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- Teodoro Beretta
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1 Animal virus classification: DNA Viruses Family Pox Herpes Adeno Papova Parvo Hepadna Genome < dsdna > ssdna Partial dsdna Capsid symmetry Complex < Icosahedral > Envelope < Yes > < No > Yes e.g. Vaccinia virus Herpes simplex virus 2 Human adenovirus Papilloma Adeno- Associated Hepatitis B
2 PAPOVAVIRIDAE: specie-specifici PA: papillomavirus PO: polyomavirus 2 generi VA: vacuolizzanti Virus senza pericapside nm di diametro 72 capsomeri con 5-7 proteine struttura icosaedrica DNA bicatenario circolare di 5-8 Kb Sede di replicazione: nucleo Sono citocidi 2 generi: PAPILLOMAVIRUS DNA 5 Kb Non crescono in coltura Oncogeni nell ospite naturale POLIOMAVIRUS 6 DNA 3,3.10 Crescono in vitro Potere oncogeno dubbio
3 Papillomavirus Umani Classificazione Struttura del capside Organizzazione del genoma Interazione virus-cellula -infezione -trasformazione (oncogenesi) Patologie associate all infezione Diagnosi Terapia
4 Caratteristiche del virus Famiglia: Papillomaviridae Genere: Papillomavirus Genoma: dsdna, circolare, bp Capside: icosaedrico, diametro nm Specie-specifici Tropismo tissutale: cellule epiteliali Virus oncogeni
5 Caratteristiche del capside 72 capsomeri 60 esavalenti - 12 pentavalenti 2 proteine strutturali: - L1 proteina capsidica maggiore peso molecolare di 55 kd rappresenta l 80% delle proteine capsidiche - L2 proteina capsidica minore peso molecolare di 70 kd rappresenta il restante 20% delle proteine capsidiche
6 Organizzazione del genoma Regione codificante proteine tardive (L = Late) L2 Long control region (LCR) P97 E6 E7 trasformazione (p53-prb) Regione codificante proteine precoci (E = Early) proteine capsidiche L1 E5 trasformazione proteina tardiva, legame citocheratine E4 E2 E1 regolazione della trascrizione e replicazione DNA replicazione episomica
7 Organizzazione del genoma e proteine virus indotte LCR E7 E1 E5 L2 E6 E2 L1 E L1 Proteina capsidica maggiore (attacco alle cellule) L2 Proteina capsidica minore E1 Replicazione DNA virale, stato episomico del DNA E2 Replicazione DNA virale, controllo trascrizione E4 Legame citocheratine, assemblaggio E5 Trasformazione cellulare (lega recettori EGF, PDGF) E6 Trasformazione cellulare (lega p53) E7 Trasformazione cellulare (lega prb)
8 Papillomavirus Umani (HPV): classificazione Sono stati identificati più di 150 genotipi di HPV (35 genitali) [denominati HPV+numero] Un nuovo isolato per essere classificato come nuovo genotipo di HPV deve avere una omologia inferiore al 90% nella sequenza nucleotidica della regione L1 rispetto alla sequenza corrispondente del genoma dei tipi conosciuti Un sottotipo è classificato come tale quando l omologia è compresa tra 90% e 100% (tra 98% e 100% si parla di variante) DIVERSI GENOTIPI SONO ASSOCIATI A DIVERSE PATOLOGIE
9 SINTESI DNA SINTESI CAPSIDE STRATO CORNEO - + GRANULOSO SPINOSO + / - - BASALE + / - - Nelle cellule dello strato basale persiste il DNA in forma plasmidica che si replica in fase cellulare S e viene trasmesso alle cellule figlie dello strato spinoso e poi granuloso
10 Espressione dei geni di HPV Replicazione plasmidica: nelle cellule basali Replicazione vegetativa: nelle cellule differenziate
11 Infezione e trasformazione Inibizione trascrizione di E6/E7 Integrazione LCR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2 Fattori cellulari Trasformazione e immortalizzazione Infezione Replicazione DNA Caduta delle cellule epiteliali che contengono il virus Cheratinocito basale normale DNA virale nel nucleo della cellula infetta come episoma Strato corneo Assemblaggio virale Replicazione accelerata di DNA virale in cellule più differenziate Episoma Strato basale
12 Interazione della proteina E7 di HPV con prb E2F-1 E2F-1 prb E7 + prb Complesso inattivo Repressione della trascrizione E2F-1 G1 Attivazione della trascrizione e passaggio in fase S E7 pprb inattiva M S pprb inattiva G2
13 Interazione della proteina E6 di HPV con p53 p53 bassi livelli Infezione virale Danneggiamento DNA Stress cellulare G1 p53 alti livelli + E6 HPV (degradazione ubiquitino-dipendente della p53) arresto del ciclo in G1 p53 bassi livelli (passaggio in fase S e accumulo mutazioni) M S G2
