve essere inibito, altrimenti si avrebbe l arresto del ciclo cellulare e non apoptosi. E importante che p21 e la proteina σ siano inattive. A questo proposito, e stato visto che c-myc porta all apoptosi inibendo l arresto del ciclo cellulare. Questa proteina è, infatti, reclutata da Miz-1 per sopprimere in modo specifico il promotore di p21. Anche hdaxx è in grado di reprimere p21. Il bilancio tra p21 e PUMA, che interagisce con Bcl-2 e promuove la traslocazione al mitocondrio e la multimerizzazione di Bax, sembra essere decisivo nel determinare la risposta dell attivazione di p53. Inoltre, l arresto del ciclo cellulare potrebbe, in qualche modo, inibire la risposta apoptotica. La prevalenza di arresto del ciclo cellulare o di apoptosi dipende, inoltre, dall interazione del Fig.4 pathway di p53 con altri pathway cellulari: infatti, l attivazione dei target apoptotici da sola, non è sufficiente a indurre apoptosi in alcune cellule, e a prevenire l induzione di p21: altri regolatori del ciclo cellulare sono necessari per guidare le cellule verso l apoptosi. (Fig. 4) (J.Yu e L.Zhang, Molecular Cell Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001).

6 L induzione dell apoptosi da parte di p53 può avvenire in modo trascrizione dipendente e trascrizione indipendente, tramite un diretto reclutamento di p53 sulla membrana mitocondriale (Fig.5) (U.M.Moll, Letters 2001). Fig.5 Per quanto riguarda l induzione dell apoptosi in modo trascrizione dipendente, p53 attiva la trascrizione dei recettori di morte (DR5, CD95,Fas); di proteine proapoptotiche della famiglia BH 3 only (Bax, PUMA, NOXA, Bid); di adattatori apoptotici come Apaf-1; della proteina PIG-3 che induce stress ossidativo e causa un aumento dei radicali reattivi dell ossigeno; di IGF-BD (insulin growth factor-binding protein), che compete per il legame con l IGF1R, bloccando la via di trasduzione dei segnali di sopravvivenza trasmessi da questo recettore in presenza dell IGF1. Inoltre, p53 reprime la trascrizione di proteine anti-apoptotiche come Bcl-2 e Bcl-X L (Fig.6) (R.V. Sionov, Oncogene 1999). Fig.6

7 Quindi, p53 promuovendo la trascrizione dei propri target, attiva indirettamente sia la via estrinseca che la via intrinseca dell apoptosi. Nell articolo PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53, pubblicato sulla rivista Molecular Cell da Nakano e Vousden nel 2001, viene descritto il modo in cui è stato identificato PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis). Sono stati effettuati dei microarray per comparare i pattern di espressione in cellule con o senza p53. Con questo approccio, sono stati identificati diversi geni la cui espressione è attivata in risposta all induzione di p53. Tra questi, era stato trovato un gene, la cui sequenza era omologa ad un parziale cdna riportato nel database GenBank, che potenzialmente codificava una proteina contente il dominio BH3. Con maggior frequenza, sono state poi identificate due sequenza correlate che sembrano due varianti di splicing alternativo dello stesso trascritto (PUMA α e PUMAβ). Con diversi Northen Blot, usando una sonda specifica dell esone 4 di questi trascritti, è stato confermato che PUMA è indotto da p53 (Fig.7). Fig.7 Tramite esperimenti di immunofluorescenza, è stato visto che PUMA localizza al mitocondrio. Questa proteina inibisce la formazione di colonie in vitro e induce apoptosi, legando Bcl-2 e inducendo così il rilascio del citocromo c e l attività delle procaspasi 3 e 9. L inibizione dell espressione di PUMA, con specifici oligonucleotidi anti-senso, riduce l apoptosi mediata da p53 (Fig.8). Fig.8

8 Per quanto riguarda l induzione dell apoptosi trascrizione-indipendente, ci sono diversi modelli riguardo l azione di p53 a livello mitocondriale. In base al primo modello, p53 si lega alle proteine anti-apoptotiche Bcl-2 e Bcl-X L ed è successivamente spiazzata dalla proteina PUMA, la cui trascrizione è attivata da p53 stessa. In questo modo p53 sarebbe attivata, e quindi, potrebbe andare a legare le proteine Bax e Bak, inducendo la loro oligomerizzazione, con il conseguente aumento della permeabilità mitocondriale e il rilascio del citocromo c (Fig.9) (D.R.Green, Trends in genetics 2003). Fig.9 In base al secondo modello, p53 è in grado di legare solo Bcl-2 e Bcl-X L ; questo legame permetterebbe a Bak e Bax di sganciarsi da Bcl-2 e Bcl-X L, dalle quali sono tenute inattive in cellule in condizioni normali. L azione di p53 è proprio quella di inattivare Bcl-2 e Bcl-X L, in modo tale che Bak e Bax possano a questo punto essere attivate dalla forma tronca di Bid (tbid), uno degli attivatori dell apoptosi che induce la loro oligomerizzazione, con conseguente Fig.10 formazione dei pori sulla membrana mitocondriale esterna (Fig.10) (B.M Polster, Journal of neurochemistry 2003).

