TROMBOPHYLIA Alert kit

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1 TROMBOPHYLIA Alert kit SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 PRESENTAZIONE DEL KIT pag. 2 CARATTERISTICHE DEL KIT pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL KIT pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT pag. 4 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 4 PROCEDURA pag. 6 BIBLIOGRAFIA pag. 14 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 15 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 17 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: 20 C Amplification Set +2 / +8 C Detection Set PRESENTAZIONE DEL KIT Il kit fornisce le miscele di reazione OligoMIX per l'amplificazione, già prealiquotate in provette «monotest» pronte all'uso, e i reagenti per la rivelazione su striscia dei prodotti di amplificazione. La procedura prevede due fasi successive: la reazione di amplificazione e la rivelazione su striscia. Nella prima fase si esegue la reazione di amplificazione multiplex specifica per le regioni dei geni del FV, del FII e dell'mthfr interessate dalle mutazioni utilizzando il DNA estratto dai campioni in esame. Nella seconda fase si esegue la rivelazione su striscia dei prodotti specifici della reazione di amplificazione. I prodotti contenuti in ciascuna provetta sono denaturati e fatti ibridare su un'unica striscia di rivelazione dove sono adsorbite tutte le sonde e i controlli di reazione (ibridazione inversa). L'ibridazione dei prodotti di amplificazione dei diversi alleli dei geni di interesse con le sonde è rivelata attraverso il legame del coniugato streptavidinafosfatasi e la reazione con il cromogeno 5bromo4cloro3indolil fosfato / nitroblu di tetrazolio (BCIP / NBT). La presenza delle bande colorate sulla striscia di rivelazione indica la presenza degli alleli normale o mutante dei geni di interesse nel campione di partenza. CARATTERISTICHE DEL KIT La sensibilità del saggio permette di rivelare la presenza di circa 2000 molecole di DNA bersaglio (pari a circa 1000 genomi cellulari omozigoti) nei 5 µl di DNA estratto aggiunti alla provetta «monotest». Il kit consente di effettuare 12 determinazioni, controlli compresi. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'estrazione del DNA dai campioni da analizzare e per il controllo positivo di amplificazione non sono inclusi in questo kit. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori fabbricati da ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAcell» (codice EXTD02), kit di estrazione del DNA da campioni cellulari; il kit consente di effettuare 50 estrazioni; «TROMBOPHYLIA Positive Control» (codice CTRDBS00), controllo positivo di amplificazione di DNA plasmidico; il prodotto fornisce controllo per 12 reazioni. «DNA pol. 5U / µl» (codice EP40), enzima DNA polimerasi termostabile ad attivazione termica per l'amplificazione degli acidi nucleici; il prodotto consente di effettuare 10 reazioni. Il kit trova impiego nella determinazione allelica del polimorfismo su singolo nucleotide (SNP) G1691A (R506Q, Leiden) del gene del Fattore V della coagulazione (FV), del polimorfismo su singolo nucleotide G20210A (3'UTR) del gene del Fattore II della coagulazione (FII) e del polimorfismo su singolo nucleotide C677T (A223V) del gene della 5,10metilene tetraidrofolato reduttasi (MTHFR) nel DNA estratto da campioni di sangue intero o saliva. La determinazione allelica degli SNP dei geni del FV, del FII e dell'mthfr con un saggio di amplificazione ed ibridazione inversa può essere utilizzata per la valutazione del rischio di trombosi venosa. SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 1/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 2/17

