MARCATORI MOLECOLARI. Materiali e metodi. F. Vantini, M. Gastaldelli, C. Govoni, E. Tosi, P. Malacrinò, R. Bassi, L. Cattivelli, G.

Transcript

1 MARCATORI MOLECOLARI Caratterizzazione genetica di vitigni autoctoni veronesi Lo studio della biodiversità con marcatori molecolari ha consentito di analizzare il grado di parentela genetica di 14 vitigni, individuando due gruppi di correlazione. Inoltre, ha evidenziato alcune differenze tra cloni dello stesso vitigno e un unico marcatore (UVMD36) capace di discriminare Trebbiano di Soave e suoi sinonimi dagli altri trebbiani F. Vantini, M. Gastaldelli, C. Govoni, E. Tosi, P. Malacrinò, R. Bassi, L. Cattivelli, G. Tacconi La viticoltura della provincia di Verona interessa circa ha, la maggior parte a denominazione di origine controllata (figura 1) e una piattaforma ampelografica che si basa sull utilizzo di vitigni ritenuti autoctoni in quanto coltivati e diffusi localmente. L identificazione e la caratterizzazione di queste varietà, il reperimento dei biotipi, la conservazione e la valorizzazione del patrimonio genetico, la selezione clonale e la diffusione sul territorio dei risultati e del materiale ottenuto rivestono una notevole importanza per lo sviluppo e la salvaguardia di questo territorio (Tosi e Malacrinò, 2003). L attività svolta dal Centro per la sperimentazione in viticoltura della provincia di Verona, in collaborazione con l Istituto sperimentale di viticoltura di Conegliano e l Ispettorato agrario di Verona, ha permesso, già alla fine degli anni Ottanta, di identificare e caratterizzare sia le principali varietà veronesi sia i vitigni minori, descrivendone gli aspetti ampelografici (Costacurta et al., 1980) e verificando le eventuali sinonimie (Calò et al., 1991). Questo lavoro ha consentito di identificare numerosi vitigni diversi tra loro, di caratterizzarli da un punto di vista viticolo ed enologico e, successivamente, di conservarli in campi catalogo. Le tecniche utilizzate per la caratterizzazione sono passate dai tradizionali e iniziali metodi ampelografici basati sul rilievo di parametri morfologici, a quelli ampelometrici che utilizzano misurazioni della foglia, ai metodi isoenzimatici in grado di identificare specifici enzimi della vite, fino agli attuali metodi molecolari che consentono di tracciare un preciso profilo delle varietà. Il lavoro di reperimento delle varie accessioni ha portato dapprima alla costituzione di un campo di collezione e di conservazione presso l azienda sperimentale del Centro a San Floriano, poi, per garantirne la conservazione, preservandole da patologie gravi che possono colpire determinate aree vitate, altri campi sono stati dislocati Figura 1 - Distribuzione geografica delle doc veronesi Valpolicella Custoza Valdadige Lessini Durello Arcole Bardolino Lugana Soave in diversi ambienti. L attività di selezione clonale (Tosi e Bletzo, 2000a) ha interessato le varietà più diffuse, quali Garganega, Corvina, Rondinella, Molinara, Rossignola e, più recentemente, il Corvinone. I biotipi omologati e iscritti al catalogo nazionale sono ben 22 (5 di Garganega, 5 di Corvina, 3 di Rondinella, 3 di Molinara, 3 di Rossignola, 3 di Corvinone), contrassegnati da un numero di selezione e dalla dicitura ISV-CV, che indica le iniziali dei costitutori: l Istituto sperimentale per la viticoltura di Conegliano e il Comitato vitivinicolo veronese. Il Centro per la sperimentazione in vitivinicoltura della provincia di Verona possiede un ampia collezione di accessioni dei vitigni più diffusi e attualmente coltivati nel Veronese, di vecchi vitigni (Tosi e Bletzo, 2000b) o vitigni minori autoctoni non più coltivati (Dindarella, Pelara, Oseleta, Cabrusina, Rossetta di montagna, Denela, Simesara, Bigolona, Bianca Capriana Forsellina). Recentemente, al fine di supportare con metodi molecolari avanzati la caratterizzazione dei vitigni locali nell ambito dell attività sperimentale svolta dal Centro, è nata una collaborazione con i Laboratori agroalimentari del Consorzio Zai di Verona (Vantini et al., 2003). Materiali e metodi Le prove sperimentali sono state condotte su 14 vitigni diffusi nella provincia di Verona (autoctoni e alloctoni) di cui 13 appartenenti alla collezione del Centro per la sperimentazione in viticoltura di San Floriano (provincia di Verona) e 1 (Enantio) reperito presso un vigneto della Valdadige. Per ciascuna varietà sono stati raccolti campioni fogliari da tre diversi cloni presenti nella collezione. Nel caso di vitigni con un numero insufficiente di cloni depositati sono state analizzate tre diverse accessioni. Un riepilogo delle varietà e dei cloni analizzati è L INFORMATORE A GRARIO 32/

2 Tabella 1 - Elenco dei cloni e delle accessioni analizzati Varietà Origine delle accessioni Cloni analizzati Corvina C.S.V. (*) ISV-CV 7, ISV-CV 13, ISV-CV 48 Garganega C.S.V. ISV-CV 11, ISV-CV 24, ISV-CV 84 Molinara C.S.V. ISV-CV 3, ISV-CV 87, ISV-CV 100 Corvinone C.S.V. ISV-CV 2, ISV-CV 3, ISV-CV 7 Rondinella C.S.V. ISV-CV 23, ISV-CV 73, ISV-CV 76 Trebbiano di Soave C.S.V. tre accessioni locali Verdicchio C.S.V. tre accessioni locali Dindarella C.S.V. tre accessioni locali Pelara C.S.V. tre accessioni locali Oseleta C.S.V. tre accessioni locali Enantio (Lambrusco azienda tre accessioni locali a foglia frastagliata) privata Durella C.S.V. ISV C VI 4, ISV C VI 6, ISV C VI 8 Carbrusina C.S.V. tre accessioni locali Rossetta di montagna C.S.V. tre accessioni locali Trebbiano toscano C.S.V. AP TR 2, Santa Lucia 30, Rauscedo 4 (*) Centro per la sperimentazione in vitivinicoltura della provincia di Verona. Figura 2 - Fenogramma delle distanze filogenetiche tra i vitigni veronesi analizzati Dindarella e Pelara Rondinella Corvina ISV-CV7, ISV-CV13 Corvina ISV-CV48 Oseleta #1 e #3 Oseleta #2 Garganella ISV-CV11, ISV-CV24 Garganella ISV-CV84 Trebbiano di Soave e Verdicchio Rosetta di montagna Molinara Corvinone Cabrusina #1 e #3 Cabrusina #2 Enantio #1 e #2 Enantio #3 Foto 1 - Corsa elettroforetica su gel di agarosio di Trebbiano di Soave (1), Trebbiano di Lugana (2) e di tre cloni di Trebbiano toscano, clone APTR2 (3), clone Rauscedo (4), clone Santa Lucia 30 (5). M: marcatore di peso molecolare 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 percentuale di similarità 0,7 0,8 0,9 Durella riportato in tabella 1. L estrazione del DNA è stata effettuata con un metodo di purificazione sviluppato per le specie arboree (Lefort e Douglass, 1999). I campioni sono stati analizzati mediante l impiego di marcatori microsatellitari per dieci loci SSR (Simple Sequence Repeat), cioè regioni di DNA caratterizzate da una ripetizione di una stessa sequenza di 2-6 nucleotidi: VVS2 (Thomas e Scott, 1993), VVDM5 e VVDM7 (Bowers et al.,1996), VVMD14, VVMD25, VVMD27, VVMD28, VVMD31, VVMD36 (Bowers et al., 1999) e VrZAG62 individuato in Vitis riparia (Sefc et al., 1999). L analisi è stata condotta valutando la lunghezza dei prodotti di PCR (Polymerase Chain Reaction), marcati con differenti fluorocromi, tramite il sequenziatore ABI- Prism 310 e la successiva analisi degli interferogrammi con il sistema Genescan. L amplificazione del DNA di vite mediante PCR è stata verificata caricando 1 µl di ciascuna reazione su gel di agarosio all 1% (foto 1). I 10 loci microsatellitari analizzati sono stati scelti tra quelli descritti in