Produzione di piante transgeniche:

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1 Trasformazione stabile e trasformazione transiente Trasformazione stabile Trasformazione transiente Produzione di piante transgeniche: Passaggi essenziali Isolamento del gene di interesse (es: inserimento in un plasmide) Preparazione di un costrutto per la trasformazione genetica Inserimento del costrutto nel tessuto vegetale (Trasformazione genetica) Selezione delle piante trasformate (uso dei marcatori di selezione) Rigenerazione del tessuto vegetale a pianta intera (PGM) 1

2 Metodo Biologico Metodo Fisico 2

3 A. tumefaciens è efficiente ma limitato alle dicotiledoni Tra le più importanti piante coltivate: frumento, riso, mais e orzo Sono stati sviluppati metodi alternativi per le monocotiledoni Metodi Fisici di trasformazioni genetica negli Eucarioti 3

4 Metodo biolistico Microparticelle d oro (A) e di tungsteno (B) Metodo biolistico Particelle d oro ricoperte di DNA Disco di plastica su cui vengono distribuite le particelle d oro ricoperte di DNA 4

5 Metodo biolistico Metodo biolistico 5

6 6

7 Agrobacterium Un ingegnere genetico naturale 7

8 Agrobacterium spp sono batteri del suolo Gram (-) responsabili di numerose malattie delle piante A. tumefaciens - crown gall disease galla del colletto rose grapevine A volte il tumore può essere molto esteso! 8

9 Come l Agrobacterium causa la malattia? Un megaplasmide (Ti plasmid -Tumour inducing, circa 140 kb) contenuto nell A. tumefaciens è essenziale per lo sviluppo della malattia Induzione di tumori da parte dell A. tumefaciens Le cellule tumorali acquisiscono un gene per la sintesi di citochinine (e auxina) Cellula della pianta 9

10 Infezione e formazione della galla 1. Riconoscimento pianta ospite-agrobacterium 2. Ancoraggio di Agrobacterium sulla pianta ospite 3. Trasferimento e integrazione del T-DNA alla pianta ospite 1. Riconoscimento pianta ospite-agrobacterium Normalmente Agrobacterium attacca la pianta ospite a livello di una ferita fresca. Il ferimento determina: a) Il rilascio di composti fenolici associati alla parete cellulare vegetale (induttori della virulenza) che Agrobacterium percepisce e risponde attivando i geni necessari al trasferimento (geni vir). b) La formazione di una zona di cellule che si dividono attivamente, in quanto il tessuto ferito va incontro ai meccanismi di riparo. 10

11 I composti fenolici induttori vir sono prodotti del metabolismo fenilpropanoide; Essi sono correlati a molecole che vengono usate per rinforzare la matrice polisaccaridica della parete - es. cross-linkers fenolici e lignina polimerica acetosiringone L induzione vir è anche aumentata dalla presenza di zuccheri semplici e da un ph acido entrambi indicativi di danno cellulare 2. Ancoramento di Agrobacterium sulla pianta ospite Agrobacterium deve attaccarsi fisicamente alla parete cellulare della pianta prima di poter trasferire il suo T- DNA. Sulla base dello studio di mutanti attachment defective, l attacco richiede la sintesi da parte del batterio di un filamento polimerico di b-1,2-glucano. Agrobacterium b-1,2 glucano Pianta a livello del tessuto ferito Il target per b-1,2- glucano sulla superficie della pianta non è stato ancora identificato. 11

12 Una volta stabilito il contatto iniziale, il batterio elabora una rete di fibrille di cellulosa (b -1,4-glucano) che aiutano il batterio ad ancorarsi alla parete cellulare della pianta ospite. 3. Trasferimento e integrazione del T-DNA alla pianta ospite E la fase più complessa e coinvolge numerose molecole il cui ruolo non è stato ancora completamente chiarito 12