2 MATERIALE INCLUSO NEL KIT MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL KIT o Amplification Set Conservazione: 20 C Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura OligoMIX di amplificazione miscela di amplificazione in provette da 0,2 o 0,5 ml 12 x 90 µl Diluente dell'enzima soluzione di diluizione 1 x 100 µl Detection Set Oligonucleotidi, Cloruro di potassio, TRIS base, TRIS cloridrato, Triton X100, Cloruro di magnesio, Desossinucleotidi trifosfati, olio di vaselina TRISHCl, saccaroso, Blu Bromofenolo, Xilencianolo FF Conservazione: +2 / +8 C Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura Soluzione Denaturante soluzione denaturante 1 x 300 µl Sodio idrossido Xi IRRITANTE Soluzione di Ibridazione soluzione di ibridazione 1 x 15 ml Sodio dodecilsolfato, TRISHCl Lavaggio di Stringenza soluzione di lavaggio 1 x 40 ml Diluente del Coniugato soluzione di diluizione 1 x 15 ml Coniugato 100x Streptavidinafosfatasi, da diluire 100 volte con diluente del coniugato 1 x 200 µ Lavaggio del Coniugato soluzione di lavaggio 1 x 40 ml Sodio solfato, Tween 20, 0,01%Thimerosal Sodio cloruro, Sodio maleato, Caseina, Tween 20, 0,01%Thimerosal Streptavidinafosfatasi, Sodio cloruro, TRISHCl, Tween 20, Albumina bovina, Glicerolo, 0,01% Thimerosal Sodio cloruro, Sodio maleato, Caseina, Tween 20, 0,01%Thimerosal Substrato soluzione di cromogeno 1 x 15 ml BCIP, NBT, AMPHCl Soluzione Bloccante soluzione bloccante 1 x 40 ml Acido cloridrico Strisce di Rivelazione strisce per l'ibridazione inversa 12 membrana di nylon supportata, oligonucleotidi Vaschetta di Rivelazione vaschetta con 12 canali 1 Foglietto adesivo foglio adesivo sigillante 1 Cappa a flusso laminare. Guanti monouso in lattice o simili. Microcentrifuga da banco ( RPM). Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,510 µl, 220 µl, 550 µl, µl, µl). Provette sterili da microcentrifuga (1,5 ml). Acqua bidistillata sterile. Miscelatore vortex. Termostato programmabile (thermal cycler). Provette sterili in polipropilene da 15 ml e 50 ml. Piano basculante. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo kit è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un' ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel kit prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel kit durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del kit. Utilizzare solo i reagenti presenti nel kit e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da kit di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 3/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 4/17

3 E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione/ rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Le OligoMIX di amplificazione sono monouso e pertanto devono essere utilizzate una volta sola in reazioni di amplificazione. Le OligoMIX di amplificazione, il Diluente dell'enzima e la Soluzione Bloccante presentano i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. La Soluzione Denaturante presenta le seguenti frasi di rischio (R) e i seguenti consigli di prudenza (S): Xi IRRITANTE R 36/38. Irritante per gli occhi e la pelle. S In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. Usare guanti adatti. La Soluzione di Ibridazione, il Lavaggio di Stringenza, il Diluente del Coniugato, il Coniugato 100x, il Lavaggio del Coniugato presentano i seguenti consigli di prudenza (S): S 2324/25. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi e la pelle. Il Substrato presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S 2336/37/39. Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Usare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi e la faccia. Fase di Amplificazione Impostazione del ciclo termico PROCEDURA Prima di iniziare la sessione è necessario: verificare che il blocco termico del termostato programmabile (thermal cycler) sia compatibile con il formato delle provette «monotest» fornite nel kit (provette da 0,2 o 0,5 ml); verificare sulla documentazione dello strumento la modalità di controllo della temperatura che il thermal cycler adotta per l'esecuzione del ciclo termico; quando possibile, selezionare la modalità di controllo della temperatura direttamente sul blocco termico (per esempio thermal cycler Hybaid TM o Eppendorf TM ): non utilizzare la modalità di controllo della temperatura mediante provettasonda o con software di simulazione; quando non è possibile e per i thermal cycler GeneAmp PCR System 9600, 2400, 9700 o 2700 (Applied Biosystems TM ) utilizzare la modalità di controllo della temperatura predefinita; impostare sul thermal cycler i parametri del ciclo termico descritti nella tabella seguente. Ciclo termico della prima amplificazione Campioni Numero di cicli Temperature Tempi 1 ciclo 95 C 15 min. 35 cicli 95 C 1 min. 58 C 1 min. 72 C 1 min. 1 ciclo 72 C 5 min. Il materiale da utilizzare con questo kit