La Topologia. La topologia è quella branca della matematica che studia le proprietà. delle strutture che non si modificano quando sono sottoposte a

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1 La Topologia La topologia è quella branca della matematica che studia le proprietà delle strutture che non si modificano quando sono sottoposte a deformazione. Ι - SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA La struttura circolare dei cromosomi procariotici e l'organizzazione in domini del DNA eucariotico, data dall'ancoraggio della fibra all'impalcatura cromosomica o alla matrice nucleare, rendono il DNA in vivo, generalmente, una molecola chiusa e priva di estremità libere. Da questo, o meglio dall'impossibile libera rotazione delle estremità che ne deriva, nasce la possibilità della formazione di superavvolgimenti. Si ha un superavvolgimento ogni volta che la doppia elica ruotando nello spazio si avvolge intorno al proprio asse. Il superavvolgimento è negativo quando consiste in una rotazione in senso opposto a quello di avvolgimento del DNA, come nel caso del DNA A e B; positivo quando la rotazione è nella stessa direzione dell'avvolgimento del duplex (figura 1). 1

2 Fig.1 Nel caso di superavvolgimenti negativi il DNA si dice sottospiralizzato, mentre è superspiralizzato quando il DNA è avvolto in superavvolgimenti positivi. 2

3 Le proprietà topologiche della molecola sono quelle proprietà geometriche che non variano in seguito a deformazione del DNA. La topologia e il grado di superavvolgimento sono descritti mediante l'equazione Lk = Tw + Wr (Fuller, 1978), dove Lk rappresenta il numero di legame che è il numero totale di volte con cui un filamento si incrocia su un altro in una molecola chiusa di DNA. Per convenzione il numero di legame viene considerato positivo per ogni incrocio dei filamenti nella doppia elica destrorsa; il suo valore è inoltre espresso da un numero intero (Bauer et al., 1980). Il numero di legame è composto da Tw (twist number) che è il numero di avvolgimento ovvero il numero totale di giri d'elica del duplex (Tw = n / A, dove n è il numero di nucleotidi delle molecole ed A il numero di nucleotidi per giro d elica), e da Wr (writhing number) o numero di superavvolgimento, che esprime i ripiegamenti dell asse su sé stesso. Per una molecola rilassata il numero di legame corrisponde al numero di avvolgimento (Lk = Tw). Mediante il numero di legame o, meglio, la differenza del numero di legame ( Lk = Wr + Tw) è possibile descrivere i cambiamenti topologici del DNA. Il numero di legame è proprietà intrinseca del duplex e non può cambiare a meno che si verifichino rotture dei filamenti. 3

4 Le interconversioni fra i vari topoisomeri, mediante reazioni di taglio, svolgimento o avvolgimento della molecola e ricongiunzione delle estremità tagliate, avvengono ad opera delle DNA topoisomerasi. Molecole di DNA identiche a meno del numero di legame vengono dette isomeri topologici o topoisomeri e sperimentalmente possono essere separate ricorrendo a tecniche di elettroforesi: una molecola di DNA rilassata, infatti, migra più lentamente della sua corrispondente superavvolta, a causa del diverso comportamento idrodinamico. CONSEGUENZE DEL SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA: La molecola superavvolta è ad un livello energetico superiore rispetto a quella rilassata, ed il superavvolgimento è considerabile come una riserva di energia. Processi quali replicazione, trascrizione e ricombinazione, richiedono uno svolgimento locale del DNA; qualsiasi forza torsionale che agevola lo svolgimento faciliterà la realizzazione di questi processi. L energia in eccesso, posseduta dal DNA superavvolto negativamente, può essere utilizzata per fornire l energia necessaria a separare la molecola nei due filamenti che la compongono o, almeno, per dare l avvio a tale processo. In altri termini, il superavvolgimento negativo, avendo verso opposto rispetto all avvolgimento del DNA destrorso, causa una diminuzione delle costrizioni 4

