IL RUOLO DELLA MICROFLORA NELLA PRODUZIONE DEL PARMIGIANO-REGGIANO

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1 IL RUOLO DELLA MICROFLORA NELLA PRODUZIONE DEL PARMIGIANO-REGGIANO Erasmo Neviani Monica Gatti Università di Parma La ricerca per la valorizzazione del Parmigiano Reggiano Reggio Emilia

2 Batteri lattici, Chi sono? A cosa servono? Il latte lo faccio io Lo studio del ruolo della microflora lattica nella caseificazione non è cosa recente.più di 100 anni di lavori sperimentali

3 A Lodi nel 1873, con i contributi finanziari del Ministero dell Agricoltura aveva iniziato ad operare la Prima Stazione Sperimentale di Caseificio Italiana (Regia Stazione Sperimentale di Caseificio). I primi direttori che ne lanciarono l attività furono Guglielmo Corner, Luigi Manetti e Giovanni Musso. Nel 1879 iniziavano 40 di attività del Prof.Carlo Besana (nella foto)

4 PRIME ESPERIENZE NELL IMPIEGO DI INNESTI L adozione dell utilizzo del sieroinnesto per la produzione di formaggio risale alla fine del secolo scorso. Gli studi di Gorini e Spallanzani avevano enfatizzato l importanza dei microrganismi nel processo di caseificazione e Notari, prima, e poi Fascetti individuavano l innesto come possibile metodo per contenere i difetti di gonfiore. La tradizione di oggi è stata innovazione in passato!

5 Spallanzani nel 1895, in una sua memoria, riporta i primi esperimenti di aggiunta di sieroinnesto a debole acidità eseguiti presso la scuola di caseificio di Reggio Emilia, di cui il Notari era capocascinaio. Le esperienze di Notari vennero riprese da Fascetti succeduto a Spallanzani nella direzione della Scuola.

6 Fascetti nel 1911 al II Congresso nazionale di Chimica applicata, spiega che fin dal 1888 anche in Italia si fecero tentativi sulla azione migliorante del siero latteo spontaneamente fermentato. Nello stesso periodo il Laboratorio Batteriologico della Scuola di Zootecnia e di Caseificio di Reggio Emilia produce e distribuisce ai caselli colture pure da utilizzare per la preparazione del primo sierofermento. Con tali colture nel 1912 si produssero almeno 3000 forme. Besana nel 1912 giudica i risultati del metodo dell innesto nella fabbricazione del formaggio reggiano nel loro complesso soddisfacenti.

7 CASEIFICAZIONE Batteri lattici motore del processo Non Starter LAB + Starter LAB Cellule microbiche intere Glicolisi Proteolisi Enzimi

8 Prima degli anni 80 ILC Lodi (Carini e coll) Centro latte CNR Milano (Carini, Lodi e coll Uni Cattolica Piacenza (Bottazzi, Battistotti e coll.) Uni Bologna (Losi. e coll.) Parmigiano Reggiano Caratterizzazione microrganismi Parmigiano Reggiano Innovazione tecnologica

9 - Analisi fenotipo

10 anni 80 ILC lodi Uni Piacenza Uni Bo- Molise Parmigiano Reggiano..altri

11 batteri lattici Differenti Generi Specie Biotipi

12 Biodiversità e sopravvivenza La biodiversità si traduce in differente possibilità di sopravvivere in un substrato Quindi Differente attitudine alla trasformazione tecnologica.

13 Microrganismi ed evoluzione ecosistema produttivo e modificazioni tecnologia di produzione Cambia il territorio, cambia il clima, cambia l organizzazione della vita dell uomo.. SONO SEMPRE VALIDE LE RAGIONI DEI BATTERI LATTICI?

14 La storia ci insegna la continua evoluzione negli anni della composizione della microflora degli innesti in relazione sia alla modificazione degli ecosistemi ambientali che, e soprattutto, alle variazioni della tecnologia di produzione è stata osservata nel tempo. Prima Renko negli anni 40 e poi Bottazzi riprendendone gli studi hanno evidenziato come dagli inizi del secolo in poi la microflora del sieroinnesto sia mutata da una miscela di microrganismi sostanzialmente mesofili ad una di microrganismi termofili. Questa modificazione è probabilmente da mettere sia in relazione alle diverse temperature di cottura della cagliata sia alle condizioni di incubazione del siero dolce.