9 Concludendo, quindi, secondo il primo modello p53 si comporterebbe come un attivatore dell apoptosi, al pari di Bid e Bim, in quanto in grado di legare direttamente Bax e Bak; in base al secondo modello, invece, p53 si comporterebbe come un sensibilizzatore dell apoptosi, al pari di Bad e Bik, in quanto in grado di legare direttamente solo Bcl-2 e Bcl-X L e, quindi, in grado di attivare solo indirettamente Bak e Bax (Fig.11). Fig.11 In uno degli articoli pubblicati da Mihara et al. sulla rivista Molecular Cell nel 2003, P53 has an apoptogenic Role at the Mithocondria, viene dimostrato il ruolo di p53 come sensibilizzatore dell apoptosi e, quindi la validità del secondo modello. In timociti in coltura irradiati con radiazioni γ, p53 localizza, in tempi molto brevi, a livello mitocondriale (Fig. 12B), dove interagisce con Bcl-2 e Bcl-X L (Fig.12C) ma non con Bax e Bak (Fig.12D). Le interazioni di p53 sono state studiate effettuando nel primo caso un immunoprecipitazione con Bcl-XL e un blot anti-p53; nel secondo un immunoprecipitazione con p53 e un blot anti-bax. C D Fig.12

10 Utilizzando diversi costrutti di p53, privi del dominio di legame al DNA (DNA binding domain o DBD), i ricercatori hanno visto che p53 intergisce con Bcl-2 e Bcl- X L proprio tramite il suo DBD: infatti, il costrutto con i primi 100 amminoacidi di p53 non immunoprecipita con queste due proteine (Fig.13). Fig.13 Un ulteriore prova di questo è dato dal fatto che mutanti di p53 con mutazioni puntiformi nel DBD non sono in grado di interagire con queste due proteine antiapoptotiche (Fig 14). Fig.14 Inoltre, è stato visto che p53 induce indirettamente l oligomerizzazione di Bax e Bak (Fig.15F), e quindi, il rilascio del citocromo c (Fig 15C). Fig.15

11 Studi successivi hanno rilevato che p53, che viene reclutata a livello mitocondriale, è fosforilata sul residuo di serina 15 (Fig.16) (Park et al., Apoptosis 2005). Fig.16 L anno successivo, Mihara e il suo gruppo di ricercatori hanno condotto lo stesso tipo di studio in vivo (U.M.Moll, Molecular and Cellular Biology 2003). E stato effettivamente verificato che p53 localizza a livello mitocondriale, dopo irradiazioni con raggi γ, nel timo, nel testicolo, nalla milza e nel cervello ma non nel fegato e nel rene, dove sembra invece prevalere un induzione dell apoptosi da parte di p53 trascrizione-dipendente (Fig.17). Fig.17 Immagini al microscopio a fluorescenza attestano che p53 co-localizza con marker mitocondriali nel timo di topi irradiati (Fig 18). Fig.18

12 In modelli animali in cui p53 è priva di attività trascrizionale, non si ha neanche induzione dell apoptosi trascrizione-indipendente da parte di p53. Questo può essere dovuto principalmente a due motivi: 1) alla presenza di probabili mutazioni nel DBD, il che impedisce l interazione con Bcl-2 e Bcl-X L ; 2) al fatto che p53, priva di attività trascrizionale, non trascrive neanche la sua ubiquitina ligasi MDM2, che è essenziale per l esporto di p53 dal nucleo al citosol, e quindi, per la sua localizzazione mitocondriale. CONCLUSIONE: In conclusione, le due vie di induzione dell apoptosi trascrizione- dipendente e trascrizione-indipendente sono strettamente correlate, e quindi, mutazioni di p53 in cellule neoplastiche aboliscono contemporaneamente entrambe le attività. Nelle cellule tumorali, in cui p53 è mutata e Bcl-2 e Bcl-X L sono sovraespresse, e di conseguenza le cellule sono resistenti all apoptosi e sopravvivono. Infatti, in queste cellule, p53 non è in grado di attivare la trascrizione dei propri geni target, né di indurre apoptosi a livello mitocondriale. Possibili soluzioni terapeutiche potrebbero essere: A) la somministrazione di inibitori di Bcl-2 e Bcl-X L (Fig.19); Fig.19

13 B) la somministrazione di farmaci mimetici del dominio BH 3, in grado di mimare l azione delle proteine BH 3 only come Noxa e PUMA, che nelle cellule trasformate, in cui p53 è mutata, non sono ovviamente trascritte in modo efficiente (Fig.20). Fig.20

14 BIBLIOGRAFIA: p53: Death Star. Vousden, Cell, p53 Has a direct Apoptogenic Role at the mithocondria. Mihara et al., Molecular cell, In Vivo Mitochondrial p53 Translocation Triggers a Rapid First Wave of Cell Death in Response to DNA That Can Precede p53 Target Gene Activation. Erster et al., Molecular and Cellular Biology, Nuclear and mithocondrial apoptotic pathways of p53. Moll et al., Letters, Mithocondrial mechanism of neural cell apoptosis. Polster et al., Journal of Neurochemistry, Proteins of the Bcl-2 family in apoptosis signalling:from mechanistic insights to therapeutic opportunities. Chan et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Phisiology, The cellular response to p53:the decision between life and death. Sionov et al. Oncogene, Death and anti-death: tumor resistance to apoptosis. Igney and Krammer, Nature Review, Transcription, apoptosis and p53: catch-22. Shuler and Green, TRENDS in genetics, Phospo-ser 15-p53 traslocates into mithocondria and interacts with Bcl-2 and Bcl-xL in eugenol-induced apoptosis. Park et al, Apoptosis, The transcriptional targets of p53 in apoptosis control. J.Yu e L. Zhang, Biochemical and Biophysical Research Communications, PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53. Nakano evousden, Molecular Cell, 2001