5 topologiche permettendo al DNA di subire transizioni strutturali che non potrebbe compiere se fosse rilassato. Il grado medio di superavvolgimento, stimato intorno ad uno ogni 200 paia di basi, fluttua lungo il genoma (Sinden, 1980). Una misura del grado di superavvolgimento è rappresentata dalla densità di superelica σ = LK / Lk, proporzionale alla variazione del numero di legame rispetto a molecole rilassate, infatti Lk è il valore del numero di legame di u na molecola di DNA rilassata. In presenza di forti variazioni della densità di superelica è possibile prevedere che localmente lungo il DNA si possano generare strutture diverse da quelle del DNA B che richiedono una elevata energia di attivazione per formarsi. La formazione di tali strutture è nella maggior parte dei casi associata a valori di densità di superelica negativi ed avvengono a scapito della riduzione del superavvolgimento globale del resto della molecola. I principali tipi di strutture alternative osservate sono rappresentate dal DNA Z (Wang et al., 1979), strutture a tripla elica, strutture a quadrupla elica (Zakian, 1989), strutture cruciformi (Pearson et al., 1998), strutture di scivolamento (Sinden, 1984). 5

6 LE DNA TOPOISOMERASI Processi vitali quali la replicazione, la trascrizione, la ricombinazione, l'associazione del duplex con gli istoni e con altre proteine portano il DNA a superavvolgersi. Se da un lato un eccesso di superavvolgimento è deleterio per la cellula entro certi limiti esso favorisce lo svolgersi di alcuni processi, come l'inizio della trascrizione a partire dai promotori batterici. Le DNA topoisomerasi svolgono il ruolo fondamentale di controllo fine dello stato topologico del DNA consentendone il mantenimento della funzionalità, questo compensa l impossibilità della libera rotazione della doppia elica nello spazio ristretto della cellula e la sua organizzazione ad anse (Wang, 2002). Le DNA topoisomerasi si distinguono, sulla base del meccanismo catalitico, in due classi: le DNA topoisomerasi I modificano la topologia del DNA permettendo il passaggio di un filamento integro attraverso una momentanea rottura generata sull'elica complementare (Champoux, 1977), variando il numero di legame per multipli di uno; le DNA topoisomerasi II agiscono consentendo il passaggio di un duplex intatto attraverso una momentanea rottura a doppia elica generata su un altro duplex. Le DNA topoisomerasi sono in grado di rilassare i superavvolgimenti positivi 6

7 (DNA topoisomerasi I e II), negativi (DNA topoisomerasi I e II), introdurre superavvolgimenti negativi (DNA girasi batterica) o positivi (DNA girasi inversa). Il trasferimento del legame dall'acido nucleico alla proteina spiega come l'enzima possa funzionare senza l'apporto di energia: i legami sono infatti idrolizzati in maniera reversibile e la loro energia è conservata attraverso reazioni di trasferimento (figura 2). 7

8 Fig.2 L idrolisi di ATP è invece richiesta per promuovere catenazione e decatenazione tra diverse molecole di DNA; l'energia fornita può essere 8

9 sfruttata, infatti, per introdurre nell'enzima cambiamenti conformazionali tali da consentire il passaggio del duplex integro in quello in cui è presente la rottura a doppio filamento. I temi comuni a tutte le DNA topoisomerasi includono la struttura a pinza (clamp) che si apre e chiude legando e tagliando il DNA, la presenza di una cavità di legame per il temporaneo immagazzinamento del duplex e il cambiamento conformazionale della proteina che consente la rotazione del DNA (Champoux, 2001). Questi enzimi hanno il ruolo di rilassare i superavvolgimenti prodotti durante la trascrizione, ad opera della RNA polimerasi, e durante la replicazione, agendo nelle fasi di inizio, allungamento, terminazione e segregazione dei cromosomi replicati. Inoltre svolgono anche una funzione di primo piano nel processo di condensazione dei cromosomi, costituendo, per altro, componenti rilevanti dell'impalcatura dei cromosomi metafasici e della matrice nucleare. Ceppi di lievito mancanti di entrambe le DNA topoisomerasi (le DNA topoisomerasi II presenti sono in forma termosensibile) presentano, poi, un deciso incremento del tasso di ricombinazione. Si ritiene che questo sia dovuto, direttamente, alla presenza di substrati ricombinogenici, come i superavvolgimenti non risolti dagli enzimi, o, indirettamente, ad un'alterazione nel movimento della forca di replicazione. L'interesse rivolto alle DNA topoisomerasi negli ultimi anni deriva non solo dal loro ruolo cruciale nel mantenimento dello stato topologico, ma anche dal 9

