CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliMIX Ref. RTS098

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1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: Ref. RTS098 Composto da: Composed by: Composé par: Compuesto por: Composta por: Komponiert von: RTS098M CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS098P Q - PCR Alert AmpliMASTER RTS000 RTS098_Front

2 0344 SOMMARIO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: sito WEB: C USO PREVISTO pag. 1 PRINCIPIO DEL SAGGIO pag. 2 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 3 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 CAMPIONI E CONTROLLI pag. 5 PROCEDURA pag. 6 LIMITI DELLA PROCEDURA pag. 13 CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI pag. 14 BIBLIOGRAFIA pag. 19 PROBLEMI E SOLUZIONI pag. 19 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 20 PRINCIPIO DEL SAGGIO La procedura prevede l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time). In ogni pozzetto si effettua una reazione di amplificazione specifica per una regione del gene codificante la proteina dnab-like del plasmide endogeno (presente in circa 7-10 copie per cellula) di C. trachomatis e per un regione del gene umano della beta Globina (Controllo Interno di idoneità del campione) utilizzando il DNA estratto dai campioni in esame. La sonda specifica per C. trachomatis marcata con il fluoroforo FAM è attivata quando ibrida con il prodotto specifico della reazione di amplificazione per C. trachomatis. La sonda specifica per il Controllo Interno marcata con il fluoroforo VIC è attivata quando ibrida con il prodotto della reazione di amplificazione per il Controllo Interno. L emissione della fluorescenza aumenta con l'aumentare dei prodotti specifici della reazione di amplificazione ed è misurata e registrata dallo strumento. L'elaborazione dei dati permette di rilevare la presenza e quantificare il titolo del DNA di C. trachomatis nel campione di partenza. La validazione del saggio è stata eseguita su strumenti Applied Biosystems della serie DESCRIZIONE DEL PRODOTTO Il prodotto fornisce la miscela di oligonucleotidi di innesco (primer) AmpliMIX per l'amplificazione real time in una soluzione stabilizzante, prealiquotata in quattro provette monouso. Ogni provetta contiene 110 µl di soluzione, sufficiente per 24 test. Gli oligonucleotidi di innesco per C. trachomatis sono specifici per la regione codificante la proteina dnab-like del plasmide endogeno di C. trachomatis. Gli oligonucleotidi di innesco per il Controllo Interno di idoneità del campione sono specifici per la regione promotore e 5' UTR del gene umano della beta Globina. Il prodotto consente di effettuare 96 determinazioni, standard e controlli compresi. MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente Descrizione Quantità Classificazione dei pericoli CHLA. tr. AmpliMIX Miscela di oligonucleotidi di innesco 4 x 110 µl - USO PREVISTO Il prodotto è parte di un saggio di amplificazione degli acidi nucleici per la rilevazione e la quantificazione del DNA di Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) in campioni di DNA estratto da tamponi uretrali, tamponi cervicali, urine primo getto raccolte senza conservanti processate singolarmente o in pool. Il prodotto trova impiego nella diagnosi e nel monitoraggio dell'infezione da C. trachomatis, insieme ai dati clinici del paziente e agli esiti di altri esami di laboratorio. MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO - Cappa a flusso laminare. - Guanti senza polvere monouso in lattice o simili. - Miscelatore vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza Applied Biosystems della serie 7000, calibrato come previsto dal fabbricante. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 1/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 2/20

3 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'estrazione del DNA dai campioni da analizzare, il controllo positivo di estrazione, i reagenti ottimizzati per l'amplificazione, i reagenti di rilevazione (sonde fluorescenti) ed il controllo positivo di amplificazione o i DNA standard a quantità nota non sono inclusi in questo prodotto. Per l'estrazione manuale del DNA dai campioni da analizzare, si consiglia l impiego del prodotto generico «EXTRAcell» (ELITechGroup S.p.A., codice EXTD02), kit di estrazione del DNA da campioni cellulari. Per l'estrazione automatica del DNA dai campioni da analizzare si consiglia l impiego dei seguenti prodotti generici: «Helix DNA Plus» (Diatech pharmacogenetics S.r.L, codice H8020) kit di estrazione del DNA da campioni biologici e «HES consumable pack red», (Diatech pharmacogenetics S.r.L, codice HESRED-20) consumabili per l'estrazione del DNA con lo strumento «X-tractor Gene» (Diatech pharmacogenetics S.r.L, codice 1820UV). «NucliSENS easymag Reagents» (biomérieux SA, codici , , , , , ), kit di estrazione degli acidi nucleici da campioni biologici con lo strumento «NucliSENS easymag» (biomérieux SA, codice ). Come controllo positivo di estrazione e controllo di inibizione è richiesto l impiego del prodotto generico «CPE-DNA - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., codice CTREXTG), controllo positivo di estrazione di DNA plasmidico per estrazioni del DNA da campioni non cellulari. Per l'allestimento delle reazioni di amplificazione real time è richiesto l impiego del prodotto generico «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (ELITechGroup S.p.A., codice RTS000), miscela di reagenti ottimizzati, micropiastre da 0,2 ml e fogli adesivi per l'amplificazione real time. Nel caso sia previsto l'uso di uno strumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, si consiglia l'impiego del prodotto generico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., codice RTSACC02) micropiastre con pozzetti da 0,1 ml e fogli adesivi per l'amplificazione real time. Per l'allestimento delle reazioni di amplificazione real time è richiesto l impiego del prodotto principale «CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE» (ELITechGroup S.p.A., codice RTS098-P), sonde fluorescenti per l'amplificazione real time. Nel caso sia richiesta la rilevazione del DNA di C. trachomatis (analisi qualitativa) è richiesto l impiego del prodotto principale «CHLAMYDIA tr. - Positive Control» (ELITechGroup S.p.A., codice CTR098), controllo positivo di amplificazione di DNA plasmidico. Nel caso sia richiesta la rilevazione e quantificazione del DNA di C. trachomatis (analisi quantitativa) è richiesto l impiego del prodotto principale «CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard» (ELITechGroup S.p.A., codice STD098), quattro diluizioni di DNA plasmidico a quantità nota per ottenere la curva standard. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un 'ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal fabbricante. Non utilizzare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri fabbricanti. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rilevazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione/ rilevazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti Le provette contenenti l'amplimix sono monouso e pertanto devono essere utilizzate una volta sola nella preparazione della miscela di reazione. L'AmpliMIX non presenta frasi di rischio (R) e presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 3/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 4/20