deve essere costituito da DNA estratto da campioni biologici. Il sistema di estrazione del DNA dal campione di partenza deve fornire DNA idoneo all'uso in reazioni di amplificazione. Quando si impiegano campioni biologici cellulari, per esempio sangue intero, si consiglia di non immettere nella reazione di amplificazione con i 5 µl di DNA estratto una quantità di DNA genomico superiore a quella corrispondente a circa cellule (circa 1 µg), per evitare la comparsa di prodotti aspecifici di amplificazione e possibili fenomeni di inibizione. Si consiglia di allestire più aliquote dei campioni da conservare congelate in modo da non sottoporle a cicli di congelamento / scongelamento ripetuti. Controlli di amplificazione E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di amplificazione allestendo una reazione di controllo negativo e una reazione di controllo positivo. Per il controllo negativo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel kit) da aggiungere alla reazione al posto del DNA estratto dal campione. Per il controllo positivo utilizzare il DNA estratto da un campione di genotipo eterozigote per i geni di interesse e già testato oppure il «TROMBOPHYLIA Positive Control». SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 5/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 6/17

4 Allestimento dell'amplificazione Prima di iniziare la sessione è necessario: scongelare i campioni da analizzare e il controllo positivo, centrifugarli per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerli in ghiaccio. scongelare una provetta «monotest» per ciascuno dei campioni da analizzare, una per il controllo negativo ed una per il controllo positivo, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto, marcarle in modo riconoscibile con un pennarello indelebile e tenerle in ghiaccio. diluire come descritto nella tabella seguente l'enzima «DNA pol. 5U / µl» con il Diluente dell'enzima. Preparare un volume di enzima diluito sufficiente per tutte le reazioni previste (controlli compresi) più una, per avere un margine di sicurezza. L enzima diluito non può essere conservato. Fase di Rivelazione Preparazione della rivelazione Per ciascun campione è richiesto l'utilizzo di una Striscia di Rivelazione e di un canale della vaschetta. E' possibile eseguire 12 determinazioni, controlli compresi. Il numero minimo di determinazioni per seduta è pari a 3, controlli compresi. Si illustra sotto, a titolo di esempio, come può essere organizzata l'analisi di 5 campioni. CN C1 C2 C3 C4 C5 CP Numero di reazioni «DNA pol. 5U / µl» Diluente dell'enzima Volume totale 4 1,6 µl 18,4 µl 20 µl 5 2,0 µl 23,0 µl 25 µl 6 2,4 µl 27,6 µl 30 µl 7 2,8 µl 32,2 µl 35 µl 8 3,2 µl 36,8 µl 40 µl 9 3,6 µl 41,4 µl 45 µl 10 4,0 µl 46,0 µl 50 µl 11 4,4 µl 50,6 µl 55 µl 12 4,8 µl 55,2 µl 60 µl 13 5,2 µl 59,8 µl 65 µl 1. Aggiungere a ciascuna provetta «monotest» 5 µl di DNA polimerasi termostabile diluita (2 U). 2. Aggiungere a ciascuna provetta «monotest» 5 µl di DNA estratto. Procedere nello stesso modo con il controllo negativo e con il controllo positivo. 3. Trasferire le provette «monotest» nel thermal cycler e avviare il ciclo termico di amplificazione. Nota bene: Il prodotto di reazione può essere conservato a 20 C per un massimo di un mese. Rivelazione elettroforetica del prodotto di amplificazione (opzionale) Se si intende verificare la presenza dei prodotti dell'amplificazione prima di eseguire la rivelazione su striscia, è possibile evidenziare i prodotti dell'amplificazione mediante separazione elettroforetica nelle condizioni descritte di seguito: utilizzare un gel d'agaroso al 2% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TBE 1x (89 mm TRIS, 89 mm acido borico, 2 mm EDTA disodico) oppure; utilizzare un gel d'agaroso al 4% con bromuro di etidio 1 µg / ml in tampone TAE 1x (40 mm TRIS, 20 mm acido acetico, 1 mm EDTA disodico), come nei prodotti della serie «ELECTROPHORESIS»; caricare direttamente sul gel di agaroso 5 µl del prodotto di reazione e un marker di pesi molecolari adatto. Il prodotto specifico dell'amplificazione ha dimensioni di 104 bp per il gene del Fattore V. Il prodotto specifico dell'amplificazione ha dimensioni di 81 bp per il gene del Fattore II. Il prodotto specifico dell'amplificazione ha dimensioni di 70 bp per il