letteratura come 46 L INFORMATORE A GRARIO 32/2003 altamente polimorfici (tabella 2). I risultati ottenuti hanno permesso di costruire una matrice delle distanze tra i vitigni analizzati considerando il numero di alleli uguali mediante l analisi effettuata con il software Microsat (Minch, 1997); dalla matrice così ottenuta è stato disegnato un albero delle distanze filogenetiche (fenogramma) (figura 2). Risultati e discussione L analisi con marcatori SSR assume significato solo nel caso che le regioni di DNA studiate siano variabili (polimorfiche) nelle varietà analizzate. Tutti i marcatori microsatellitari utilizzati si sono rivelati polimorfici a eccezione del marcatore VVMD31 che non è perciò da considerarsi adatto per l analisi dei vitigni veronesi (tabella 2). L elevata variabilità riscontrata nei marcatori rende statisticamente improbabile che vitigni diversi abbiano tutti gli stessi alleli. La probabilità che ciò si verifichi casualmente è 1 su 8 miliardi. Pertanto, è possibile affermare che due vitigni, che possiedono esattamente gli stessi alleli per ciascun marcatore, devono essere considerati identici. Variabilità intravarietale Allo scopo di evidenziare l eventuale variabilità intravarietale nei vitigni analizzati, sono stati indagati tre cloni oppure tre accessioni per ciascun vitigno. I risultati delle nostre analisi hanno evidenziato la presenza di variabilità tra i biotipi considerati nei vitigni Corvina, Garganega, Oseleta, Enantio e Cabrusina. In tutte queste varietà due dei tre cloni o accessioni hanno presentato un profilo microsatellitare differente dal terzo (tabella 3). Il dato risulta interessante se si considera che precedenti lavori, compiuti su più cloni dello stesso vitigno, avevano evidenziato la difficoltà dell analisi SSR di individuare differenze intravarietali (Regner et al., 2000). Il clone di Garganega ISV-CV84 (foto 2) amplificato coi primer VVMD7 produce una banda di 4 paia di basi più lunga rispetto alle bande ottenute nei cloni ISV-CV11 (foto 3) e ISV-CV24 (recentemente omologati

3 Tabella 2 - Variabilità dei microsatelliti analizzati Microsatellite Numero di alleli riportati in letteratura Numero di alleli presenti nei vitigni veronesi VVS ZAG VVMD VVMD VVMD VVMD VVMD VVMD VVMD VVMD Tabella 3 - Differenze riscontrate tra i cloni o accessioni dello stesso vitigno e marcatore per cui si sono verificate Vitigno Lunghezza alleli Marcatore Corvina ISV-CV7 235:225 Corvina ISV-CV13 235:225 VVMD14 Corvina ISV-CV48 235:229 Garganega ISV-CV11 245:247 Garganega ISV-CV24 245:247 VVMD7 Garganega ISV-CV84 245:249 Oseleta acc.1 292:249 Oseleta acc.2 249:249 VVMD36 Oseleta acc.3 292:249 Enantio acc.1 132:149 Enantio acc.2 132:149 VVS2 Enantio acc.3 153:149 Cabrusina acc.1 229:243 Cabrusina acc.2 229:229 VVMD5 Cabrusina acc.3 229:243 Foto 2 - Garganega ISV-CV84 Foto 4 - Corvina ISV-CV48 per la spargolicità dei grappoli e per il miglior equilibrio vegeto-produttivo). Allo stesso modo il clone di Corvina ISV-CV48 (foto 4) presenta il marcatore VVMD14 quattro paia di basi più lungo degli altri cloni analizzati. Quest ultimo è il più utilizzato nei nuovi impianti in quanto ritenuto migliore (grappolo meno compatto e buoni tenori zuccherini) rispetto ad altri cloni attualmente disponibili (foto 5). In entrambi i casi l analisi SSR ha permesso di discriminare e di confermare le differenze tra i cloni registrati già evidenziate da indagini ampelografiche, fornendo uno strumento di validazione per valorizzare le differenze qualitative riscontrate. L indagine ha inoltre evidenziato differenze nei tre biotipi di Enantio in cui l allele del marcatore VVS2 di una accessione risulta 