4 Campioni CAMPIONI E CONTROLLI Questo prodotto deve essere utilizzato con DNA estratto dai seguenti campioni biologici: tamponi uretrali e tamponi cervicali, urine primo getto raccolte senza conservanti processate singolarmente o in pool. Tamponi uretrali e tamponi cervicali I tamponi uretrali o i tamponi cervicali devono essere preparati secondo le indicazioni del laboratorio, risospesi in mezzo di trasporto per colture cellulari o Soluzione fisiologica sterile o PBS sterile, trasportati a +2 / +8 C e conservati a +2 / +8 C per un massimo di tre giorni. Non congelare i tamponi uretrali e i tamponi cervicali in modo da evitare la lisi delle cellule e la perdita di titolo del DNA batterico. Nota bene: quando si esegue l'estrazione del DNA con il kit «EXTRAcell» seguire le indicazioni riportate nel Manuale di istruzioni per l'uso: pretrattare il campione clinico e partire da circa cellule. Urine primo getto raccolte senza conservanti I campioni di urine primo getto destinati all'estrazione degli acidi nucleici devono essere raccolti in contenitori senza conservanti secondo le indicazioni del laboratorio, trasportati a temperatura ambiente (+18 / +25 C) e conservati a temperatura ambiente (+18 / +25 C) per un massimo di quattro ore altrimenti devono essere conservati a +2 / +8 C per un massim o di tre giorni. Se possibile, evitare di congelare i campioni di urina primo getto. Il congelamento può causare la precipitazione di inibitori e la lisi di parte delle cellule e la perdita di titolo del DNA batterico. Nota bene: quando si esegue l'estrazione del DNA con un sistema automatico seguire le indicazioni riportate nel Manuale di istruzioni per l'uso dello strumento e dei reagenti. Nota bene: Nel caso delle urine primo getto analizzate singolarmente, per il pretrattamento trasferire 10 ml di campione in un tubo di polipropilene sterile da 15 ml e centrifugare il campione a 3000 RPM per 30 minuti a temperatura ambiente, eliminare il sovranatante, facendo attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo, risospendere il deposito di cellule in 400 µl di soluzione fisiologica (non fornita nel prodotto), procedere all'estrazione con lo strumento «X-tractor Gene» utilizzando il protocollo di estrazione per campioni non cellulari, con un volume di eluizione di 60 µl. Nota bene: Nel caso delle urine primo getto analizzate in pool, per il pretrattamento trasferire 10 ml di campione in un tubo di polipropilene sterile da 15 ml e centrifugare il campione a 3000 RPM per 30 minuti a temperatura ambiente, eliminare il sovranatante, facendo attenzione a non asportare il deposito di cellule presente sul fondo del tubo, risospendere il deposito di cellule in 400 µl di soluzione fisiologica (non fornita nel prodotto), prelevare 200 µl, di cellule risospese da 5 pazienti e unire in un pool da 1 ml, procedere all'estrazione con lo strumento «NucliSENS easymag» utilizzando il protocollo di estrazione Generic 2.0.1, con un volume di eluizione di 25 µl. I restanti 200 µl dovranno essere utilizzati per identificare gli eventuali pazienti positivi. Nel caso in cui un campione non presentasse un deposito visibile di cellule, aggiungere 10 µl di CPE-DNA nelle fasi iniziali dell'estrazione. Sostanze interferenti Il DNA estratto dal campione di partenza non deve contenere mucoproteine, etanolo o 2-propanolo per evitare fenomeni di inibizione e la comparsa di frequenti risultati non validi. Quantità di DNA genomico umano elevate nel DNA estratto dal campione possono inibire la reazione di amplificazione. Non sono disponibili dati riguardo eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci antivirali, antibiotici, chemioterapici o immunosopressori. Controlli di amplificazione E' assolutamente necessario convalidare ciascuna sessione di amplificazione allestendo una reazione di controllo negativo e una reazione di controllo positivo. Come controllo negativo utilizzare acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) da aggiungere alla reazione al posto del DNA estratto dal campione. Come controllo positivo utilizzare il prodotto «CHLAMYDIA tr. - Positive Control» o il prodotto «CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard». Controlli di qualità E' consigliato convalidare l'intera procedura di analisi di ciascuna sessione, estrazione ed amplificazione, utilizzando un campione negativo e un campione positivo già testati o del materiale di riferimento calibrato. PROCEDURA Impostazione della sessione di amplificazione real time (Da eseguire nell'area di amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione) Se si utilizza uno strumento 7300 Real-Time PCR System: prima di iniziare la sessione, riferendosi alla documentazione dello strumento, è necessario: - accendere il thermal cycler per real time, accendere il computer di controllo, lanciare il software dedicato e aprire una sessione "absolute quantification"; - impostare il "detector" per la sonda per C. trachomatis con il "reporter" = "FAM" e il "quencher" = "none" (NFQ è un quencher non fluorescente) e chiamarlo CHLA.TR. ; - impostare il "detector" per la sonda per il Controllo Interno con il "reporter" = "VIC" e il "quencher" = "none" (NFQ è un quencher non fluorescente) e chiamarlo CI ; - per ciascun pozzetto in uso della micropiastra, impostare i "detector" (tipo di fluorescenza da misurare), il "passive reference" = "ROX" (normalizzazione della fluorescenza misurata) e il tipo di reazione (campione, controllo negativo di amplificazione, controllo positivo di amplificazione o standard con la relativa quantità nota). Compilare il Piano di lavoro allegato al fondo di questo manuale di istruzioni per l'uso trascrivendo queste informazioni oppure stampare l'organizzazione della micropiastra. Il Piano di lavoro dovrà essere seguito con attenzione durante il trasferimento nei pozzetti della miscela di reazione e dei campioni. Nota bene: per la quantificazione del titolo del DNA nel campione di partenza è necessario allestire una serie di reazioni con i Q - PCR Standard (10 5 copie, 10 4 copie, 10 3 copie, 10 2 copie) per ottenere la Curva standard. Si illustra sotto, a titolo di esempio, come può essere organizzata l'analisi quantitativa di 11 campioni. C1 C9 C2 C10 C3 C11 C4 CN C C C C Legenda: C1 - C11: Campioni da analizzare; CN: Controllo negativo di amplificazione; 10 2 : Standard 10 2 copie; 10 3 : Standard 10 3 copie; 10 4 : Standard 10 4 copie; 10 5 : Standard 10 5 copie. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 5/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 6/20