gene della MTHFR. Nota bene: Il prodotto della reazione di amplificazione è in grado di contaminare i saggi successivi. Confinare gli scarti prodotti nella rivelazione elettroforetica. Legenda: CN: Controllo negativo di amplificazione; C1 C5: Campioni da analizzare; CP: Positive Control di amplificazione. Attenzione: durante la sessione rispettare le seguenti norme generali: prelevare sempre le Strisce di Rivelazione con pinzette di plastica pulite, non toccarle mai con le mani; mantenere sempre umide le Strisce di Rivelazione durante la rivelazione, non farle mai asciugare; cambiare sempre il puntale della micropipetta quando si dispensano campioni diversi. Prima di iniziare la sessione è necessario: registrare sul Piano di lavoro fornito in allegato ciascun campione e i controlli, riportare con una matita i numeri corrispondenti su ciascuna striscia di rivelazione nella parte al di sotto della linea blu di riferimento (vedi esempio qui sopra). Il Piano di lavoro dovrà essere seguito con attenzione durante il trasferimento nei pozzetti dei campioni, dei controlli e delle strisce; Nota bene: se si intendono eseguire i dodici test in più sessioni, si consiglia fotocopiare il Piano di lavoro fornito in allegato in modo da poterlo utilizzare per la registrazione dei dati di ciascuna sessione. riscaldare la Soluzione di Ibridazione per alcuni minuti, per esempio in un termostato a +37 C, e agitarla in modo da sciogliere i precipitati formatisi. Lasciare la Soluzione di Ibridazione a temperatura ambiente (da +22 C a +29 C) fino al mom ento dell'uso. La Soluzione di Ibridazione eventualmente avanzata alla fine della sessione può essere conservata a +2 / +8 C per un massimo di tre mesi; SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 7/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 8/17

5 trasferire la Soluzione Denaturante, il Lavaggio di Stringenza e la Soluzione Bloccante a temperatura ambiente (da +22 C a +29 C). I reagenti eventualmente avanzati alla fine della sessione possono essere conservati a + 2 / + 8 C p er un massimo di tre mesi; Nota bene: per eseguire correttamente la fase di rivelazione è importante controllare che la temperatura ambiente sia compresa tra i +22 C e i +29 C e controllare con un termometro che il Lavaggio di Stringenza abbia raggiunto la temperatura ambiente. Il Lavaggio di Stringenza trasferito dal frigorifero al bancone impiega circa 2 ore a raggiungere la temperatura ambiente. preparare il Coniugato 1x secondo le seguenti istruzioni. Trasferire in una provetta in polipropilene da 15 ml sterile (non fornita nel kit) un volume di Coniugato 100x pari a 12 µl per ciascuna striscia di rivelazione utilizzata. Diluire il Coniugato 100x con un volume di Diluente del Coniugato pari a 1200 µl per ciascuna striscia di rivelazione utilizzata in modo da ottenere il Coniugato 1x. Lasciare l'aliquota di Coniugato 1x a temperatura ambiente prima dell uso. Il Coniugato 1x eventualmente avanzato alla fine della sessione non può essere conservato. Il Coniugato 100x eventualmente avanzato può essere conservato a +2 / +8 C per un massimo di tre mesi. trasferire in una provetta di polipropilene da 15 ml sterile un volume di Substrato pari a 1200 µl per ciascuna striscia di rivelazione utilizzata. Lasciare l'aliquota di Substrato protetta dalla luce e a temperatura ambiente prima dell uso. Il Substrato eventualmente avanzato può essere conservato a +2 / +8 C per un massimo di tre mesi. Ibridazione e lavaggi 1. Trasferire 20 µl di Soluzione denaturante in ciascun canale della Vaschetta di Rivelazione che si intende utilizzare, come stabilito precedentemente nel Piano di lavoro. 2. Trasferire 20 µl del primo prodotto di amplificazione nel canale della vaschetta di rivelazione stabilito precedentemente nel Piano di lavoro. Mescolare bene pipettando per tre volte il volume di 20 µl nella soluzione. Procedere nello stesso modo con tutti gli altri prodotti di amplificazione. 3. Lasciare la vaschetta 5 minuti a temperatura ambiente. 4. Aggiungere lentamente a ciascun canale utilizzato della vaschetta di rivelazione 1 ml di Soluzione di ibridazione. Mescolare agitando lentamente la vaschetta di rivelazione. Nota bene: durante questa operazione e le successive, fare attenzione che le miscele di ibridazione restino confinate nei propri canali e non vadano a contaminare i canali adiacenti. 