15 Legame indissolubile tra sviluppo di specifica microflora lattica e tecnologia di caseificazione

16 Dal 1995 al 2008

17 Luigi Grazia, Raffaele Coppola (e coll.: Nanni, Sorrentino, Iorizio, Salzano, Chiavari, Benevelli; Ferri, Castagnetti, Nocetti, Reverberi) Caratterizzazione microflora termofila innesto e mesofila da latte crudo sviluppo microflora LAB Lactobacillus rhamnosus isolati da Parmigiano Reggiano latte crudo!!! Impronta ambiente

18 Università di Parma Gatti, Mucchetti, Neviani e coll. Caratterizzazione microflora termofila innesto ruolo biodiversità sviluppo microflora LAB in maturazione Produzione peptidi (Dossena, Marchelli e coll.) Sieroinnesto!!! Biochimica Maturazione

19 Aspetti microbiologici relativi a sicurezza e contenimento difetti Difetti fermentazione e gonfiori Sandri, Pecorari Mariani Colombari, Zapparoli.Pecorari Consorzio e laboratori collegati

20 Biodiversità??? sono biodiverso a cosa servo? MOLTE INCERTEZZE E DIBATTITI IN MERITO

21 Studio biodiversità in batteri lattici isolati da diverse Aree geografica Nicchie di produzione

22 Biodiversità in sieroinnesti Parmigiano Reggiano e Padano pianura pianura pianura pianura pianura pianura pianura montagna montagna montagna pianura montagna montagna montagna pianura S 18 S 10 ATCC ft 5 3 s Q 5 Q 8 S 14 hbt 4 ft 8 ft 6 R 7 R 10 O 4 M 5 N 14 Q 7 M 11 M 4 Lh25 Lh26 Lh23 Lh30 Lh32 Lh31 Lh22 Lh24 Lh29 Lh4 Lh27 Lh21 TH456 N 1 Lh28 Lh8 Lh15 Lh16 Lh1 Lh9 Lh12 Lh13 Lh10 Lh17 Lh18 Lh19 Lh20 Lh2 Lh3 Lh14 Lh11 Lh5 Lh6 Lh7 14s 14d48 15b 3a48 1 s 15b48 37s sf 1 sf 2 S 8 P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano P.Reggiano Parm.Regg. Parm. Regg. P.Reggiano PR GP

23 Biodiversità (Classification Tree) in L. helveticus isolati da Parmigiano Reggiano - Padano - Provolone classe del nodo se C31 è assente quando ceppi Node PROV altro se C53.7 è assente quando Node 2 altro se C51.7 è assente quando Node 5 altro 60 GRPA 59 GRPA se P50 è assente quando Node 3 altro Term. Node 4 Term. Node 6 54 GRPA 6 PARM2 5 PARM3 se C59 è assente quando Node 4 altro 46 GRPA PROV = Provolone nodo terminale 1 3 PARM nodo terminale 2 43 GRPA GRPA = Padano PARM = Parmigiano Reggiano

24 50 Biodiversità in sieroinnesti Parmigiano Reggiano Lact helveticus S13 pianura Lact helveticus R 1 pianura Lact helveticus S 2 pianura Lact helveticus S 4 pianura Lact helveticus R 5 pianura Lact helveticus M 5 montagna Lact helveticus S11 pianura Lact helveticus R13 pianura Lact helveticus S 7 pianura Lact helveticus M 7 montagna Lact helveticus Q11 pianura Lact helveticus N 1 montagna Lact helveticus S19 pianura Lact helveticus M 12 montagna Lact helveticus N 9 montagna Lact helveticus N10 montagna Lact helveticus M 3 montagna Lact helveticus N 5 montagna Lact helveticus N13 montagna Lact helveticus N 8 montagna Lact helveticus N 3 montagna Lact helveticus N 6 montagna Lact helveticus N15 montagna Lact helveticus M 2 montagna Lact helveticus N16 montagna Lact helveticus 0 4 montagna Lact helveticus 011 montagna Lact helveticus 0 7 montagna Lact helveticus 0 8 montagna Lact helveticus M 15 montagna Lact helveticus 014 montagna Lact helveticus M 8 montagna Lact helveticus M10 montagna Lact helveticus M 9 montagna Lact helveticus 019 montagna Lact helveticus Q 4 pianura Lact helveticus 0 20 montagna Lact helveticus 017 montagna Lact helveticus 018 montagna Lact helveticus Q 2 pianura Lact helveticus Q12 pianura Lact helveticus 0 9 montagna Lact helveticus M11 montagna Lact helveticus M 1 montagna Lact helveticus M 6 montagna Lact helveticus S 9 pianura Lact helveticus S12 pianura Lact helveticus S10 pinaura Lact helveticus N14 montagna Lact helveticus Q 1 pianura Lact helveticus 010 montagna Lact helveticus Q 6 pianura Lact helveticus 016 montagna Lact helveticus M 4 montagna Lact helveticus 012 montagna Lact helveticus S16 pianura Lact helveticus Q 7 pianura Lact helveticus S 8 pianura Lact helveticus S14 pianura Lact helveticus R 6 pianura Lact helveticus R14 pianura Lact helveticus S17 pianura Lact helveticus Q 5 pianura Lact helveticus S18 pianura Lact helveticus Q 8 pianura Lact helveticus R 8 pianura Lact helveticus R 10 pianura Lact helveticus R 7 pianura pianura montagna pianura M13 fingerprinting