5 Riferendosi alla documentazione dello strumento, impostare sul thermal cycler i parametri del ciclo termico indicando 45 cicli, un volume di reazione di 25 µl e, quando possibile, l'opzione "9600 emulation". Ciclo termico di amplificazione Fase Temperature Tempi Decontaminazione 50 C 2 min. Denaturazione iniziale 95 C 10 min. 45 cicli 95 C 15 sec. 60 C 1 min. Se si utilizza uno strumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Prima di iniziare la sessione, riferendosi alla documentazione dello strumento, è necessario: - accendere il thermal cycler per real time, accendere il computer di controllo, avviare il software dedicato e aprire una sessione "absolute quantification" e impostare "Run mode: Fast 7500"; - impostare (Detector Manager) il "detector" per la sonda per C. trachomatis con il "reporter" = "FAM" e il "quencher" = "none" (non fluorescente) e chiamarlo "CHLA.TR."; - impostare il "detector" per la sonda per il Controllo Interno con il "reporter" = "VIC" e il "quencher" = "none" (NFQ è un quencher non fluorescente) e chiamarlo CI ; - per ciascun pozzetto in uso della micropiastra, impostare i "detector" (tipo di fluorescenza da misurare), il "passive reference" = "ROX" (normalizzazione della fluorescenza misurata) e il tipo di reazione (campione, controllo negativo di amplificazione, controllo positivo di amplificazione o standard con la relativa quantità nota). Compilare il Piano di lavoro allegato al fondo di questo manuale di istruzioni per l'uso trascrivendo queste informazioni oppure stampare l'organizzazione della micropiastra. Il Piano di lavoro dovrà essere seguito con attenzione durante il trasferimento nei pozzetti della miscela di reazione e dei campioni. Nota bene: per la determinazione del titolo del DNA nel campione di partenza è necessario allestire una serie di reazioni con i CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard (10 5 copie, 10 4 copie, 10 3 copie, 10 2 copie) per ottenere la Curva standard. La modalità di organizzazione di un'analisi quantitativa di alcuni campioni è illustrata a titolo di esempio nella sezione relativa alla procedura riferita allo strumento 7300 Realime PCR System. Riferendosi alla documentazione dello strumento, impostare sul software dedicato (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Thermal Profile) i parametri del ciclo termico: - aggiungere nella fase di amplificazione il passaggio (Add Step) di estensione a 72 C ; Nota bene: l'acquisizione della fluorescenza (Instrument > Thermal Cycler Protocol > Settings > Data Collection) deve rimanere impostata nel passaggio di ibridazione a 60 C. - modificare i tempi come indicato nella tabella seguente; - impostare un numero di cicli pari a 45; - impostare un volume di reazione pari a 30 µl; Ciclo termico Fase Temperature Tempi Decontaminazione 50 C 2 min. Denaturazione iniziale 95 C 10 min. Amplificazione e rilevazione (45 cicli) 95 C 15 sec. 60 C (acquisizione della fluorescenza) 45 sec. 72 C 15 sec. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 7/20 Allestimento dell'amplificazione (Da eseguire nell'area di estrazione / allestimento della reazione di amplificazione) Prima di iniziare la sessione è necessario: - prelevare e scongelare le provette con i campioni da analizzare. Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare e scongelare le provette di CHLAMYDIA tr. AmpliMIX necessarie per la sessione ricordando che il contenuto di ciascuna provetta è sufficiente per allestire 24 reazioni. Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare e scongelare un numero di provette di CHLAMYDIA tr. AmpliPROBE uguale a quello delle provette di CHLAMYDIA tr. AmpliMIX Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare un numero di provette di AmpliMASTER uguale a quello delle provette di AmpliMIX. Scrivere con inchiostro indelebile "CHLA. tr." e la data sull'etichetta delle provette. Centrifugare le provette per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare e scongelare la provetta di CHLAMYDIA tr. - Positive Control o le provette di CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard. Agitare gentilmente le provette, centrifugarle per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto e tenerle in ghiaccio; - prelevare la Amplification microplate che sarà utilizzata nella sessione facendo attenzione a maneggiarla con guanti senza polvere e a non danneggiare i pozzetti. 1. Trasferire 100 µl di CHLAMYDIA tr. AmpliMIX nella provetta di AmpliMASTER. Mescolare bene pipettando per tre volte il volume di 100 µl nella mix. 2. Trasferire 100 µl di CHLAMYDIA tr. AmpliPROBE nella provetta di AmpliMASTER. Mescolare bene pipettando per tre volte il volume di 100 µl nella mix. 3. Miscelare per 5 secondi con il vortex a bassa velocità, evitando di produrre schiuma. 4. Centrifugare le provette per 5 secondi per riportare sul fondo il contenuto. 5. Trasferire, depositandoli accuratamente sul fondo, 20 µl della miscela di reazione così ottenuta nei pozzetti della Amplification microplate come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro. Nota bene: Se non si utilizza tutta la miscela di reazione, conservare il volume rimasto al buio a - 20 C per un massimo di un mese nella provetta "CHLA. tr." Congelare e scongelare la miscela di reazione SOLO UNA VOLTA. 6. Trasferire, depositandoli accuratamente nella miscela di reazione, 5 µl di DNA estratto del primo campione nel corrispondente pozzetto della Micropiastra di amplificazione come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro, procedere ugualmente con tutti gli altri DNA estratti. 7. Trasferire, depositandoli accuratamente nella miscela di reazione, 5 µl di Acqua bidistillata sterile (non fornita nel prodotto) nel pozzetto della Amplification microplate del controllo negativo di amplificazione come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro. 8. Trasferire, depositandoli accuratamente nella miscela di reazione, 5 µl di CHLAMYDIA tr. - Positive Control nel corrispondente pozzetto della Amplification microplate come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro. Nota bene: Quando questo prodotto è utilizzato per la quantificazione del DNA di C. trachomatis trasferire, depositandoli accuratamente nella miscela di reazione, 5 µl di CHLAMYDIA tr Q - PCR Standard 10 2 copie nel corrispondente pozzetto della Amplification microplate come stabilito precedentemente sul Piano di lavoro. Procedere allo stesso modo con gli altri CHLAMYDIA tr Q - PCR Standard (10 3, 10 4, 10 5 copie). 9. Sigillare accuratamente la Amplification microplate con l Amplification Sealing Sheet. 10. Trasferire la Amplification microplate nel thermal - cycler per real time posto nell'area di amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione e avviare il ciclo termico di amplificazione salvando l'impostazione della sessione con un identificativo univoco e riconoscibile (per es. "annomese-giorno-chla-elitechgroup"). Nota bene: Al termine del ciclo termico la Amplification microplate con i prodotti di reazione deve essere rimossa dallo strumento ed eliminata in modo da non generare contaminazioni ambientali. Non sollevare mai l Amplification Sealing Sheet dalla Amplification microplate in modo da evitare la fuoriuscita dei prodotti di reazione. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 8/20