10 fatto che queste rappresentano il bersaglio cruciale di droghe che tramite l intrappolamento dell enzima in un complesso covalente col DNA provocano lesioni citotossiche. La possibilità di sfruttare per fini terapeutici queste caratteristiche ha indotto lo sviluppo di molti farmaci con questo meccanismo d azione (Pommier et al., 1998). ΙΙ - 1 LE DNA TOPOISOMERASI DI TIPO I : Le DNA topoisomerasi di tipo I sono in grado di modificare il numero di legame di una molecola di DNA mediante un taglio della doppia elica agendo sul singolo filamento, provocando ad ogni ciclo la variazione del numero di legame di una unità; la reazione non richiede energia. La DNA topoisomerasi I batterica è in grado di svolgere la sua funzione solo su molecole di DNA superavvolte negativamente (Wang, 1971), mentre quella eucariotica rimuove sia superavvolgimenti negativi che positivi. Il gene che codifica per la DNA topoisomerasi I eucariotica non è essenziale in lievito (Yanagida e Sternglanz, 1985) ma lo è nel moscerino della frutta (Lee et al., 1993) e nel topo (Morham et al., 1996), dimostrando che in organismi pluricellulari la DNA topoisomerasi II non può efficacemente sostituire la DNA topoisomerasi I. 10

11 DNA topoisomerasi di tipo I A : le DNA topoisomerasi appartenenti a questa famiglia presentano caratteri comuni: sono tutti enzimi monomerici a meno delle girasi inverse di Methanopyrus kandleri (Krah et al.,1996); il taglio su singolo filamento è accompagnato dalla formazione di un legame covalente tra il sito attivo della tirosina e il 5' fosfato del filamento interrotto; tutte richiedono per svolgere l attività di rilassamento del DNA la presenza di ioni Mg++; DNA circolari contenenti superavvolgimento negativo, ma non positivo, rappresentano il substrato di questa sottofamiglia di DNA topoisomerasi che rilassano solo il DNA superavvolto negativamente e da regioni a singolo filamento (Kim e Wang, 1992; Wang, 1996); l attività catalitica provoca il rilassamento attraverso la variazione del numero di legame di una unità. L'enzima dopo aver prodotto il taglio sul singolo filamento, rimane legato all'estremità 5' fosfato mediante un legame covalente fosfotirosinico; resta comunque anche in contatto con l'altra estremità del filamento tagliato; successivamente l enzima subisce una modifica conformazionale tale da consentire il passaggio del filamento integro attraverso la momentanea interruzione prodotta sull'altro filamento. L'ultimo passaggio della reazione consiste in una nuova reazione di transesterificazione che consente di risaldare le due estremità del filamento tagliato (Wang et al., 1996). Esempi di DNA topoisomerasi I A sono rappresentati da quella di Escherichia coli, storicamente la prima DNA topoisomerasi isolata (Wang, 1971) ed in grado di catalizzare le seguenti reazioni: 11

12 Ι- il parziale rilassamento di DNA superavvolti negativamente, parziale perchè l'attività dell'enzima decresce quando il DNA tende allo stato rilassato (Kirkeegard e Wang, 1985); ΙΙ- la formazione e lo scioglimento di un nodo in anelli di DNA a singolo filamento (Liu et al., 1976) ΙΙΙ- l'unione di due cerchi complementari a singolo filamento per formare un DNA circolare a doppia elica (Champoux et al., 1977; Kirkeegard e Wang, 1978); ΙV- la catenazione di molecole di DNA circolari a doppia elica quando una delle due molecole in gioco presenta dei tagli o è interrotta (Tse et al., 1980; Brown et al., 1981); V- il rilassamento di DNA superavvolti positivamente solo se contengono una regione a singolo filamento (Kirkeegard e Wang, 1985). Mediante cristallografia a raggi X (Lima et al., 1994) e risonanza magnetica nucleare è stato possibile delineare la struttura di questa proteina. Il polipeptide si ripiega in quattro domini a formare una struttura toroidale la cui plasticità conferisce la capacità di legare e rilassare il DNA. Una cavità centrale caratterizza, dunque, la DNA topoisomerasi I A di Escherichia coli, sufficientemente grande da accogliere il DNA (figura 3A). 12