5. Disporre la prima Striscia di Rivelazione numerata nel canale della vaschetta di rivelazione stabilito precedentemente nel Piano di lavoro. La striscia deve presentare la faccia numerata verso l alto. Procedere nello stesso modo con tutte le altre strisce. 6. Mescolare agitando lentamente la vaschetta di rivelazione e accertarsi che le strisce siano completamente ricoperte dalla soluzione. Sigillare la vaschetta con il Foglietto adesivo. Se non si utilizzano tutti i canali della vaschetta di rivelazione, ritagliare la porzione di foglio necessaria per la seduta. 7. Lasciare la vaschetta 30 minuti a temperatura ambiente in agitazione lenta sul piano basculante. 8. Rimuovere con la micropipetta la soluzione dal primo canale della vaschetta di rivelazione e trasferirla in un tubo di polipropilene da 50 ml per gli scarti. Cambiare il puntale e trasferire subito 1 ml di Lavaggio di Stringenza (già a temperatura ambiente) nel primo canale della vaschetta di rivelazione. Fare attenzione a non lasciare a secco la striscia per troppo tempo. Procedere nello stesso modo con gli altri canali della vaschetta di rivelazione. 9. Lasciare la vaschetta per 1 minuto a temperatura ambiente in agitazione lenta sul piano basculante. 10. Ripetere una volta le operazioni del punto 8 e del punto 9 (eseguire due lavaggi da 1 minuto in tutto). 11. Ripetere le operazioni del punto 8 e lasciare in agitazione lenta sul piano basculante per 10 minuti o per 3 minuti a seconda della temperatura ambiente misurata, come descritto nella tabella di seguito: Temperatura ambiente e del Lavaggio di Stringenza 22 C 23 C 24 C 25 C 26 C 27 C 28 C 29 C Durata del lavaggio 10 minuti 3 minuti Nota bene: quando la temperatura ambiente misurata è compresa tra i 25 C e i 26 C eseguire il lavaggio da 10 minuti. Reazione con il coniugato e lavaggi 12. Rimuovere la soluzione dai canali della vaschetta di rivelazione e trasferire subito in ciascun canale 1 ml di Coniugato 1x prelevandolo dall aliquota preparata precedentemente. Fare attenzione a non lasciare a secco la striscia per troppo tempo. 13. Lasciare la vaschetta 30 minuti e a temperatura ambiente in agitazione lenta sul piano basculante. 14. Rimuovere la soluzione dai canali della vaschetta di rivelazione e trasferire subito in ciascun canale 1 ml di Lavaggio del Coniugato. Fare attenzione a non lasciare a secco la striscia per troppo tempo. 15. Lasciare la vaschetta 1 minuto a temperatura ambiente in agitazione lenta sul piano basculante. 16. Ripetere le operazioni del punto 14 e del punto 15 per due volte (eseguire tre lavaggi in tutto). Reazione con il substrato 17. Rimuovere la soluzione dai canali della vaschetta di rivelazione e trasferire subito in ciascun canale 1 ml di Substrato prelevandolo dall aliquota precedentemente preparata. Fare attenzione a non lasciare a secco la striscia per troppo tempo. 18. Lasciare la vaschetta 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, in agitazione lenta sul piano basculante. Durante l incubazione diventeranno visibili sulle strisce alcune bande costituite da un precipitato scuro prodotto dalla reazione del coniugato con il substrato. Nota bene: se le bande non fossero chiaramente visibili dopo i primi 10 minuti di sviluppo è possibile prolungare lo sviluppo fino a 30 minuti. Attenzione: l'intensità delle bande presenti su ciascuna striscia potrebbe essere differente, questo non influenza l'interpretazione dei risultati. 19. Rimuovere la soluzione dai canali della vaschetta di rivelazione e trasferire subito in ciascun canale 1 ml di Soluzione Bloccante. 20. Lasciare la vaschetta 1 minuto a temperatura ambiente in agitazione lenta sul piano basculante. 21. Ripetere le operazioni del punto 19 e del punto 20 per due volte (eseguire tre lavaggi in tutto). 22. Fare asciugare completamente le strisce su carta bibula. SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 9/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 10/17