6 Analisi qualitativa dei risultati I valori registrati della fluorescenza emessa dalla sonda specifica per C. trachomatis (detector FAM CHLA.TR. ) e dalla sonda specifica per il Controllo Interno (detector VIC CI ) nelle reazioni di amplificazione devono essere analizzati con il software dello strumento. Prima di eseguire l'analisi, riferendosi alla documentazione dello strumento, è necessario: - impostare manualmente l'intervallo di calcolo del Livello di fluorescenza di fondo (Baseline) dal ciclo 6 al ciclo 15; Nota bene: Nel caso di un campione positivo ad alto titolo di C. trachomatis, la fluorescenza FAM della sonda specifica per C. trachomatis può cominciare a crescere prima del ciclo 15. In questo caso l'intervallo di calcolo del Livello di fluorescenza di fondo deve essere adattato dal ciclo 6 al ciclo in cui la fluorescenza FAM comincia a crescere. Se si è utilizzato uno strumento 7300 Real-Time PCR System: - impostare manualmente la Soglia (Threshold) per il detector FAM "CHLA.TR." a 0,2; - impostare manualmente la Soglia (Threshold) per il detector VIC "CI" a 0,1. Se si è utilizzato uno strumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: - impostare manualmente la Soglia (Threshold) per il detector FAM "CHLA.TR." a 0,1; - impostare manualmente la Soglia (Threshold) per il detector VIC "CI" a 0,05. I valori di fluorescenza emessi dalle sonde specifiche nella reazione di amplificazione e il valore Soglia di fluorescenza permettono di determinare il Ciclo Soglia (Threshold cycle, Ct), il ciclo in cui è stato raggiunto il valore Soglia di fluorescenza. Nella reazione di amplificazione con il CHLAMYDIA tr. - Positive Control*, il valore di Ct della sonda specifica per C. trachomatis è utilizzato per convalidare l amplificazione e la rilevazione come descritto nella tabella seguente: CHLAMYDIA tr. Positive Control detector FAM CHLA.TR. Risultato del saggio Amplificazione / Rilevazione Ct 25 POSITIVO CORRETTA Se il risultato della reazione di amplificazione del CHLAMYDIA tr. - Positive Control è Ct > 25 o Ct Non determinato (Undetermined), non è stata rilevata in modo corretto la presenza di DNA bersaglio. Si sono verificati problemi nella fase di amplificazione o di rilevazione (preparazione errata della miscela di reazione, dispensazione errata della miscela di reazione o del controllo positivo, degradazione della sonda o del controllo positivo, impostazione errata della posizione del controllo positivo, impostazione errata del ciclo termico) che possono causare risultati errati. La sessione non è valida e deve essere ripetuta dalla fase di amplificazione. * Nota bene: Quando questo prodotto è utilizzato per la quantificazione del DNA di C. trachomatis, al posto della reazione con il CHLAMYDIA tr. - Positive Control è stata allestita la serie di reazioni con i CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard. In questo caso per convalidare l amplificazione e la rilevazione si deve fare riferimento alla reazione di amplificazione del CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard Nella reazione di amplificazione di Controllo negativo, il valore di Ct della sonda specifica per C. trachomatis è utilizzato per convalidare l amplificazione e la rilevazione come descritto nella tabella seguente: Reazione Controllo negativo detector FAM CHLA.TR. Risultato del saggio Amplificazione / Rilevazione Ct Non determinato NEGATIVO CORRETTA Nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione, i valori di Ct della sonda specifica per C. trachomatis sono utilizzati per rilevare la presenza di DNA bersaglio, mentre i valori di Ct della sonda specifica per il Controllo Interno sono utilizzati per convalidare l estrazione, l amplificazione e la rilevazione. Nota bene: Verificare con il software dello strumento (Results, Amplification plot, delta Rn vs Cycle) che il Ct sia determinato da un rapido e regolare incremento dei valori di fluorescenza e non da fenomeni di picco o incremento del segnale di fondo. Questo prodotto è in grado di rilevare una quantità minima di circa 7 copie di DNA del plasmide endogeno di C. trachomatis per reazione di amplificazione, corrispondenti a 0,36 Unità Arbitrarie (AU) per reazione (materiale di riferimento calibrato PeliCheck Chlamydia t.-dna-02, AcroMetrix Europe B.V., Paesi Bassi) (vedi Caratteristiche delle prestazioni a pagina 14). I risultati come Ct delle reazioni di amplificazione di ciascun campione sono utilizzati come descritto nella tabella seguente: Reazione del campione detector FAM detector VIC CI CHLA.TR. Ct Non determinato Ct Determinato Ct > 35 o Ct Non determinato Idoneità del campione Risultato del saggio DNA di C. trachomatis non idoneo non valido - Ct 35 idoneo valido, negativo NON RILEVATO Ct > 35 o Ct Non determinato idoneo* valido, positivo RILEVATO Ct 35 idoneo valido, positivo RILEVATO Se il risultato della reazione di amplificazione di un campione è Ct Non determinato per la sonda specifica per C. trachomatis e Ct > 35 o Ct Non determinato per la sonda specifica per il Controllo Interno, non è stato possibile rilevare in modo efficiente il DNA del Controllo Interno. In questo caso si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (amplificazione non efficiente o nulla) o nella fase di estrazione (assenza o perdita del DNA, presenza di inibitori, DNA del campione degradato o campione di partenza con un numero di cellule insufficiente) che possono causare risultati errati e falsi negativi. Il campione non è idoneo, il saggio non è valido e deve essere ripetuto a partire dall estrazione di un nuovo campione. Se il risultato della reazione di amplificazione di un campione è Ct Non determinato per la sonda specifica per C. trachomatis e Ct 35 per la sonda specifica per il Controllo Interno, il DNA di C. trachomatis non è stato rilevato nel DNA estratto dal campione ma non si può escludere che sia presente ad un titolo inferiore al limite di rilevazione del prodotto (vedi Caratteristiche delle prestazioni a pagina 14). In questo caso il risultato sarebbe un falso negativo. I risultati ottenuti con questo saggio devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e gli esiti di altri esami di laboratorio relativi al paziente. *Nota bene: Quando nella reazione di amplificazione relativa ad un campione è stata rilevata la presenza di DNA di C. trachomatis, l'amplificazione del Controllo Interno può dare come risultato un Ct > 35 o Ct Non determinato. Infatti la reazione di amplificazione a bassa efficienza del Controllo Interno può essere annullata dalla competizione con la reazione di amplificazione ad alta efficienza del DNA di C. trachomatis. In questo caso il campione è comunque idoneo e il risultato positivo del saggio è valido. Se il risultato della reazione di amplificazione del Controllo negativo è diverso da Ct Non determinato (Undetermined), è stata rilevata la presenza di DNA bersaglio. Si sono verificati problemi nella fase di amplificazione (contaminazione) che possono causare risultati errati e falsi positivi. La sessione non è valida e deve essere ripetuta dalla fase di amplificazione. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 9/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 10/20

7 Analisi quantitativa dei risultati Dopo avere eseguito la procedura per l'analisi qualitativa dei risultati è possibile svolgere l'analisi quantitativa dei risultati relativi ai campioni positivi. I valori di Ct della sonda specifica per C. trachomatis nelle reazioni di amplificazione dei quattro CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard sono utilizzati per calcolare la Curva standard (Standard Curve) della sessione di amplificazione e per convalidare l amplificazione e la rilevazione come descritto nella tabella seguente: Curva Standard detector FAM CHLA.TR. Intervallo di accettabilità Amplificazione / Rilevazione Coefficiente di Correlazione (R2) 0,990 R2 1,000 CORRETTA Se il valore del Coefficiente di correlazione (R2) non rientra nei limiti, si sono verificati problemi nella fase di amplificazione o di rilevazione (preparazione errata della miscela di reazione, dispensazione errata della miscela di reazione o degli standard, degradazione della sonda o degli standard, impostazione errata della posizione degli standard, impostazione errata del ciclo termico) che possono causare risultati errati. La sessione non è valida e deve essere ripetuta dalla fase di amplificazione. I valori di Ct della sonda specifica per C. trachomatis nelle reazioni di amplificazione di ciascun campione e la Curva standard della sessione di amplificazione sono utilizzati per calcolare la Quantità (Quantity) di DNA bersaglio presente nelle reazioni di amplificazione relative ai campioni. Questo prodotto è in grado di quantificare da a 16 copie di DNA del plasmide endogeno di C. trachomatis per reazione di amplificazione, oppure da a 0,8 AU per reazione (materiale di riferimento calibrato PeliCheck Chlamydia t.