13 Il meccanismo catalitico proposto (Brawn e Cozzarelli, 1981; Champoux, 1990) per questa DNA topoisomerasi I prevede la formazione di almeno quattro differenti legami tra DNA ed enzima (figura 3B). 13

14 Fig.3 Nella prima fase la DNA topoisomerasi I A si lega al DNA attraverso i due domini che delimitano la cavità centrale. Nella seconda fase il dominio ΙΙΙ, che 14

15 contiene la tirosina catalitica, è in grado di tagliare il singolo filamento di DNA; la tirosina catalitica si lega all'estremità 5' del filamento tagliato mentre l'estremità 3' rimane legata non covalentemente all'altra parte del ponte proteico. Dopo l'entrata nella cavità del secondo filamento di DNA, attraverso il filamento entrato precedentemente, si ha, nella terza fase, l'intrappolamento di questo per consentire la reazione di richiusura. La quarta ed ultima fase consiste nell'apertura della proteina e nella fuoriuscita del DNA. Alle DNA topoisomerasi di classe I A appartengono anche la DNA topoisomerasi III di E. coli, che differisce dalla DNA topoisomerasi I nell'attività catalitica incentrata soprattutto nella decatenazione di molecole di DNA a singolo filamento, la DNA topoisomerasi III di S. cerevisiae, le DNA topoisomerasi IIIα e IIIβ di mammifero e la DNA topoisomerasi I A isolata in archeobatteri. DNA topoisomerasi di tipo I B : rilassano il DNA superavvolto sia negativamente che positivamente, senza l'apporto di energia dall'esterno. Il substrato della reazione catalizzata da questa classe di enzimi è rappresentato dal DNA a doppio filamento; l'enzima produce un taglio solo sul singolo filamento (nick) formando un intermedio covalente DNA - enzima rispettivamente tra l'estremità 3' fosfato e il residuo della tirosina catalitica. Il fatto che questa classe di enzimi possa rilassare sia il DNA avvolto negativamente che positivamente e che durante la reazione di taglio l'enzima 15

16 rimanga legato covalentemente all'estremità 3' fosfato del filamento, fa supporre per questa famiglia di enzimi l'esistenza di un meccanismo a perno per il passaggio del filamento integro attraverso quello tagliato. In questo modello l'estremità 5' del filamento tagliato viene lasciata libera dal sito catalitico dell'enzima: in questo modo si ottiene la libera rotazione della doppia elica intorno al legame fosfodiesterico del filamento integro. Le DNA topoisomerasi I B sono proteine monomeriche le cui dimensioni oscillano tra gli 80 ed i 135 Kda. Vi appartengono la DNA topoisomerasi I umana e quella di Vaccinia Virus la cui presenza è indispensabile affinché il virus possa intraprendere il suo ciclo replicativo e che presenta alta omologia di sequenza amminoacidica con quella umana e proprietà enzimatiche molto simili. Altro membro della sottofamiglia è la DNA topoisomerasi V isolata da archeobatteri ipertermofili, che ha attività catalitica simile a quella della DNA topoisomerasi I eucariotica e di Vaccinia ma scarsa omologia di sequenza con queste. ΙΙ - 3 LE DNA TOPOISOMERASI DI TIPO II : Le DNA topoisomerasi II divisibili sulla base di considerazioni strutturali nelle sottofamiglie A e B, rilassano sia superavvolgimeti positivi che negativi; la reazione è mediata da una rottura a doppio filamento in uno dei duplex e dal passaggio attraverso di essa di un altra regione duplex. 16