21 paia di basi più lungo rispetto allo stesso allele presente nelle altre accessioni. Tra i vitigni minori, Oseleta e Cabrusina mostrano due accessioni in cui il profilo di amplificazione, rispettivamente ai loci VVMD36 e VVMD5 risulta eterozigote, mentre nella terza accessione gli stessi loci sono omozigoti. In questi casi, trattandosi di accessioni e non di cloni, a fronte di differenze documentate nel profilo SSR non corrisponde una chiara distinzione ampelografica come nel caso di Garganega e Corvina. L analisi molecolare adottata è in grado di distinguere individui che presentano profili genomici differenti che non si manifestano necessariamente a livello fenotipico. Le differenze riscontrate pertanto possono indicare la presenza di una popolazione omogenea di biotipi con caratteri evolutivi parzialmente distinti, identificabili solamente tramite metodiche molecolari. La variabilità genetica potrà essere sfruttata per selezionare all interno di queste varietà cloni di particolare pregio. Variabilità intervarietale e relazioni filogenetiche Dall analisi degli alleli in comune tra i diversi vitigni è stato possibile generare una matrice delle distanze attraverso la quale è stato tracciato un fenogramma (albero delle parentele) Foto 3 - Garganega ISV-CV11 Foto 5 - Corvina ISV-CV7 con i software Kitsch e Treeview (figura 2). L albero indica la presenza di due gruppi principali di vitigni imparentati tra loro, mentre per gli altri non è evidente alcun vincolo di parentela. L omologia tra le varietà appartenenti allo stesso gruppo è superiore al 50%. Il primo gruppo di vitigni include Corvina, Oseleta, Rondinella, Garganega, Dindarella o Pelara; il secondo comprende Rossetta di montagna, Molinara e Trebbiano di Soave (Verdicchio). Il livello di omologia tra i due cluster è ugualmente elevato (intorno al 50%), per cui è possibile che si siano evoluti da uno o pochi progenitori comuni. Altri vitigni come Durella, Enantio (Lambrusco a foglia frastagliata), Cabrusina e Corvinone non mostrano alcuna chiara relazione né con i gruppi descritti, né tra di loro. Si può ipotizzare che Enantio, che trova il suo areale di coltivazione a nord di Verona in Val d Adige, sia stato introdotto nella provincia di Verona in epoche più recenti dalle aree circostanti. Ad avallare tale ipotesi concorrono precedenti L INFORMATORE A GRARIO 32/

4 Foto 6 - Trebbiano di Soave analisi, effettuate con marcatori microsatellitari, che hanno evidenziato una chiara relazione tra Enantio e alcuni vitigni trentini come Marzemino, Teroldego, Lagrein e Groppello gentile (Grando et al., 2000). Cabrusina e Corvinone sono considerate varietà autoctone veronesi; ciononostante l analisi di parentela non ha rivelato una chiara relazione filogenetica sia con le altre varietà autoctone sia tra di esse. In questo caso tuttavia, non essendo stati individuati legami di parentela con vitigni coltivati in altre province vicine, non è da escludere una evoluzione parallela dei due vitigni, forse in comune con qualche altro vitigno veronese non ancora caratterizzato. Infine, come già evidenziato in analisi precedenti (Cancellier e Angelini, 1993), anche l esame con i microsatelliti ha confermato la netta distinzione genetica tra le varietà Corvina e Corvinone. Foto 7 - Verdicchio Omonimie e sinonimie L analisi microsatellitare ha chiarito due casi di sinonimia. Il primo riguarda i vecchi vitigni Dindarella e Pelara, che sono fenotipicamente diversi per le dimensioni e la compattezza del grappolo. Dopo l analisi genetica, tutte e tre le accessioni di Dindarella sono risultate uguali alle tre di Pelara, imputando in tal modo le differenze