6 Lettura dei risultati Al termine della reazione con il substrato sulla Striscia di Rivelazione sono visibili alcune bande, la figura schematica riportata di seguito ne illustra il significato. 3 Controllo del coniugato: convalida la funzionalità del sistema coniugato / substrato. La reazione deve essere sempre positiva (anche nel controllo negativo). Controllo di specificità: convalida la specificità dell ibridazione. La reazione deve essere sempre negativa (anche nel controllo positivo). Controllo di sensibilità FV: convalida la reazione di amplificazione del gene FV. La reazione deve essere sempre positiva (tranne che nel controllo negativo). Sonda FV mutante (506Q, 1691A, Leiden): rivela la presenza dell allele mutante del gene FV. Se la reazione è positiva, è presente l allele mutante del gene del FV. Sonda FV normale (506R, 1691G, wild type): rivela la presenza dell allele normale del gene FV. Se la reazione è positiva, è presente l allele normale del gene del FV. Controllo di sensibilità FII: convalida la reazione di amplificazione del gene FII. La reazione deve essere sempre positiva (tranne che nel controllo negativo). Sonda FII mutante (20210A): rivela la presenza dell allele mutante del gene FII. Se la reazione è positiva, è presente l allele mutante del gene del FII. Sonda FII normale (20210G, wild type): rivela la presenza dell allele normale del gene FII. Se la reazione è positiva, è presente l allele normale del gene del FII. Controllo di sensibilità MTHFR: convalida la reazione di amplificazione del gene MTHFR. La reazione deve essere sempre positiva (tranne che nel controllo negativo). Sonda MTHFR mutante (223V, 677T): rivela la presenza dell allele mutante del gene MTHFR. Se la reazione è positiva, è presente l allele mutante del gene dell'mthfr. Sonda MTHFR normale (223A, 677C, wild type): rivela la presenza dell allele normale del gene MTHFR. Se la reazione è positiva, è presente l allele normale del gene dell'mthfr. La lettura dei risultati del test può essere eseguita allineando la banda del Controllo del coniugato presente su ciascuna Striscia di Rivelazione alla corrispondente linea del Quadro di Lettura fornito in allegato. Le altre bande presenti sulla striscia risulteranno allineate con le definizioni riportate sul Quadro di Lettura. Nota bene: si consiglia di fare una fotocopia del Quadro di Lettura fornito in allegato per ciascun campione in analisi in modo da poterla utilizzare per la registrazione dei risultati dei test. Convalidazione generale dell amplificazione e della rivelazione Il risultato della striscia del Controllo negativo di amplificazione è utilizzato per convalidare l amplificazione e la rivelazione come descritto nella tabella seguente: Esempio Controllo del coniugato + + Controllo di specificità Controllo di sensibilità FV + Sonda FV mutante / + Sonda FV normale / + Controllo di sensibilità FII + Sonda FII mutante / + Sonda FII normale / + Controllo di sensibilità MTHFR + Sonda MTHFR mutante / + Sonda MTHFR normale / + Esempio 1: risultato valido. Esempio 2: risultato non valido a causa di rivelazione assente. Esempio 3: risultato non valido a causa di contaminazione dell amplificazione o della rivelazione. Se il risultato della striscia del Controllo negativo di amplificazione non è valido si possono essere verificati problemi nella fase di rivelazione o di amplificazione che possono causare risultati falsi positivi. La sessione non è valida e deve essere ripetuta a partire dalla fase di amplificazione. Il risultato della striscia del Positive Control di amplificazione è utilizzato per convalidare l amplificazione e la rivelazione come descritto nella tabella seguente: Esempio Controllo del coniugato Controllo di specificità + Controllo di sensibilità FV Sonda FV mutante + / + + Sonda FV normale + / + + Controllo di sensibilità FII Sonda FII mutante + / + + Sonda FII normale + / + + Controllo di sensibilità MTHFR Sonda MTHFR mutante + / + + Sonda MTHFR normale + / + + Esempio 1: risultato valido. Esempio 2: risultato non valido a causa di rivelazione assente. Esempio 3: risultato non valido a causa di ibridazione inefficiente. Esempio 4: risultato non valido a causa di amplificazione inefficiente o assenza di prodotto di amplificazione*. Esempio 5: risultato non valido a causa di ibridazione aspecifica. Se il risultato della striscia del Positive Control di amplificazione non è valido si possono essere verificati problemi nella fase di rivelazione o di amplificazione che possono causare risultati falsi negativi. La sessione non è valida e deve essere ripetuta a partire dalla fase di amplificazione. * La presenza del prodotto di amplificazione può essere verificata per rivelazione elettroforetica come descritto nel paragrafo "Rivelazione elettroforetica del prodotto di amplificazione (opzionale)" a pag. 14/16. SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 11/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 12/17