13 Plasmide Ti 3 importanti regioni per il trasferimento del DNA e l induzione del tumore 1. T-DNA 2. T-DNA borders 3. Regione Vir B A D C G E vir LB T-DNA RB Oncogeni e Opina sintasi Ti Catabolismo opine ori 1. T-DNA contiene geni per la biosintesi di fitormoni (auxina e citochinina) contiene geni per la biosintesi delle opine questi geni vengono trascritti soltanto nella pianta Opine coniugati di amminoacidi e acidi organici/zuccheri normalmente non presenti nelle piante Possono essere metabolizzate dall Agrobacterium ma non dalla pianta nopalina = arginina + alpha-chetoglutarato octopina = arginina + piruvato mannopina = glutammina + mannosio agrocinopina A = saccarosio + arabinosio 13

14 reazione della nopalina sintasi reazione della octopina sintase 2. T-DNA borders Sequenze di bp a ripetizioni dirette su entrambi i lati del T-DNA soltanto il bordo destro sembra essere essenziale 14

15 3. Regione vir Regione di ~35 kb contenente 6-9 unità trascrizionali (vira, B, C, D, E, F, G, H, J) Alcuni loci vir hanno ORFs multiple (es. virb ha 11 ORF) ~23 potenziali proteine sono codificate Alcuni prodotti dei geni vir agiscono nella cellula batterica mentre altri sono trasportati e agiscono nella cellula ospite Quattro loci vir sono essenziali per la formazione del tumore (A, B, D and G) La maggior parte dei geni vir sono silenti in assenza dell ospite, ma la vira e vir G sono trascritti costitutivamente a bassi livelli Sistema di controllo gerarchico - vira e virg regolano l espressione degli altri geni vir 15

16 VirA è associata con la membrana batterica interna, in un complesso con il prodotto del gene cromosomico ChvE INNER MEMBRANE PERIPLASM SENSOR DOMAIN LINKER CITOPLASM NH 2 KINASE COOH RECEIVER Schema della proteina VirA by E.C. Il legame di una apposita molecola di induttore fenolico (es. acetosiringone) con il complesso VirA causa l attivazione della sua latente attività chinasica, e quindi la VirA si autofosforila (Questa risposta della VirA è aumentata dal legame di uno zucchero con il prodotto del gene ChvE) La VirA-fosforilata recluta e attiva la VirG fosforilandola La VirG fosforilata è un attivatore trascrizionale per gli altri loci vir 16

17 zucchero 1. Composto fenolico ChvE VirA ADP ATP autofosforilazione P VirA attiva 4. DNA genomico VirG attiva P VirG inattiva P ADP ATP LB E RB 5. P B A D C G vir Ti ori 17

18 I prodotti genici vird (VirD1 e VirD2) si legano al bordo destro e tagliano un filamento all estremità 5 del T-DNA; -Questa attività è aumentata dai prodotti genici virc che si legano alle vicine sequenze enhancer. 18

19 LB RB overdrive 5 5 Induzione vir LB RB overdrive D1 D2 C2 C1 LB RB overdrive nick D1 D2 La proteina VirD2 rimane attaccata covalentemente all estremità 5 del filamento di T per tutto il processo di trasferimento La proteina VirE2 è una single-stranded DNA binding protein ; più copie si legano al filamento T. Anche la vire2 passa nella cellula ospite insieme al filamento. LB RB overdrive E1 E1 E1 Sintesi di DNA D1 D2 19

20 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 E1 D2 Filamento T con la proteina cap VirD2 attaccata covalentemente Questa associazione può già avvenire nella cellula batterica, ma alcune evidenze suggeriscono che il filamento T inciso + D2 È trasferito all ospite, separatamente dalle proteine E1, e il filamento ricoperto di E1 si forma nel citoplasma della cellula ospite Il prodotto del gene VirB contribuisce nella formazione di una struttura di secrezione di tipo IV, che potrebbe coivolgere il pilus batterico come condotto o struttura guida 20