fenotipiche o a mutazioni specifiche avvenute in geni che alterano il comportamento agronomico o più probabilmente allo stato sanitario delle piante. Le varietà Trebbiano di Soave (foto 6) e Verdicchio (foto 7), pur essendo state iscritte indipendentemente nel catalogo nazionale varietà, sono indicate nello stesso come sinonimi. L analisi genetica ha rivelato che tutti i loci SSR dei due vitigni hanno alleli uguali, confermando pertanto la loro sinonimia. Altri vitigni italiani portano il no- 48 L INFORMATORE A GRARIO 32/2003 me Trebbiano: Trebbiano toscano, Trebbiano romagnolo, Trebbiano di Modena, Trebbiano di Spagna, Trebbiano spoletino e Trebbiano di Lugana. Nel Veronese oltre al Trebbiano di Soave, coltivato nella zona est della provincia, troviamo il Trebbiano di Lugana, coltivato nella parte opposta, a sud del lago di Garda. I due vitigni, nonostante alcune differenze dovute al diverso ambiente di coltivazione, sono considerati sinonimi. La nostra analisi ha evidenziato, dopo amplificazione del locus VVMD36, un allele anomalo di circa 500 paia di basi (foto 1) che non è mai stato caratterizzato in lavori precedenti. Abbiamo in questo modo individuato un singolo marcatore che può essere utilizato come sistema semplice e affidabile per discriminare il Trebbiano di Soave e i suoi sinoimi Trebbiano di Lugana e Verdicchio, dagli altri trebbiani (foto 1). Le analisi ampelografiche considerano Garganega molto simile al vitigno Grecanico dorato coltivato nella zona occidentale della Sicilia (Calò et al., 2000). L analisi genetica effettuata sui due vitigni dall Istituto agrario di San Michele all Adige aveva già confermato la loro identità. La nostra analisi ha tuttavia evidenziato che solo uno dei tre cloni di Garganega (ISV-CV84) presenta una completa identità allelica con Grecanico. I due cloni di Garganega ISV-CV11 e ISV-CV24, di più recente costituzione, differiscono da Grecanico e dal clone ISV-CV84 per un allele sul locus VVMD7. Conclusioni Foto 8 - Trebbiano Toscano R4 La vitivinicoltura veronese ricopre sia in termini quantitativi che qualitativi un ruolo di primo piano nel panorama nazionale. Questo lavoro ha messo in evidenza come la sinergia tra le metodiche di caratterizzazione classiche e le nuove tecnologie molecolari possa risultare indispensabile per caratterizzare e valorizzare vitigni ormai affermati e riscoprire vitigni minori che stanno scomparendo. I legami di parentela evidenziati dimostrano, come già documentato storicamente, che nell area veronese sono coltivati sin da tempi remoti vitigni la cui storia evolutiva risulta in parte comune e geograficamente delimitata. Il lavoro svolto ha permesso di caratterizzare i vitigni veronesi più pregiati e una parte dei vitigni minori. È tuttavia obiettivo della nostra ricerca proseguire con la caratterizzazione completa delle varietà locali e ampliare quindi l albero delle parentele anche con altri vitigni coltivati nelle province limitrofe, aumentando allo stesso tempo il numero dei marcatori impiegati. Questa attività consentirà di tracciare un profilo genetico completo dei vitigni autoctoni e di studiarne l evoluzione e il legame con il territorio. Francesco Vantini Mirko Gastaldelli Chiara Govoni Laboratori agroalimentari Consorzio ZAI (Verona) vantini.labs@quadranteeuropa.it Emanuele Tosi Paola Malacrinò Centro per la sperimentazione in vitivinicoltura Provincia di Verona emanuele.tosi@provincia.vr.it Roberto Bassi Dipartimento scientifico e tecnologico Università di Verona Luigi Cattivelli Gianni Tacconi Istituto sperimentale per la cerealicoltura Fiorenzuola d Arda (Piacenza) La bibliografia verrà pubblicata negli estratti.