7 Convalidazione dell amplificazione e della rivelazione dei singoli campioni I risultati del Controllo del coniugato, del Controllo di specificità e dei tre Controlli di sensibilità sulla striscia del singolo campione in analisi sono utilizzati per convalidarne l amplificazione e la rivelazione come descritto nella tabella seguente: Esempio Controllo del coniugato Controllo di specificità + Controllo di sensibilità FV + + Sonda FV mutante / + + Sonda FV normale / + + Controllo di sensibilità FII + + Sonda FII mutante / + + Sonda FII normale / + + Controllo di sensibilità MTHFR + + Sonda MTHFR mutante / + + Sonda MTHFR normale / + + Esempio 1: risultato valido. Esempio 2: risultato non valido a causa di rivelazione assente. Esempio 3: risultato non valido a causa di amplificazione inefficiente o assenza di prodotto di amplificazione*. Esempio 4: risultato non valido a causa di ibridazione aspecifica. Se i risultati del Controllo del coniugato, del Controllo di specificità e dei tre Controlli di sensibilità sulla striscia del singolo campione in analisi non sono validi si possono essere verificati problemi nella fase di rivelazione o di amplificazione che possono causare risultati errati. Il test di questo campione in analisi non è valido e deve essere ripetuto a partire dalla fase di amplificazione. * La presenza del prodotto di amplificazione può essere verificata per rivelazione elettroforetica come descritto nel paragrafo "Rivelazione elettroforetica del prodotto di amplificazione (opzionale)" a pag. 14/16. Interpretazione dei risultati I risultati della Sonda FV mutante e del Sonda FV normale sulla striscia del singolo campione in analisi sono utilizzati per determinarne il genotipo sulla base della presenza o assenza dell'allele FV mutante (506Q, 1691A, Leiden) e dell'allele FV normale (506R, 1691G) come descritto nella tabella seguente: Esempio Controllo del coniugato Controllo di specificità Controllo di sensibilità FV Sonda FV mutante + + Sonda FV normale + + Controllo di sensibilità FII Sonda FII mutante / + / + / + Sonda FII normale / + / + / + Controllo di sensibilità MTHFR Sonda MTHFR mutante / + / + / + Sonda MTHFR normale / + / + / + Esempio 1: campione normale per il Fattore V. Esempio 2: campione omozigote mutante per il Fattore V (506Q, 1691A, Leiden). Esempio 3: campione eterozigote per il Fattore V (506Q, 1691A, Leiden). I risultati della Sonda FII mutante e del Sonda FII normale sulla striscia del singolo campione in analisi sono utilizzati per determinarne il genotipo sulla base della presenza o assenza dell'allele FII mutante (20210A) e dell'allele FII normale (20210G) come descritto nella tabella seguente: Esempio Controllo del coniugato Controllo di specificità Controllo di sensibilità FV Sonda FV mutante / + / + / + Sonda FV normale / + / + / + Controllo di sensibilità FII Sonda FII mutante + + Sonda FII normale + + Controllo di sensibilità MTHFR Sonda MTHFR mutante / + / + / + Sonda MTHFR normale / + / + / + Esempio 1: campione normale per il Fattore II. Esempio 2: campione omozigote mutante per il Fattore II (20210A). Esempio 3: campione eterozigote per il Fattore II (20210A). I risultati della Sonda MTHFR mutante e del Sonda MTHFR normale sulla striscia del singolo campione in analisi sono utilizzati per determinarne il genotipo sulla base della presenza o assenza dell'allele MTHFR mutante (223V, 677T) e dell'allele MTHFR normale (223A, 677C) come descritto nella tabella seguente: Esempio Controllo del coniugato Controllo di specificità Controllo di sensibilità FV Sonda FV mutante / + / + / + Sonda FV normale / + / + / + Controllo di sensibilità FII Sonda FII mutante / + / + / + Sonda FII normale / + / + / + Controllo di sensibilità MTHFR Sonda MTHFR mutante + + Sonda MTHFR normale + + Esempio 1: campione normale per l'mthfr. Esempio 2: campione omozigote mutante per l'mthfr (223V, 677T). Esempio 3: campione eterozigote per l'mthfr (223V, 677T). BIBLIOGRAFIA Voorberg, J. et al. (1994) The Lancet 343: Baker, R. et al. (1994) The Lancet 344: Poort, S. R. et al. (1996) Blood 88: Kluijtmans L. A. et al. (1996) Am J Hum Genet 58: Cattaneo M. et al. (1997) Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17: SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 13/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 14/17