17 Ad ogni ciclo la variazione del numero di legame è di due unità. Le DNA topoisomerasi II sono enzimi dimerici, costituiti negli eucarioti da due monomeri identici; durante la reazione, in seguito al legame dell'enzima al suo substrato, due tirosine danno luogo ad un attacco nucleofilo sui due filamenti di una molecola di DNA e le due tirosine rimangono legate covalentemente alle due estremità 5' fosfato. Quindi, grazie all'idrolisi dell'atp che induce nell'enzima cambiamenti conformazionali, il duplex integro viene accompagnato dall'enzima attraverso la fessura introdotta. La girasi batterica appartiene alla classe delle DNA topoisomerasi II; è capace di introdurre, tramite il meccanismo dell'inversione di segno, superavvolgimenti negativi mediante un'azione catalitica processiva. In assenza di ATP l'enzima può risolvere superavvolgimenti negativi ma non positivi. L'idrolisi di ATP, inoltre, non serve per lo svolgimento della reazione ma piuttosto per un processo chiamato riciclo dell'enzima che consente l'avvio di un nuovo ciclo catalitico. ΙΙΙ - INIBITORI DELLE DNA TOPOISOMERASI : Gli inibitori delle DNA topoisomerasi possono essere divisi in due classi: veleni e soppressori. 17

18 Benchè entrambi inibiscano l'attività catalitica delle DNA topoisomerasi, i veleni sono in grado di portare alla morte cellulare mediante l'intrappolamento del cleavage complex costituito dal legame enzima / DNA, mentre i soppressori agiscono impedendo il legame dell'enzima al DNA. La sensibilità delle cellule ai veleni aumenta con un sovraespressione delle DNA topoisomerasi, mentre la riduzione della loro espressione è la principale causa di resistenza; un comportamento diametralmente opposto è quello che riguarda i soppressori. La scoperta della camptotecina come antitumorale risale a circa 30 anni fa quando fu isolata dalla pianta Camptotheca acuminata, tuttavia è molto piu' recente (Liu, 1989) l'individuazione della DNA topoisomerasi I quale bersaglio di questa. Esperimenti di delezione del gene per la DNA topoisomerasi I in lievito e successiva complementazione con wild type, hanno inoltre rivelato questo enzima come unico bersaglio del veleno, data la completa resistenza conferita dalla sua assenza. La camptotecina (CPT) è una molecola planare con struttura ad arco (Fig.4). Esiste sotto due forme: come lattone, la forma attiva, e come sale di sodio. Essa si converte a ph fisiologico nell'altra forma che è molto più solubile ma quasi del tutto inattiva. La differenza nelle due strutture consiste nella differente struttura dell'anello E che risulta chiuso nella forma lattonica e aperto in quella solubile. 18

19 Mutazioni del gene per la DNA topoisomerasi I che conferiscono resistenza alla camptotecina hanno contribuito alla comprensione delle interazioni veleno-enzima. E' così emersa la capacità della CPT di legare la regione dell'enzima che contiene la tirosina catalitica. Questo legame consente alla CPT di formare un complesso ternario DNA / DNA topoisomerasi I / camptotecina (figura 4), in grado di inibire specificatamente la reazione di risaldatura del DNA inducendo così l'accumulo di cleavage complex. 19

20 20 Fig.4

21 ΙΙΙ - 1 DNA TOPOISOMERASI,CAMPTOTECINA E CANCRO: I successi clinici ottenuti nel trattamento di malattie tumorali con camptotecina hanno suggerito nuove strategie per la terapia del cancro. Un rinnovato interesse per la camptotecina, ha portato alla sintesi e allo sviluppo di numerosi derivati idrosolubili con minori effetti di tossicità, come la CPT-11, usato per il trattamento del cancro al colon, e il topotecano, per quello del cancro ovarico. L'effetto citotossico della CPT non è legato alla mera inibizione catalitica della DNA topoisomerasi I, ma alla interferenza che questa, mediante il blocco del cleavage complex e la fomazione del complesso ternario, viene ad esercitare sulle funzioni della topoisomerasi stessa. Durante la replicazione la regione del duplex a valle della forca di replicazione viene ad assumere un grado di superavvolgimento positivo tale da impedire l'avanzamento delle forca stessa qualora sia assente l'intervento della DNA topoisomerasi I. La camptotecina separa l'azione concertata della forca di replicazione e della DNA topoisomerasi I; inducendo il blocco del cleavage complex, provoca inoltre la collisione di questo con la forca, fenomeno che porta alla formazione di rotture doppio filamento e a morte cellulare. 21

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