Terapia genica. Oltre 5000 si sono sottoposti a trial di terapia genica intutto il mondo negli ultimi 15 anni

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1 Terapia genica Oltre 5000 si sono sottoposti a trial di terapia genica intutto il mondo negli ultimi 15 anni

2 ADA (adenosina deaminasi) Catalizza la deaminazione di adenosina e desossiadenosina in inosina e desossiinosina L accumularsi di metaboliti (nucleotidi) risulta tossica per linfociti T in via di maturazione I linfociti B non maturano per il mancato aiuto dei T linfociti I pazienti non possono fronteggiare le infezioni muoiono se non trattati Mutazioni nel gene dell ADA causano immunodeficienza (SCID, Severe Combined Immunodeficiency): virtualmente assente attivita di linfociti B e T Cure possibili: trapianto di midollo, somministrazione di PEG-ADA bovina Il gene (cdna) ADA è stato clonato nel 1983 Trascrive un mrna di 1.5 Kb che codifica una di proteina 363 aa. (= MW 41,000 daltons)

3 Il primo caso Il primo tentativo di terapia genica in assoluto è stato effettuato il 14 Settembre 1990 Ashanti DeSilva (4anni) affetta da SCID Severe combined immunodeficiency Sono stati prelevati i globuli bianchi ed in questi, tramite un vettore retrovirale, è stato inserito il gene corretto. Successivamente, le cellule sono state reiniettate in circolo. Il trattamento ha ripristinato il suo sistema immune Problema: l emivita dei leucociti è breve, preciò il trattamento dev essere ripetuto periodicamente Cynthia (9 anni) trattata nello stesso anno

4 Trial clinico per deficit ADA L espressione di ADA persiste a 12 anni dalla prima infusione di cellule modificate in una delle 2 pazienti trattate: 20% dei linfociti esprimono ancora ADA La 2a paziente ha invece sviluppato anticorpi contro componenti del sistema di infezione (FCS) e ha perso i linfociti trasdotti e l espressione di ADA

5 Trial clinico per deficit ADA

6 Emofilia A e B: Incidenza tra 1/5000 (Emofilia A) e 1/15000 (Emofilia B) maschi 80% Emofilia A (deficit del Fattore VIII) 20% Emofilia B (deficit del Fattore IX) Si verificano emorragie, talvolta fatali Il trattamento attuale consiste nella somministrazione per infusione in maniera terapeutica o di profilassi del fattore deficitario La correzione del deficit con il ripristino di almeno 1% della normale attività riduce significativamente il rischio di emorragie Il ripristino di almeno il 10% della normale attività eliminerebbe la maggior parte delle emorragie

7 Approcci per la terapia genica dell Emofilia: Iniezione diretta nel fegato Iniezione diretta nel muscolo Localizzazione nel midollo osseo Tranpianto di fibroblasti geneticamente-modificati

8 Iniezione diretta nel fegato Ex Vivo vs. In Vivo Ex Vivo: Prelievo di epatociti Modica in coltura Reinserimento nel paziente In Vivo: Iniezione diretta del vettore

9 Utilizzo di differenti Vettori per l inoculo nel fegato AAV (Adenovirus associated virus) Buona espressione di Fattore IX (Emofilia B) Sicuri Retrovirus Buona espressione di Fattore VIII e IX (Emofilia A e B) Sicuri Adenovirus Buona espressione di Fattore VIII e IX (Emofilia A e B) Tossicità Non una buona espressione in grandi animali

10 Retroviral Vectors Single stranded RNA virus that gets copied into DNA that integrates into the chromosome Classes of retroviral vectors: Oncoretroviral vectors require replication for gene transfer Lentiviral vectors do not require replication for gene transfer

11 Modalità di transfettare gli epatociti con Adulti: vettori retrovirali : Iniezione di HGF (hepatocyte growth factor) prima dell inoculo dei vettori retrovirali Neonati: La normale replicazione in atto è già sufficiente per il trasferimento del vettore

12 Sintesi dei risulati della trasfezione di neonati di cani con Emofilia B Raggiunti livelli tra il 10% ed il 35% dei livelli antigenici normali e quasi il 30% dei livelli funzionali Riduzione delle emorragie in alcuni animali Nessuna risposta anticorpale

13 Trial clinici di terapia genica in pazienti Iniezione IM di AAV in pazienti con Emofilia B Iniezione IV di RV in pazienti con Emofilia A Impianto di fibroblasti geneticamente-modificati in pazienti con Emofilia A Iniezione nell arteria epatica di AAV in pazienti con Emofilia A

14 Iniezione IV di RV in pazienti con Emofilia A Risultati contrastanti in studi su animali, nei quali alcuni hanno sviluppato alti livelli antigenici, ma bassa attività funzionale, per l insorgere di un alto titolo anticorpale Iniezione IV RV senza uno stimolo per indurre la replicazione degli epatociti Attività inferiore a 1% del normale Il trial è stato fermato Nessun evento avverso