8 PROBLEMI E SOLUZIONI Completa o parziale assenza di bande per il FV, il FII o l'mthfr nel Positive Control Presenza di macchie nel Controllo negativo, nel Positive Control o nel campione Strisce di rivelazione toccate con le mani. Errore nelle operazioni di rivelazione. Errore nella dispensazione del substrato. Utilizzare delle pinzette di plastica pulite. Rimuovere con attenzione il Coniugato 1x dai canali con la micropipetta. Fare attenzione a non lasciare a secco la striscia per troppo tempo. Eseguire le operazioni di dispensazione del substrato con una pipetta diversa da quella utilizzata per il Coniugato 1x. Completa assenza di bande nel Controllo negativo, nel Positive Control o nel campione Errore nella diluizione del coniugato. Errore nella dispensazione del coniugato. Errore nella dispensazione del substrato. Presenza di bande per il FV, il FII o l'mthfr nel Controllo negativo Errore nella dispensazione del DNA estratto. Contaminazione dei reagenti preparati per la sessione. Controllare le operazioni di diluizione del coniugato. Seguire con attenzione le operazioni di dispensazione del coniugato. Seguire con attenzione le operazioni di dispensazione del substrato. Aprire una provetta per volta, evitare di spargere il contenuto della provetta, cambiare sempre puntale. Seguire con attenzione la diluizione e la dispensazione dell'enzima, cambiare sempre puntale. Enzima troppo diluito o errore nella dispensazione dell'enzima. Errore nella dispensazione del controllo positivo. Degradazione del controllo positivo. Errore di impostazione del ciclo termico. Errore nelle operazioni di rivelazione. Lavaggio troppo efficace. Presenza di bande aspecifiche nel Positive Control o nel campione Errore nelle operazioni di rivelazione. Lavaggio poco efficace. Controllare i calcoli di diluizione, dispensare con attenzione l'enzima e mescolare adeguatamente. Seguire con attenzione la dispensazione del controllo positivo. Utilizzare una nuova aliquota di controllo positivo. Controllare il ciclo termico impostato sul thermal cycler. Seguire con attenzione la dispensazione e la denaturazione dei prodotti di amplificazione. Rispettare il numero, la durata e la modalità di esecuzione dei lavaggi. Controllare la temperatura ambiente e la temperatura del lavaggio di stringenza. Rimuovere con attenzione la soluzione di ibridazione dai canali con la micropipetta. Fare attenzione a non lasciare a secco la striscia per troppo tempo. Rispettare il numero, la durata e la modalità di esecuzione dei lavaggi. Controllare la temperatura ambiente e la temperatura del lavaggio di stringenza. Contaminazione del Diluente dell'enzima. Utilizzare una nuova aliquota di Diluente dell'enzima. Contaminazione dello stock di enzima. Utilizzare una nuova aliquota di enzima. Contaminazione dell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. Errore nella dispensazione del prodotto di amplificazione. Errore nelle operazioni di rivelazione. Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare camici, sostituire guanti, provette e puntali in uso. Cambiare sempre il puntale della micropipetta quando si dispensano campioni diversi. Fare attenzione che le miscele di ibridazione restino confinate nei propri canali e non vadano a contaminare i canali adiacenti. SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 15/17 SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 16/17

9 LEGENDA DEI SIMBOLI Numero di catalogo. Limiti di temperatura. Codice del lotto. Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contenuto sufficiente per "N" test. CONT Contenuto. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Fabbricante. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ad un prodotto licenziato "Positive Control" ed uno per la rivelazione della ELITechGroup S.p.A. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH mdbs00 28/05/13 Revisione 02 Pag. 17/17