5 BIBLIOGRAFIA Bowers J.E., Dangl G.S., Vignani R., Meredith C.P. (1996) - Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.). Genome, 39: Bowers J.E., Dangl G.S., Meredith C.P. (1999) - Development and characterization of additional microsatellite Dna markers for grape. Am. J. Enol. Vitic., 50: Calò A., Costacurta A., Cancellier S., Forti R. (1991) - Verdicchio bianco, Trebbiano di Soave. Un unico vitigno. Vignevini, 11: Calò A., Cancellier S., Costacurta A., Giorgessi F., Lavezzi A., Tomasi D., Baroni G., Madinelli C., Piazza E. (2000) - La viticoltura veronese Bardolino Custoza Lugana. Risultati di indagini sperimentali e conoscitive. Provincia di Verona Settore Agricoltura e sperimentazione. Cancellier S., Angelini U. (1993) - Corvina Corvinone: due varietà diverse. Vignevini, 5: Costacurta A., Cancellier S., Angelini U., Segattini G., Farina C. (1980) - Vecchi vitigni veronesi. Rivista di Vitic. e Enol. di Conegliano, Supplemento ottobre. Grando M.S., Frisinghelli C., Stefanini M. (2000) - Genotyping of local grapevine germplasm. Acta Hort., 528: Lefort F., Douglas G.C. (1999) - An efficient micromethod of DNA isolation from mature leaves of four hardwood tree species Acer, Fraxinus, Prunus and Quercus. Ann. Forest. Sci., 56: Minch E. (1997) - Microsat, version 1.5b. Stanford University Medical Center, Stanford. Regner F., Wiedeck E., Stadlbauer A. (2000) - Differentiation and identification of White Riesling clones by genetic markers. Vitis, 39: Sefc K.M., Regner F., Turetschek E., Glössl J., Steinkeller H. (1999) - Identification of microsatellite sequence in Vitis riparia and their applicability for genotyping of different Vitis species. Genome, 42: Thomas M.R., Scott N.S. (1993) - Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites (STSs). Theor. Appl. Genet., 86: Tosi E., Bletzo C. (2000a) - Selezione clonale per la viticoltura veronese. L Informatore Agrario, 36, Supplemento Triveneto, 9: 3-4. Tosi E., Bletzo C. (2000b) - Vecchi vitigni per la viticoltura veronese: l Oseleta. L Informatore Agrario, 36, Supplemento Triveneto, 9: 6-7. Tosi E., Malacrinò P. (2003) - Biodiversità della viticoltura veronese. L Informatore Agrario, 12, Supplemento Triveneto, 1: 8-9. Vantini F., Tacconi G., Gastaldelli M., Govoni C., Tosi E., Malacrinò P., Bassi R., Cattivelli L. (2003) - Biodiversity of grapevines (Vitis vinifera L.) grown in the Province of Verona. Vitis, 42 (1): L INFORMATORE A GRARIO 32/2003 1