-dna-02, AcroMetrix Europe B.V., Paesi Bassi, vedi Caratteristiche delle prestazioni a pagina 14), come descritto nella tabella seguente: Risultato del campione detector FAM CHLA.TR. C. trachomatis AU per reazione Quantità > 1 x 10 6 SUPERIORI A Quantità 1 x 10 6 = Quantità x Fc (vedi di seguito) Quantità < 16 INFERIORI A 0,8 I risultati (Quantità) delle reazioni di amplificazione relative ai campioni possono essere utilizzati per calcolare il numero di AU di C. trachomatis presenti nel campione utilizzato per l'estrazione (Nc) secondo questa formula: Ve x Quantità Nc = Va x Ee x Vc x Fc Dove: Vc è la quantità del campione usato nell'estrazione in rapporto all unità di misura richiesta; Ee è l'efficienza dell estrazione espressa in decimali; Ve è il volume totale ottenuto dall'estrazione espresso in µl; Va è il volume del prodotto di estrazione usato nella reazione di amplificazione espresso in µl; Quantità è il risultato della reazione di amplificazione relativa al campione espresso in copie di DNA del plasmide endogeno. Fc è il fattore di conversione per ottenere le AU di C. trachomatis*: con questo prodotto e il prodotto «CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard» il parametro Fc è uguale a 20 copie di DNA del plasmide endogeno per ciascuna AU. Quando si utilizza il kit di estrazione «EXTRAcell» e si vuole ottenere il risultato espresso in AU / estrazione, la formula diventa: Formula semplificata per «EXTRAcell» Vc = omesso Ee = 1,0 (efficienza media del 100%) Ve = 100 µl Va = 5 µl Fc = x Quantità Nc (AU / estrazione) = 5 x 1,0 x 20 Nc (AU / estrazione) = 1 x Quantità Quando si utilizza il kit di estrazione «Helix DNA Plus» e si vuole ottenere il risultato espresso in AU / estrazione, la formula diventa: Formula semplificata per «Helix DNA Plus» Vc = omesso Ee = 1,0 (efficienza media del 100%) Ve = 60 µl Va = 5 µl Fc = x Quantità Nc (AU / estrazione) = 5 x 1,0 x 20 Nc (AU / estrazione) = 0.6 x Quantità Quando si utilizza il kit di estrazione «NucliSENS easymag» e si vuole ottenere il risultato espresso in AU / estrazione, la formula diventa: Formula semplificata per «NucliSENS easymag» Vc = omesso Ee = 1,0 (efficienza media del 100%) Ve = 25 µl Va = 5 µl Fc = x Quantità Nc (AU / estrazione) = 5 x 1,0 x 20 Nc (AU / estrazione) = 0,25 x Quantità * Non essendo disponibili materiali di riferimento di ordine superiore o approvati dall'oms per C. trachomatis, il fattore di conversione Fc per ottenere le AU di C. trachomatis è stato stabilito utilizzando il materiale di riferimento calibrato PeliCheck Chlamydia t.-dna-02, AcroMetrix Europe B.V., Paesi Bassi. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 11/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 12/20

8 LIMITI DELLA PROCEDURA CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI Utilizzare con questo prodotto soltanto il DNA estratto dai seguenti campioni umani: tamponi uretrali, tamponi cervicali, urine primo getto raccolte senza conservanti processate singolarmente o in pool. Non utilizzare con questo prodotto DNA estratto contaminato da mucoproteine, etanolo o 2- propanolo: queste sostanze inibiscono la reazione di amplificazione degli acidi nucleici e possono causare risultati non validi. Non utilizzare con questo prodotto DNA estratto contenente elevate quantità di DNA genomico umano che possono inibire la reazione di amplificazione degli acidi nucleici. Non sono disponibili dati riguardo le prestazioni di questo prodotto con il DNA estratto dai seguenti campioni clinici: liquido lacrimale, sperma. Non sono disponibili dati riguardo eventuali fenomeni di inibizione da parte di farmaci antivirali, antibiotici, chemioterapici o immunosoppressori. I risultati ottenuti con questo prodotto dipendono dalla corretta identificazione, raccolta, trasporto, conservazione e preparazione dei campioni; per evitare risultati errati è quindi necessario porre particolare cura durante queste fasi e seguire attentamente le istruzioni fornite con i prodotti per l'estrazione degli acidi nucleici. La metodica di amplificazione real time degli acidi nucleici utilizzata in questo prodotto, a causa della sua elevata sensibilità analitica, è soggetta a contaminazione da parte di campioni clinici positivi per C. trachomatis, dei controlli positivi e degli stessi prodotti della reazione di amplificazione. Le contaminazioni portano a risultati falsi positivi. Le modalità di realizzazione del prodotto sono in grado di limitare le contaminazioni; tuttavia questi fenomeni possono essere evitati solo con una buona pratica delle tecniche di laboratorio e seguendo attentamente le istruzioni fornite in questo manuale. Questo prodotto richiede personale competente e addestrato alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici classificati pericolosi per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e aree di lavoro adeguate alla manipolazione di campioni biologici in grado di trasmettere agenti infettivi e di preparati chimici classificati pericolosi per evitare incidenti con conseguenze potenzialmente gravi per l'utilizzatore o altre persone. Questo prodotto richiede personale competente e addestrato per le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, l'amplificazione e la rilevazione di acidi nucleici, per evitare risultati errati. Questo prodotto richiede aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi. Questo prodotto richiede indumenti di lavoro e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione per evitare risultati falsi positivi. Un risultato negativo ottenuto con questo prodotto indica che il DNA di C. trachomatis non è stato rilevato nel DNA estratto dal campione ma non si può escludere che il DNA di C. trachomatis sia presente ad un titolo inferiore al limite di rilevazione del prodotto (vedi Caratteristiche delle prestazioni a pagina 14); in questo caso il risultato sarebbe un falso negativo. Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, i risultati ottenuti con questo prodotto devono essere interpretati considerando tutti i dati clinici e gli altri esami di laboratorio relativi al paziente. Come per qualunque altro dispositivo diagnostico, esiste un rischio residuo di ottenere risultati non validi, falsi positivi e falsi negativi con questo prodotto. Questo rischio residuo non può essere eliminato o ridotto ulteriormente. Questo rischio residuo in situazioni particolari può contribuire a decisioni errate con conseguenze potenzialmente gravi per il paziente. Sensibilità analitica: limite di rilevazione La sensibilità analitica di questo saggio permette di rilevare la presenza di 0,36 AU di C. trachomatis, corrispondenti a circa 7 molecole di DNA bersaglio, nei 5 µl di DNA estratto aggiunti alla reazione di amplificazione. La sensibilità analitica del saggio, come limite di rilevazione, è stata determinata utilizzando come materiale di riferimento calibrato un pannello di diluizioni di C. trachomatis (sierotipo LGV2) in PBS entro la concentrazione limite (PeliCheck Chlamydia t.