14 Associazione tra lesioni cutanee e genotipi di HPV Verruche comuni, piane, plantari e palmari Verruche in epiderm. verruciforme Carcinomi cutanei in epiderm. verruciforme Carcinomi cutanei 1, 2, 3, 4, 7, 10, 26-29, 41, 48, 49, 75, 76, 77 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 46, 47 5, 8, 14, 17, 20, 47 16, 18, 33, 34, 35, 41
15 Associazione tra lesioni mucose e genotipi di HPV VIE RESPIRATORIE: Papillomi Ca. laringo-bronchiali CONGIUNTIVA: Papillomi CAVITA ORALE: Iperplasia epiteliale focale Ca. oro-faringei TRATTO GENITALE: Condilomi acuminati Condilomi piani Papulosi bowenoide Ca. vulvari, penieni, anali Ca. cervice uterina 6, 11 16, 18 6, 11 13, 32 16, 18 6, 11 6, 11, 16, 18, , 18, 31, 33, 39, 40, 59, 68 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 71, 74
16 Associazione tra lesioni mucose e genotipi di HPV VIE RESPIRATORIE: Papillomi Ca. laringo-bronchiali CONGIUNTIVA: Papillomi CAVITA ORALE: Iperplasia epiteliale focale Ca. oro-faringei TRATTO GENITALE: Condilomi acuminati Condilomi piani Papulosi bowenoide Ca. vulvari, penieni, anali Ca. cervice uterina 6, 11 16, 18 6, 11 13, 32 16, 18 6, 11 6, 11, 16, 18, , 18, 31, 33, 39, 40, 59, 68 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 67, 68, 71, 74
17 Trasmissione HPV cutanei per contatto diretto o con superfici contaminate, autoinoculazione HPV mucosi regione anogenitale sessuale (fomiti, perinatale o in utero) app. respiratorio perinatale o in utero (oro-genitale) congiuntiva (perinatale o in utero)
18 Prevalenza delle infezioni genitali da HPV Infezione a trasmissione sessuale più frequente nell uomo (50% della popolazione attiva sessualmente è stata infettata da HPV) Correlata al numero e alla frequenza dei partner Correlata all età (massima tra i 15 e i 25 anni) Correlata allo stato immunitario (maggiore in pazienti HIV positivi, in donne in gravidanza) Correlata alle abitudini di vita (fumo, alimentazione, contraccettivi orali)
19 Lesioni ano-genitali da HPV Condilomi acuminati e piani a livello dei genitali maschili (pene, scroto) e femminili (cervice uterina, vagina, vulva) e in regione perianale [HPV 6, 11, 16, 18, ecc.] Carcinomi cervicali, vulvari, anali e del pene (e lesioni intraepiteliali squamose [SIL] che li precedono) [HPV 16, 18, 31, 33, 39, 45, 52, 58, ecc.]
20 Infezione da HPV e SIL Periodo di incubazione da 3 settimane a 8 mesi L infezione da HPV in genere decorre senza provocare lesioni (latente o subclinica) e si risolve (immunità cellulomediata) L infezione da HPV può tuttavia causare l insorgenza di SIL (lesioni intraepiteliali squamose) il 57% regredisce spontaneamente il32% persiste l 11% si svilupperà come carcinoma in situ Andamento impossibile da prevedere
21 HPV genitali e rischio oncogeno HPV alto rischio: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 HPV basso rischio: HPV 6, 11, 26, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62, 66
22 HPV e carcinoma della cervice Il carcinoma della cervice è la seconda causa di morte per tumore tra le donne (dopo il carcinoma della mammella) nuovi casi di carcinoma della cervice uterina ogni anno nel mondo Prevalenza del 97%-99.7% di DNA di HPV nei carcinomi della cervice (in PCR) Il 53% dei carcinomi della cervice correlati ad HPV sono associati al 16, il 15% al 18, il 9% al 45, il 6% al 31 e il 3% al 33 (IARC, 2000)
23 Cofattori della progressione tumorale Fattori genetici ( anormalità di struttura o numeriche dei cromosomi, riarrangiamenti o sovraespressione di oncogeni cellulari) Antigeni HLA (associazione HLA-cl.IID con carcinoma della cervice) Immunodepressione (infezione da HIV) Coinfezioni con altri virus o microrganismi (HSV-2, Clamidia) Numero dei parti Fumo Contraccettivi orali Fattori ormonali Dieta (assenza di carotenoidi, vitamina C)
24 Presenza di HPV-DNA in Carcinomi 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Cervice uterina Regione anale/perianale Vulva, vagina, pene Regione orofaringea Cute Walboomers et al., J.Pathol., 1999; zur Hausen, Proc.Assoc.Am.Physicians, 1999; Picconi et al., J.Med.Virol., 2000.