25 Evoluzione microflora nel formaggio Modificazioni del prodotto associate a produzione e stagionatura Devo resistere! Selezione biotipi adatti biodiversità come differente possibilità di sopravvivere Quindi differente attitudine alla trasformazione tecnologica

26 OGGI

27 NUOVI DUBBI E FRONTIERE Cosa siamo in grado di valutare delle componenti di una popolazione microbica Nel corso della vita del prodotto fattori di stress modificano vitalità e significato tecnologico di una popolazione microbica

28 Microrganismi non coltivabili Alcuni biotipi risultano incapaci di crescere in condizioni colturali, ma solo nell ecosistema alimento (non siamo in grado di riprodurre) Alcune cellule sono danneggiate o stressate Altre necessitano di interazioni con altri microrganismi etc

29 Possibile popolazione microbica in un alimento TOTALI VITALI NON VITALI COLTIVABILI NON COLTIVABILI? Quello che sei abituato a vedere: ma c è dell altro

30 Tramite colorazioni differenziali è possibile distinguere cellule vitali e cellule non vitali

31 lattobacillo non vitale streptococco non vitale lattobacillo vitale streptococco vitale

32 SIEROINNESTO A SIEROINNESTO B

33 LH-PCR (Length( heterogeneity PCR) Tecnica qualitativa e semi-quantitativa; Permette di distinguere diversi microrganismi in base a variazioni naturali nella lunghezza di una regione del DNA; Ecosistemi complessi: suolo, sieroinnesto per formaggi, insilati, bacterioplankton; Si basa su: Polimorfismo di un gene presente nelle specie di studio, es. 16S rrna; Amplificazione mediante PCR con uno dei due primer fluorescente; Separazione e Analisi dei prodotti amplificati per elettroforesi capillare in un sistema automatizzato quale il sequenziatore di DNA.

34 Elettroferogramma di frammenti di DNA in un campione di Sieroinnesto La lunghezza dei frammenti amplificati per ogni specie presente in un sieroinnesto per Padano: Streptococcus thermophilus 318 pb Lactobacillus delbrueckii spp.. lactis/bulgaricus 331 pb Lactobacillus helveticus 335 pb Lactobacillus fermentum pb L. helveticus Fluorescenza (rfu) S. thermophilus L. delbrueckii L. fermentum

35 Siero 1 Siero 2 Siero 3 Siero 4 Siero 5

36 autolisi

37

38 LH-PCR applicata a siero, latte, cagliata e formaggio DNA di cellule batteriche intere DNA di cellule batteriche lisate 1 L. delbrueckii subsp. lactis/bulgaricus 2 L. helveticus 3 L. rhamnosus / L. casei / L. plantarum 4 P. acidilactici / L. parabuchneri * Unattributable peaks

39 PROFILI CAMPIONE..: Cellule intere L.helveticus L.d lactis L.rhamnosus Profilo molto diverso. Minoranza di L.lactis e L. helveticus. Maggioranza di 337: L.plantarum? L.rhamnosus. Evidenza di presenza di L. L.fermentum? plantarum, L. fermentum e P.acidilactici?. L.parabuchneri /P. acidilactici? Cellule lisate L.rhamnosus L.helveticus L.d lactis

40 PROFILI CAMPIONE.: Cellule intere L.d lactis L.helveticus L.rhamnosus Predominanza L. lactis, Minoranza L. helveticus e L. rhamnosus. Forte evidenza L.fermentum e P.acidilactici?. L.fermentum 345: L.parabuchneri / P. acidilactici? Cellule lisate L.d lactis L.helveticus L.fermentum

41 PROFILI CAMPIONE..: Cellule intere L.helveticus L.d lactis L.rhamnosus Dominante L.rhamnosus, Forte evidenza di L. fermentum e P. acidilactici? L.fermentum? 345:L. parabuchneri / P. acidilactici? Cellule lisate