-dna-02, AcroMetrix Europe B.V., Paesi Bassi). Ciascun campione del pannello è stato impiegato in 26 o in 13 replicati aggiungendolo a cellule negative per il DNA di C. trachomatis in modo da ottenere una carica di patogeno da AU / estrazione a 0,005 AU / estrazione. Questi campioni sono stati impiegati per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. L'analisi statistica dei dati ottenuti è stata eseguita con la regressione Probit. I limiti di rilevazione sono stati calcolati per le concentrazioni alle quali si ha il 95% e il 50% di probabilità di ottenere un risultato positivo. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Limite di rilevazione con «EXTRAcell» (AU / estrazione) Intervallo di confidenza del 95% valore inferiore valore superiore 95% positività 7,2 AU / estr. 4,6 AU / estr. 14,8 AU / estr. 50% positività 1,5 AU / estr. 1,1 AU / estr. 2,1 AU / estr. Limite di rilevazione con «EXTRAcell» (AU / reazione) Intervallo di confidenza del 95% valore inferiore valore superiore 95% positività 0,36 AU / reaz. 0,23 AU / reaz. 0,74 AU / reaz. 50% positività 0,08 AU / reaz. 0,06 AU / reaz. 0,10 AU / reaz. Sensibilità analitica: intervallo di misurazione lineare La sensibilità analitica di questo saggio, come intervallo di misurazione lineare, permette di quantificare da a 16 molecole di DNA bersaglio nei 5 µl di DNA estratto aggiunti alla reazione di amplificazione. La sensibilità analitica del saggio, come intervallo di misurazione lineare, è stata determinata utilizzando come materiale di riferimento calibrato un pannello di diluizioni (1 log10 tra una diluizione e la successiva) di DNA plasmidico contenente il prodotto di amplificazione la cui concentrazione iniziale è stata misurata spettrofotometricamente. I punti del pannello da 10 7 molecole per reazione a 10 1 molecole per reazione sono stati impiegati in 9 replicati per eseguire l'amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. L'analisi dei dati ottenuti, eseguita con la regressione lineare, ha dimostrato che il saggio presenta una risposta lineare per tutti i punti del pannello (coefficiente di correlazione lineare superiore a 0,99). La sensibilità analitica del saggio, come intervallo di misurazione lineare, è stata verificata utilizzando come materiale di riferimento calibrato un pannello di diluizioni (0,5 log10 tra una diluizione e la successiva) di C. trachomatis (sierotipo LGV2) in PBS entro la concentrazione limite (PeliCheck Chlamydia t.-dna-02, AcroMetrix Europe B.V., Paesi Bassi). Ciascun campione del pannello è stato impiegato in 26 o in 13 replicati aggiungendolo a cellule negative per il DNA di C. trachomatis in modo da ottenere una carica di patogeno da AU / estrazione a 0,005 AU / estrazione. Questi campioni sono stati impiegati per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. L'analisi dei dati ottenuti è stata eseguita con la regressione lineare limitando la retta ai punti che danno il 100% di positività e che originano un coefficiente di correlazione superiore a 0,99. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 13/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 14/20

9 I risultati finali sono riassunti nella tabella seguente. Intervallo lineare di misurazione con «EXTRAcell» Limite inferiore Limite superiore AU / reazione 0, * * Il limite superiore dell'intervallo di misurazione lineare è stato fissato a di copie di plasmide endogeno / reazione, entro un logaritmo dal valore del Q -PCR Standard a concentrazione più alta (10 5 molecole / reazione). Da questo valore è stato calcolato il limite superiore dell'intervallo di misurazione lineare di AU / reazione utilizzando il fattore di conversione riportato a pagina 11. Sensibilità analitica: Precisione Lo studio della precisione del saggio, intesa come variabilità dei risultati ottenuti con diversi replicati di un campione in una stessa sessione, ha permesso di determinare un Coefficiente di Variazione percentuale (CV %) medio del 25,75% all'interno dell'intervallo lineare di misurazione da 10 6 molecole / 5 µl a 10 molecole / 5 µl. La precisione all'interno della sessione è stata determinata utilizzando alcuni dati ottenuti per lo studio dell'intervallo lineare di misurazione. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Coefficiente di Variazione percentuale (CV %) con «EXTRAcell» Valore teorico Valore teorico Media dei risultati Deviazione N replicati AU / estrazione AU / reazione AU / reazione standard CV % ,8 0,61 5,45 45, ,5 2,49 11,17 22, ,0 7,56 56,29 37, ,0 19,29 101,05 26, ,0 59,46 154,49 12, ,0 251,02 531,18 10,58 Sensibilità analitica: Accuratezza Lo studio dell'accuratezza del saggio, come differenza tra la media dei risultati ottenuti in una stessa sessione con diversi replicati di un campione e il valore teorico della concentrazione del campione, ha permesso di determinare un'inaccuratezza percentuale media del 13,23% all'interno dell'intervallo lineare di misurazione da 10 6 molecole / 5 µl a 10 molecole / 5 µl. L'inaccuratezza all'interno della sessione è stata determinata utilizzando alcuni dati ottenuti per lo studio dell'intervallo lineare di misurazione. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Inaccuratezza percentuale (Inacc. %) con «EXTRAcell» Valore teorico Valore teorico Media dei risultati N replicati Inaccuratezza Inacc. % AU / estrazione AU / reazione AU / reazione ,8 0,61 0,20 24, ,5 2,49 0,01 0, ,0 7,56 0,44 5, ,0 19,29 5,71 22, ,0 59,46 20,54 25, ,0 251,02 1,02 0,41 Sensibilità diagnostica: efficienza di rilevazione e quantificazione su diversi genotipi / sottotipi La sensibilità diagnostica del saggio, come efficienza di rilevazione e quantificazione su diversi genotipi / sottotipi, è stata valutata per confronto di sequenze con banche dati nucleotidiche. L'esame delle regioni scelte per l'ibridazione degli oligonucleotidi di innesco dell'amplimix e della sonda fluorescente AmpliPROBE sull'allineamento delle sequenze disponibili in banca dati del plasmide endogeno di C. trachomatis ha dimostrato la loro conservazione e l'assenza di mutazioni significative nei seguenti seriotipi: A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, LGV1, LGV2, LGV3. L'esame delle regioni scelte per l'ibridazione degli oligonucleotidi di innesco dell'amplimix e della sonda fluorescente AmpliPROBE con le sequenze disponibili in banca dati del plasmide endogeno di C. trachomatis soggetto a delezione (Ripa T., Nilsson P., Euro Surveill Nov 9; 11 (11): E ) ha dimostrato che queste regioni non sono coinvolte nella delezione e l'amplificazione può avvenire normalmente. Sensibilità diagnostica: campioni positivi La sensibilità diagnostica del prodotto, come conferma di campioni clinici positivi, è stata valutata eseguendo l'analisi di alcuni campioni clinici positivi per il DNA di C. trachomatis. La sensibilità diagnostica è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento 40 tamponi uretrali e cervicali positivi per il DNA di C. trachomatis (testati con BDProbeTec TM ET, Becton Dickinson France S.A., Francia). Ciascun campione del pannello è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione manuale e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule positive per il DNA di C. trachomatis Le discordanze tra i risultati ottenuti con i prodotti ELITechGroup S.p.A. e quelli ottenuti con il sistema BDProbeTec TM ET possono essere spiegate con la disomogeneità dei campioni cellulari positivi: le cellule positive si distribuiscono casualmente nelle diverse aliquote che possono quindi risultare con un titolo superiore o inferiore al limite di rilevazione del saggio. La sensibilità diagnostica del prodotto su campioni clinici di tamponi uretrali e cervicali è risultata uguale al 92,5%. La sensibilità diagnostica è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento 1 campione clinico di cellule da urine primo getto positivo per il DNA di C. trachomatis (testato con un prodotto CE IVD di amplificazione) e 50 campioni clinici di urine primo getto negativi e positivizzati con materiale di riferimento certificato positivo per il DNA C. trachomatis (QCMD 2008 Chlamydia trachomatis DNA EQA Panel, CTB08, Qnostics Ltd, Scozia, Regno Unito). Ciascun campione è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi: estrazione automatica con i prodotti Diatech pharmacogenetics S.r.L. ed amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule da urine primo getto positive per il DNA di C. trachomatis Cellule da urine primo getto positivizzate per il DNA di C. trachomatis La sensibilità diagnostica del prodotto su campioni clinici di cellule da urine primo getto è risultata superiore al 98,0%. 