21 Fig. 1. The six functions of VirE2. The vir regulon, encoding the major loci vira-e and virg-h, is expressed on detection of plant wound signals. VirD2 and VirD1 liberate the T-strand and VirD2 remains covalently bound to the 5' end. 1: VirE2 coats the T-strand, protects it from degradation, and maintains it in a transportable conformation. 2: VirE2 associates with VirE1, required for VirE2 export. 3: VirE2 exits Agrobacterium via the type IV exporter independently, or as part of the T-complex. Alternatively, VirE2 may exit by an alternate pathway (pink; ref. 4). 4: VirE2 forms a pore in the plant plasma membrane allowing passage of the T-complex and coats the T-strand in the plant cytoplasm. 5: VirD2 and VirE2 interact with plant cytoplasmic chaperones (RocA, Roc4, and CypA). Other factors (AtKAP, VIP1) may target the T-complex to the nucleus. 6: VirE2 interacts with nuclear factors (VIP2) that mediate interaction with chromatin and facilitate integration of the T-strand. Altri prodotti dei geni vir VirF - fattore che condiziona il range delle piante ospiti; potrebbe interagire con proteine nucleari che regolano il ciclo di divisione cellulare? VirH - (PinF) possibile citocromo P-450 idrossilasi funzione di difesa? Fattore per il range d ospite? VirJ - possibile binding protein del filamento T; aiuta l esportazione del filamento T? 21

22 Formazione del tumore Il T-DNA del ceppo wild-type di Agrobacterium codifica due tipi di funzioni- produzione di fitormoni e sintesi di opine. I geni del T-DNA hanno strutture promotrice e codon usage che gli consente di essere trascritti efficientemente nelle cellule vegetali ma non nei batteri. La produzione di fitormoni è catalizzata da due prodotti genici (Tms1 e Tms2) che convertono il triptofano in acido 3-indol-acetico (IAA), e un prodotto genico (Tmr/Ipt) che converte l adenina in isopentinil adenina (citochinina). 22

23 L-triptofano O 2 IaaM Ammide -2-indol acetico CO 2 IaaH NH 3 Acido-3-indol acetico (IAA) 2-isopentinil-PP adenosina - 5 -PO 4 Tmr1 PPi Isopentinil adenine-5-po 4 Non tutti I geni del T-DNA sono stati caratterizzati. ORF 6b, per esempio è stato soltanto recentemente riportato codificare una proteina che ha le caratteristiche di un fattore di trascrizione eucariotico (DNA-binding domain) A. rhizogenes trasporta un differente megaplasmide (Ri) ma possiede la stessa funzionalità. Il T-DNA di Ri sembra mancare di un gene per la biosintesi delle citochinine, che probabilmente è responsabile della morfologia radicante del tumore indotto dall A. rhizogenes. 23

24 E interesante notare che geni omologhi al T-DNA tms1 e 2, e tmr1 sono presenti in altri batteri fitopatogeni Pseudomonas savastanoi, per esempio, causa una malattia che produce una galla chiamata rogna dell olivo. I fattori di virulenza noti comprendono la capacità di sintetizzare IAA (codificato da iaam e iaah) e citochinina (codificato da ptz). Comunque, P. savastanoi manca della capacità di trasferire questi geni al genoma ospite. Produce e secerne i fitormoni al sito di infezione. Il tessuto colpito risponde con divisione e espansione cellulare, che determina la formazione della galla. N.B. Questo implica differenze nel controllo trascrizionale... Spettro d ospite A. tumefaciens ha un ampio spettro d ospite nell ambito delle dicotiledoni. Le monocotiledoni e le gimnosperme non sono di solito dei buoni ospiti La mancanza di infettività può essere dovuto: -alla non produzione di un appropriato composto fenolico induttore (es. la colonizzione avviene se l induttore viene fornito esogenamente) -alla presenza di fattori dell ospite non ancora caratterizzati biochimicamente. Alcuni casi di apparente incompatibilità sono stati superati coltivando l Agrobacterium con specifici tessuti (es. piccioli cotiledonari in Brassica) 24

25 Altri determinanti dello spettro d ospite possono essere: i) La sensibilità o specificità della VirA; ii) altri geni vir difettosi (necessari più per alcuni ospiti che per altri); o iii) oncogeni difettivi (es. incapacità di produrre la correta miscela di fitormoni nella cellula ospite) Agrobacterium e Ingegneria Genetia vegetale 25

26 Osservazioni chiave Il T-DNA è permanentemente incorporato nel genoma della cellula ospite Nessuno dei geni codificati dal T-DNA sono necessari per il trasferimento: fitormoni, opine Soltanto i bordi del T-DNA e le funzioni vir sono necessari T-DNA B A D C G E vir LB RB Oncogeni e Opina sintasi Ti Catabolismo opine ori Inoltre..Limitazioni del plasmide Ti -Dimensioni del plasmide troppo grandi per la manipolazione -Produzione di auxine e citochinine previene la rigenerazione della pianta intera 26