25 Diagnosi di Infezione Gli HPV non possono essere coltivati in vitro ciclo replicativo dipendente da eventi che regolano la maturazione dei cheratinociti. Difficile indurre la differenziazione dei cheratinociti in vitro. La diagnosi sierologica è poco affidabile proteine capsidiche antigenicamente simili nei diversi genotipi di HPV. proteine capsidiche non sempre espresse in tutte le lesioni (solo in infezioni produttive).
26 Diagnosi di infezione Metodi Indiretti Evidenziano lesioni clinicamente apparenti [infezioni cliniche] o modificazioni cellulari e di tessuto indotte dal virus [infezioni subcliniche]. Non evidenziano le infezioni latenti (non produttive). Indagine clinica e colposcopica Indagine microscopica di strisci cellulari (Pap-test) Indagine microscopica di preparati istologici
27 Diagnosi di Infezione da HPV Metodi Molecolari Evidenziano la presenza del genoma virale in cellule e tessuti e identificano il genotipo virale. Tecniche di ibridazione su acidi nucleici virali (da/su cellule o tessuti) Dot-blot ibridazione Ibridazione in fase liquida e cattura in micropiastra Ibridazione in situ Tecniche di amplificazione degli acidi nucleici (PCR) seguite da ibridazione molecolare (da cellule o tessuti) PCR con primer tipo-specifici PCR con primer di consenso
28 Utilizzo dei Metodi Molecolari in diagnostica Screening di popolazione (insieme al Pap-test) Interpretazione di quadri citologici dubbi (ASCUS, AGUS) Follow-up di pazienti conizzate (per controllare le recidive) SIL di basso grado (per stabilire in base al genotipo virale la frequenza dei controlli)
29 Terapia Rimozione delle lesioni: conizzazione, laser, crioterapia, elettrocoagulazione Interferone: in lesioni molto estese, in condilomi acuminati ricorrenti o in papillomatosi laringee Acido Retinoico: sembra avere un buon potenziale terapeutico, sopprime l attività trascrizionale del virus Imiquimod: nuovo farmaco per il trattamento dei condilomi, sembra avere una buona efficacia in quanto stimola le difese immunitarie e la produzione di interferone
30 Vaccini Preventivi Vaccini Sono state impiegate particelle virus-like (VLP) costituite da L1. La protezione conferita dai vaccini è tipo-specifica e speciespecifica. Non si conosce la durata della protezione. Tali vaccini non sono efficaci se somministrati dopo il contatto con il virus. Devono essere vaccini polivalenti. Devono essere somministrati prima dell inizio dell attività sessuale. trials fase II/III
31 Vaccini Terapeutici Vaccini Sono allo studio anche vaccini in grado di stimolare la risposta immunitaria nei confronti delle oncoproteine virali con lo scopo di indurre l eliminazione dei virus in replicazione o di eradicare tumori indotti dall'hpv. Studi su animali hanno fornito dati sull'efficacia dell'utilizzo di proteine virali (E2, E6 ed E7) come vaccini immunoterapeutici per verruche e tumori associati ai papillomavirus.
32 POLIOMAVIRUS Sono virus Citolitici e si coltivano facilmente in vitro Importanti nella patologia umana BK JC Si trasmettono per via aerea e gli organi bersaglio vengono raggiunti per via ematica (spesso viruria) Anticorpi anti BK e JC appaiono nella prima infanzia, INFEZIONE PRECOCE NEL CORSO DELLA VITA Circa il 70-90% della popolazione adulta è immune. RESTANO LATENTI (rene, linfociti B, tessuto cerebrale per JC) JC legato all encefalite multifocale progressiva Deficit neurologico progressivo con demielinizzazione Patologia solo nei soggetti immuno-depressi.
33 Il problema dell SV40 poliomavirus dei macachi Causa tumori cerebrali negli animali da laboratorio Trasforma le cellule in coltura L agt lega p53 e la inattiva : presente nel vaccino antipolio iniettato a 10 milioni di bambini in Europe e America : presente nel vaccino anti adenovirus: vaccinato tutto l esercito americano Sequenze di SV40 trovate in tessuti tumorali umani 3-4% della popolazione umana ha anticorpi anti SV40 Trovato nello sperma di uomini non vaccinati in quel periodo (!?)
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