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10 La sensibilità diagnostica del prodotto è stata valutata analizzando in pool campioni clinici di cellule da urine primo getto positivi per il DNA di C. trachomatis. La sensibilità diagnostica è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento 8 campioni di urine primo getto positivi per il DNA di C. trachomatis (testati singolarmente con un prodotto CE IVD di amplificazione) che sono stati analizzati ciascuno in pool con altri 4 campioni negativi (testati singolarmente con un prodotto CE IVD di amplificazione). I pool sono stati impiegati per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione con i prodotti biomérieux SA ed amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule da pool di urine primo getto positivi per il DNA di C. trachomatis La sensibilità diagnostica del prodotto ha permesso di rilevare correttamente come positivi per il DNA di C. trachomatis tutti i pool analizzati. Specificità diagnostica: campioni negativi La specificità diagnostica del prodotto, come conferma di campioni clinici negativi, è stata verificata eseguendo l'analisi di alcuni campioni cellulari negativi per il DNA di C. trachomatis. La specificità diagnostica è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento 57 tamponi uretrali e cervicali negativi per il DNA di C. trachomatis (testati con BDProbeTec TM ET, Becton Dickinson France S.A., Francia). Ciascun campione del pannello è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione manuale e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule negative per il DNA di C. trachomatis La specificità diagnostica su campioni di tamponi uretrali e cervicali negativi è risultata superiore del 98,2%. La specificità diagnostica del prodotto è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento 50 campioni clinici di cellule da urine primo getto certificati negativi per il DNA di C. trachomatis (testati con un prodotto CE IVD di amplificazione). Ciascun campione è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione automatica con i prodotti Diatech pharmacogenetics S.r.L ed amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule da urine primo getto negative per il DNA di C. trachomatis La specificità diagnostica su campioni di cellule da urine primo getto è risultata superiore al 98,0%. La specificità diagnostica del prodotto, è stata valutata analizzando in pool campioni clinici di cellule da urine primo getto negativi per il DNA di C. trachomatis. La specificità diagnostica è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento 105 campioni di urine primo getto negativi per il DNA di C. trachomatis (testati singolarmente con un prodotto CE IVD di amplificazione) che sono stati analizzati in pool di 5 campioni. I pool sono stati impiegati per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione con i prodotti biomérieux SA ed amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule da pool di urine primo getto negativi per il DNA di C. trachomatis La specificità diagnostica del prodotto nell'analisi sui pool è risultata superiore al 95,2%. Specificità analitica: marcatori potenzialmente interferenti La specificità analitica del saggio, come assenza di crossreattività con altri marcatori potenzialmente interferenti, è stata valutata per confronto di sequenze con banche dati nucleotidiche. L'esame dell'allineamento delle sequenze degli oligonucleotidi di innesco delle AmpliMIX e delle sonde fluorescenti AmpliPROBE con le sequenze disponibili in banca dati di organismi diversi da C. trachomatis, tra cui quelle del plasmide endogeno di Chlamydia muridarum, la Chlamydia più simile alla C. trachomatis, ha dimostrato la loro specificità e l'assenza di omologie significative. La specificità analitica del saggio, come assenza di crossreattività con altri marcatori potenzialmente interferenti, è stata verificata eseguendo l'analisi di alcuni campioni positivi per Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis. La specificità analitica del saggio è stata valutata utilizzando come materiale di riferimento un pannello di tamponi uretrali e cervicali positivi per Ureaplasma urealyticum e Mycoplasma hominis (testati con esame colturale). Questi microrganismi causano infezioni urogenitali come C. trachomatis e si trovano frequentemente negli stessi campioni clinici. Ciascun campione del pannello è stato impiegato per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule positive per Mycoplasma hominis Cellule positive per Ureaplasma urealyticum Robustezza: contaminazione incrociata La robustezza del saggio, come assenza di fenomeni di contaminazione incrociata, è stata verificata analizzando i risultati di sei sessioni in cui campioni negativi per il DNA di C. trachomatis sono stati alternati a campioni fortemente positivi per il DNA di C. trachomatis. L'assenza di contaminazione incrociata è stata valutata utilizzando cellule negative per il DNA di C. trachomatis portate a AU / estrazione con materiale di riferimento calibrato (PeliCheck Chlamydia t.-dna-02, AcroMetrix Europe B.V., Paesi Bassi) e cellule negative per il DNA di C. trachomatis a cui è stato aggiunto del PBS. Sei serie di campioni, alternando a tre campioni positivi tre campioni negativi, sono state impiegate per eseguire l'intera procedura di analisi, estrazione e amplificazione, con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Cellule positive per il DNA di C. trachomatis Cellule negative per il DNA di C. trachomatis Robustezza: tasso globale di errore del sistema La robustezza del saggio, come tasso globale di errore del sistema che porta a risultati falsi negativi, è stata verificata eseguendo l'analisi di un pannello di campioni resi positivi per il DNA di C. trachomatis ad un titolo vicino al limite di rilevazione ed è risultato minore dell'1,75%. Il tasso globale di errore è stato valutato utilizzando come materiale di riferimento un pannello di DNA estratti da campioni di tamponi uretrali e cervicali negativi per il DNA di C. trachomatis (testati con BDProbeTec TM ET, Becton Dickinson France S.A., Francia) portati all'equivalente di 10 AU / estrazione con DNA plasmidico contenente il prodotto di amplificazione. Questi campioni sono stati impiegati per eseguire l'amplificazione con i prodotti ELITechGroup S.p.A. I risultati sono riportati nella tabella seguente. Estratti positivizzati per il DNA di C. trachomatis Nota bene: I dati e i risultati completi delle prove eseguite per la valutazione delle caratteristiche delle prestazioni del prodotto sono registrati nella Sezione 7 del Fascicolo Tecnico di Prodotto "CHLAMYDIA tr. Q - PCR AmpliMIX" e "CHLAMYDIA tr. Q - PCR AmpliPROBE", FTP RTS098. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 17/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 18/20