15 Impianto di fibroblasti geneticamente-modificati

16 Impianto di fibroblasti geneticamente-modificati

17 Iniezione nell arteria epatica di AAV in pazienti con Emofilia B: Iniezione di una dose pari ad 1/10 di quella usata nei cani Scarsa o assente espressione del transgene Il vettore AAV è stato rilevato nel liquido seminale di alcuni maschi per diversi mesi a causa della contaminazione da leucociti Utilizzo successivo di una dose maggiore

18 Terapia Genica in Emofilia: stato dell arte 6 trial (3 FVIII: 3 FIX) 43 pazienti Ex vivo gammaretrovirus Ex vivo elettroporazion IV gammaretrovirus IV adenovirus IM/arteria epatica AAV

19 Terapia Genica in Emofilia: stato dell arte Risultati 1. Piccoli e transitori aumenti del fattore 2. Nessun evento avverso significativo

20 Conclusioni Nessun approccio di terapia genica ha dato uno stabile inctemento di fattore nei pazienti L iniezione IM di vettori AAV è inefficace L impianto di fibroblasts modificati è molto indaginoso e poco efficace Il rilascio intraepatico di vettori AAV o RV potrebbe funzionare

21 Dubbi e perplessità Mutagenesi inserzionale o altri meccanismi che possano causare neoplasie Risposta immunitaria nei confronti delle cellule transfettate o del transgene secreto Trasmissione per via germinale

22 Ulteriori approcci Altri sierotipi di vettori AAV Vettori lentivirus per via sistemica Cellule somatiche adulte autologhe geneticamente-modificate Strategie di integrazione mirate

23 Altri esempi di terapia genica Fibrosi Cistica Utilizzo di Crippled adenovirus 3 gruppi di ricerca, 10 pazienti/gruppo 2 gruppi hanno inoculato il vettore virale via aerosol (rilascio nelle vie aeree e polmoni) 1 gruppo ha inoculato il vettore virale soltanto nelle vie nasali Registrata soltanto un espressione transitoria forse perchè gli adenovirus non si integrano nel genoma come i retrovirus

24 AIDS Pazienti con HIV I T linfociti sono stati trattati ex vivo con ceppi di HIV privati dei geni rev and env Ottenuta una grande quantità di cellule Reiniettate nel paziente Buona risposta dei linfociti T CD8 + citotossici

25 Ipercolesterolemia Familiare Deficit del recettore per le LDL negli epatociti Non viene rimosso appropriatamente il colesterolo dal sangue Elevati livelli di colesterolo con rischio molto aumentato di infarto e ictus 1993 Primo tentativo Vettore Retrovirale per infettare 3.2 x 10 9 epatociti (~15% di tutti gli epatociti) ex vivo Reinfusi nel paziente Improvement seen Molti altri tentativi tentati successivamente

26 Malattia di Lesch-Nyhan Primi giorni soltanto in animal e modelli vitro Deficitaria produzione dell enzima HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) Deficitario metabolismo della ipoxantina e della guanina accumulo dell acido urico Gotta, nefropatia, epilessia, ritardo mentale, automutilazione, etc

27 Malattia di Gaucher Deficit del gene Glucocerebrosidasi RAC ha approvato test clinici nel 1993 Disturbi CNS, epatosplenomegalia, erosione delle ossa lunghe ipocromie cutanee

28 Successful One Year Gene Therapy Trial For Parkinson's Disease Neurologix a biotech company announced that they have successfully completed its landmark Phase I trial of gene therapy for Parkinson's Disease. This was a 12 patients study with four patients in each of three dose escalating cohorts. All procedures were performed under local anesthesia and all 12 patients were discharged from the hospital within 48 hours of the procedure, and followed for 12 months. Primary outcomes of the study design, safety and tolerability, were successfully met. There were no adverse events reported relating to the treatment.

29 Parkinson's Disease Cont. The gene transfer procedure utilized the AAV (adeno-associated virus) vector, a virus that has been used safely in a variety of clinical gene therapy trials, and the vehicle that will be used in all of the company's first generation products, including epilepsy and Huntington's disease. In its Parkinson's disease trial, Neurologix used its gene transfer technology.

30 Terapia genica del cancro: potenziamento della risposta immune

31 Terapia genica del cancro: sensibilizzazione cellule tumorali a farmaci TK

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33 Gene therapy finds welcoming environment in China Nature Medicine: March 2006 Gendicine 1 st commercial gene therapy product 2 nd generation Adenovirus p53 transgene

34 Primo prodotto di terapia genica disponibile in commercio: Adenovirus esprimente p53 contro carcinomi sqamo-cellulari di testa e collo, licenziato in Cina dall Industri cinese Shenzen SiBiono (2003) Prodotto simile che sta per essere registrato negli USA (ora in fase III della sperimentazione clinica contro carcinomi sqamo-cellulari di testa e collo, tumori del polmone e della mammella): -> Adenovirus per p53, Advexin Si ritiene che l Advexin sara il primo farmaco di terapia genica registrato in USA, probabilmente nel 2007 o 2008.