42 PROFILI CAMPIONE Cellule intere L.d lactis L.helveticus L.rhamnosus Dominante L.lactis insieme a L. rhamnosus, Evidenza di presenza di L. plantarum e S. thermophilus, S.thermophilus? 337: L.plantarum? Cellule lisate L.d lactis L.helveticus L.rhamnosus

43 PROFILI CAMPIONE..: Cellule intere L.d lactis L.helveticus L.rhamnosus Profili simili a Parmigiano Reggiano 345: L. parabuchneri / P. acidilactici? Cellule lisate L.helveticus L.d lactis

44 Ma anche tra le vitali, coltivabili o no, importanza presenza o attività? Differente efficacia tecnologica

45 latte formaggio modificazioni biochimiche associate all attività metabolica di microrganismi (Utilità dei Chimici!) La caseificazione è sostanzialmente un processo enzimatico governato dalla tecnologia

46 Attività amminopeptidasica libera in formaggio (non asociata a cellule batteriche intere e vitali) EA Parte esterna Parte interna Curd 6 hours Curd 12 hours Curd 48 hours Salted cheese (1 month) Cheese 2 months Cheese 3 months Cheese 4 months Cheese 6 months Cheese 8 months Cheese 10 months Cheese 12 months Cheese 16 months Cheese 20 months Curd 6 hours Curd 12 hours Curd 48 hours Salted cheese (1 month) Cheese 2 months Cheese 3 months Cheese 4 months Cheese 6 months Cheese 8 months Cheese 10 months Cheese 12 months Cheese 16 months Cheese 20 months Pep N Pep C Pep L Pep A Pep I Pep X SLAB autolisi NSLAB crescita ed autolisi EA

47 evoluzione della frazione oligopeptidica nel corso della stagionatura Semiquantitative amount Curd at vat extraction Curd 12 hours Curd 48 hours Salted cheese (1 month) αs1 CN f (1-23) αs1 CN f (10-13) β CN f (99-159) αs1 CN f (1-7) β CN f (99-160) αs1 CN f (18-23) αs1 CN f (10-16 αs1 CN f (1-17) αs1 CN f (1-13) αs1 CN f (1-6) αs1 CN f (17-23) αs1 CN f (14-23) αs1 CN f (1-14) αs1 CN f (1-16) Cheese 2 months Cheese 3 months αs1 CN f (10-14) αs1 CN f (16-20) β CN f( ) β CN f ( ) β CN f ( ) β CN f ( ) Cheese 4 months αs1 CN f (1-9) αs1 CN f (1-4) ß CN f(17-28) 3P ß CN f (15-28)3P ß CN f(15-28) 4P β CN f (1-3) ß CN f(14-28) 4P β CN f (1-4) ß CN f(12-28) 4P β CN f (1-6) ß CN f(11-28) 4P ß CN f(17-25)2p Cheese 6 months Cheese 8 months αs1 CN f (24-34) β CN f (51-93) αs1 CN f (24-36) β CN f(59-96) αs1 CN f(24-38) β CN f (55-93) αs1 CN f (24-30) β CN f(57-93) αs1 CN f (30-35) αs1 CN f ( ) αs1 CN f ( ) αs1 CN f ( ) β CN f (47-52) β CN f (60-68) Cheese 10 months ß CN f(16-25)3p ß CN f (16-28)3P ß CN f(13-28) 4P as1 CN f ( ) β CN f(37-67) ß CN f (82-95) ß CN f( ) ß CN f (71-83) Cheese 12 months Cheese 16 months β CN f (98-124) β CN f ( ) β CN f ( ) αs1 CN f ( ) αs1 CN f ( ) α S2 CN f ( ) Cheese 20 Months β CN f (53-93) Set 1: 5 peptidi (media Mw 4024) Set 2: 40 peptidi (media Mw 1640) Set 3: 21 peptidi (media Mw 2332)

48 Evoluzione e Ruolo microflora nel PR NSLAB + SLAB Parametri Tecnologici Presenza altri microrganismi Modificazioni del substrato indotte dalla tecnologia e/o attività microbica (Aw, ph, NaCl, etc.) Ecco fatto!!!! SELEZIONE BIOTIPI ADATTI LAB: funzionali, caratteristici, autoctoni.. Rilascio enzimi, stagionatura, caratteri organolettici

49 Domani!

50 quesiti aperti Quali e quanti sono i microrganismi presenti nelle differenti fasi di produzione e stagionatura In che stato fisiologico I microrganismi svolgono necessariamente tutti un ruolo di interesse tecnologico Quali microrganismi presenti ma in stato non attivo Effetto di metabolismi microbici in condizioni non ottimali Interazioni tra microrganismi Lisi e rilascio enzimi (impronta enzimatica) Attività enzimi (potenziale o effettiva)