27 Due approcci per ottenere plasmidi Ti ingegnerizzati Sistema del Vettore binario Sistema del Vettore cointegrato Due Ori: di E. coli e di Agrobacterium RB (e LB) Marcatori per la selezione e mantenimento in E. coli e A. tumefaciens Marcatore di selezione per le piante Gene di interesse Sistema del Vettore binario 1) Plasmide di piccole dimensioni ad ampio spettro d ospite: 2) Plasmide Ti helper (Ti disarmato) Privo del T-DNA Contiene i geni Vir 27

28 Sistema del Vettore binario Fig Watson et al DNA ricombinante Sistema del Vettore binario Fig Watson et al DNA ricombinante 28

29 Sistema dei Vettori cointegrati Due plasmidi ricombinano per formare un vettore cointegrato -Vettore spoletta Ori di E. coli (no Ori di Agrobacterium) RB (e LB) Marcatori per la selezione e mantenimento in E. coli e A. tumefaciens Marcatore di selezione per le piante Gene di interesse DNA omologo al plasmide Ti -Ti helper Ti disarmato Vettore spoletta Plasmide Ti cointegrato 29

30 Sistema del Vettore cointegrato Fig Watson et al DNA ricombinante Sistema del Vettore cointegrato Fig Watson et al DNA ricombinante 30

31 plasmidi Ti ingegnerizzati Sistema dei Vettori binari -due plasmidi geni vir in un plasmide T-DNA in un altro plasmide Sistema dei Vettori cointegrati -inizia con due plasmidi -ricombina per avere un singolo plasmide Geni vir e T-DNA finiscono sullo stesso plasmide Trasformazione con Agrobacterium: Vettori Binari Possibili svantaggi: Possibile instabilità del plasmide ad ampio spettro d ospite, dovuto alla contemporanea presenza delle origini di replicazione per E. coli e A. tumefaciens Rispetto ai vettori co-integrati presenta diversi vantaggi: Non richiede ricombinazione tra le molecole implicate Utilizza vettori di dimensioni piccole molto più efficienti dei grandi plasmidi Ti disarmati nel trasferiemnto da E. coli ad A. tumefaciens 31

32 Trasformazione con Agrobacterium: Vettori cointegrati Possibili svantaggi: Richiede estese regioni di omologia tra il Ti e il plasmide di E.coli Trasferimento genico meno efficiente rispetto ai vettori binari Floral dip transformation I fiori di Arabidopsis possono essere semplicemente immersi in con una soluzione contenente Agrobacterium con il costrutto genico 32

33 Con il Floral dip transformation viene completamente eliminata la necessità di produrre tessuto callificato per la trasformazione Trasformazione transiente 33

34 Espressione transiente con sistemi virali In piante di Nicotiana benthamiana come sistema eterologo utilizzando il virus X della patata (PVX) 166 kd 25kd 8kd GDI CP 12kd 34

35 Agroinfezione E possibile inserire il DNA di un genoma virale tra i bordi del T-DNA di un plasmide Ti e usare il processo di trasferimento dell Agrobacterium tumefaciens per incorporare il DNA virale nella cellula vegetale. Una volta inserito, le funzioni virali possono trascrivere e replicarsi, stabilendo un infezione virale. Esempi di utilizzo: per studiare virus che non infettato senza l aiuto di vettori (afidi), es. Luteovirus Per migliorare l efficienza di infezione per produrre proteine ricombinanti Per identificare fattori di virulenza Esempio di analisi funzionale mediante Agroinfiltrazione Cold Spring Harbor Laboratory Press Torto T A et al. Genome Res. 2003;13:

36 Sintomi su N. benthamiana dopo agroinfiltrazione con i cdna crn1 e cnr2 12 dai 16 dai PVX vector pgr106 pgr106 crn1 cdna pgr106 crn2 cdna Cold Spring Harbor Laboratory Press Torto T A et al. Genome Res. 2003;13: Il sistema PVX è stato proposto anche come possibile soluzione al rischio di produrre molecole di interesse farmacologico nelle piante 36