35 Terapia genica nel trattamento di tumori polmonari Utilizzo di un protocollo di terapia genica in associazione con radioterapia nel trattamento di 19 pazienti con tumore polmonare

36 Trattamento: terapia genica e radioterapia. Iniezione intratumorale con ago sottile di un vettore Ad-p53 nei giorni 1, 18 e 32 del trattamento. tumori 4 cm sono stati trattati con 10 ml tumori 4 cm sono stati trattati con 3 ml Radioterapia

37 Resultati 17/19 pazienti hanno eseguito l intera terapia risposta completa in 2 pazienti (11%) Risposta parziale in 4 pazienti (21%) Malattia stabile in 1 paziente (5%) Malattia progressiva in 11 pazienti (57%)

38 Principali malattie oggetto di studio per la terapia genica: Malattie Deficit Incidenza Cellule bersaglio GENETICHE SCID Adenosina deaminasi IL-2R gamma Rara Midollo osseo Linfociti T Emofilia A e B Fattori VIII o IX 1:10,000 maschi Fegato, musc. Ipercolesterolemia familiare Recettore per LDL 1:1,000,000 Fegato Fibrosi cistica Gene CFTR 1:3,000 caucasici Vie resp. Emoglobinopatie (tal., SCA) Difetti in α- o β-globina Fino a 1:600 Midollo osseo Enfisema ereditario α1-antitripsina 1:3,500 Polmoni,fegato ACQUISITE Cancro Vari > 1 milione/anno Vari tipi Malattie neurologiche Parkinson, Alzheimer,SLA 1 milione/anno Neuroni, glia Malattie infettive Malattie dell occhio AIDS, epatite C Retinopatia diabetica Degenerazione maculare 1 milione/anno 1 milione/anno CellT, MF,feg. Epitelio retinico

39 National Institutes of Health Recombinant DNA Advisory Committee (RAC)

40 Donna di 36 anni Affetta da15 anni da artrite reumatoide Trattata con Humira (anti-tnfα Ab) Più terapia con Prednisone e Methotrexate Ripetute iniezioni intraarticolari con AAV-(soluble TNFαR-Fc)

41 22 giorni dopo Decesso dovuto a Istoplasmosi disseminata e HSV Comparsa di un ematoma Retroperitoneale di 2.5 kg

42 Istoplasmosi disseminata in Fegato Polmoni Midollo osseo Milza Cervello Reni

43 Ulteriori considerazioni 1. Consenso informato 2. Conflitto di interesse

44 Integrazione del vettore AAV e epatocarcinoma (Science July 2007: Mark Sands et al.) Iniezione di AAV in topi neonati per malattie da accumulo lisosomiale 6 di 18 (33%) hanno sviluppato HCC (1 di 25 [4%] dopo trapianto di midollo osseo) Sito comune di integrazione nel cromosoma 12 Regione dove mappano molti geni mirna

45 Integrazione del vettore AAV e epatocarcinoma Altre sperimentazioni (pubblicate e non pubblicate) Nessuna evidenza di casi di tumori AAV-mediati anche dopo un lungo follow-up

46 Trial clinico per SCID Gene therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency (SCID)-XI Disease A. Fischer, Science 2000 Malattia Recessiva, associata al cromosoma X Il gene γc, codificante un recettore comune a diverse citochine (IL-2, -4,-7, -9 e -15), e difettivo => blocco del differenziamento dei linfociti T e NK Terapia genica ex-vivo su cellule CD34+ in 2 pazienti: (Moloney Retrovirus - γc, 20x10 6 cells/kg)

47 Trial clinico per SCID A. PCR: detection of γc DNA B: RT PCR Detection of γc RNA Lymphocyte subsets protein expression

48 Trial clinico per SCID Gene therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency (SCID)-XI Disease: Trial successivi hanno dimostrato successo nell esprimere γc e correggere il difetto immunitario in 9 pazienti su 10 trattati Tuttavia, dopo 3 anni i due pazienti piu giovani (1 e 3 mesi al tempo del trattamento) hanno improvvisamente sviluppato proliferazione clonale di linfociti T maturi (Science 2003). In entrambi i casi, i linfociti aberranti mostravano inserzione del vettore retrovirale in prossimita del promotore del proto-oncogene LMO2: MUTAGENESI INSERZIONALE!

49 Current Status FDA has not approved any human gene therapy product for sale Reasons: In 1999, 18-year-old Jesse Gelsinger died from multiple organ failure 4 days after treatment for omithine transcarboxylase deficiency. Death was triggered by severe immune response to adenovirus carrier March 2002: France and US (FDA) halted SCID gene therapy due to leukemia-like side effects in one child. Not clear whether this is related to the gene therapy itself. January 2003, halt to using retrovirus vectors in blood stem cells because children developed leukemia-like condition after successful treatment for X-linked severe combined immunodeficiency disease

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