11 BIBLIOGRAFIA LEGENDA DEI SIMBOLI Østergaard L. et al. (1990) J Clin Microbiol 28: K.S. Sriprakash et al. (1987) Plasmid 18: Tam J. E. et al. (1992) Plasmid 27: Numero di catalogo. PROBLEMI E SOLUZIONI Limite superiore di temperatura. DNA bersaglio non rilevato nella reazione del Positive Control / Q - PCR Standard oppure Coefficiente di correlazione della Curva standard non valido Possibili cause Soluzioni Errore nella preparazione della miscela di Controllare i volumi di reagenti dispensati durante la reazione. preparazione della miscela di reazione. Dispensare con cura le reazioni nella micropiastra seguendo il piano di lavoro. Errore nella dispensazione nella micropiastra. Controllare i volumi di miscela di reazione dispensati. Controllare i volumi di standard dispensati. Degradazione della sonda. Degradazione del controllo positivo o dello standard. Errore nell impostazione dello strumento. Utilizzare una nuova aliquota di sonda. Utilizzare una nuova aliquota di controllo positivo o standard. Controllare la posizione impostata sullo strumento delle reazioni del controllo positivo o degli standard. Controllare il ciclo termico impostato sullo strumento. DNA bersaglio rilevato nella reazione di Controllo negativo Possibili cause Soluzioni Evitare di spargere il contenuto delle provette dei campioni. Cambiare sempre puntale tra un campione e l altro. Errore nella dispensazione nella micropiastra. Dispensare con cura campioni, controllo negativo, controllo positivo e standard nella micropiastra seguendo il piano di lavoro. Controllare la posizione di campioni, controllo negativo, Errore durante l impostazione dello strumento. controllo positivo e standard impostata sullo strumento Micropiastra sigillata male. Contaminazione dell'acqua bidistillata sterile. Contaminazione della mix di amplificazione. Contaminazione dell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. Sigillare con attenzione la micropiastra. Utilizzare una nuova aliquota di acqua sterile. Utilizzare una nuova aliquota di mix di amplificazione. Pulire superfici e strumenti con detergenti acquosi, lavare camici, sostituire provette e puntali in uso CONT Codice del lotto. Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Certificazione rilasciata da KEMA Quality B.V., Paesi Bassi. Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuti. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Fabbricante. Presenza di fluorescenza di fondo irregolare o elevata nelle reazioni Possibili cause Soluzioni Impostare sullo strumento l'intervallo di calcolo della "Baseline" in un ambito di cicli in cui la fluorescenza di fondo sia già stabilizzata (controllare le registrazioni Errore nella impostazione della "baseline". "Results", "Component") e la fluorescenza del segnale non abbia ancora cominciato a crescere, per esempio dal ciclo 9 al ciclo 15. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione e la rilevazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ai prodotti licenziati "Positive Control" o Q - PCR Standard di ELITechGroup S.p.A. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 19/20 SCH mrts098m 28/05/13 Revisione 06 Pag. 20/20

12 PIANO DI LAVORO A B C D E F G H

13 CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS098-P ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura CHLA. tr. AmpliPROBE miscela di sonde fluorescenti marcate con FAM / MGB-NFQ e con VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl Oligonucleotidi fluorescenti, TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerolo, Triton X MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS098-P 0344 SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO pag. 1 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 PROCEDURA pag. 4 BIBLIOGRAFIA pag. 4 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 4 USO PREVISTO Il prodotto «CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE» è parte di un saggio quantitativo di amplificazione degli acidi nucleici per la rilevazione e la quantificazione del DNA di Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) in campioni di DNA estratto da tamponi uretrali, tamponi cervicali, urine primo getto raccolte senza conservanti processate singolarmente o in pool. Il prodotto trova impiego, insieme ai dati clinici e ad altri esami di laboratorio, nella diagnosi e nel monitoraggio dell'infezione da C. trachomatis. DESCRIZIONE DEL PRODOTTO Il prodotto fornisce la miscela di sonde fluorescenti AmpliPROBE per l'amplificazione real time in una soluzione stabilizzante, prealiquotata in quattro provette monouso. Ogni provetta contiene 110 µl di soluzione, sufficiente per 24 test. La sonda per C. trachomatis., marcata con il fluoroforo FAM e bloccata dal gruppo MGB-NFQ, è specifica per la regione codificante la proteina dnab-like del plasmide endogeno. La sonda per il Controllo Interno di idoneità del campione, marcata con il fluoroforo VIC e bloccata dal gruppo MGB-NFQ, è specifica per la regione promotore e 5' UTR del gene umano della beta Globina. La procedura prevede l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time). La standardizzazione del saggio è stata eseguita su strumenti Applied Biosystems della serie Il prodotto consente di effettuare 96 determinazioni, standard e controlli compresi. -20 C - Cappa a flusso laminare. - Guanti senza polvere monouso in lattice o simili. - Miscelatore vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza. ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti per l'estrazione del DNA dai campioni da analizzare, il controllo positivo di estrazione, i reagenti ottimizzati per l'amplificazione, i reagenti di innesco (oligonucleotidi), il controllo positivo di amplificazione o i DNA standard a quantità nota non sono inclusi in questo prodotto. Per l'estrazione manuale del DNA dai campioni da analizzare, si consiglia l impiego del prodotto generico «EXTRAcell» (ELITechGroup S.p.A., codice EXTD02), kit di estrazione del DNA da campioni cellulari. Per l'estrazione automatica del DNA dai campioni da analizzare si consiglia l impiego dei seguenti prodotti generici: «Helix DNA Plus» (Diatech pharmacogenetics S.r.L, codice H8020) kit di estrazione del DNA da campioni biologici e «HES consumable pack red», (Diatech pharmacogenetics S.r.L, codice HESRED-20) consumabili per l'estrazione del DNA con lo strumento «X-tractor Gene» (Diatech pharmacogenetics S.r.L, codice 1820UV). «NucliSENS easymag Reagents» (biomérieux SA, codici , , , , , ), kit di estrazione degli acidi nucleici da campioni biologici con lo strumento «NucliSENS easymag» (biomérieux SA, codice ). Come controllo positivo di estrazione e controllo di inibizione è richiesto l impiego del prodotto generico «CPE-DNA - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., codice CTREXTG), controllo positivo di estrazione di DNA plasmidico per estrazioni del DNA da campioni non cellulari. Per l'allestimento delle reazioni di amplificazione real time è richiesto l impiego del prodotto generico «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (ELITechGroup S.p.A., codice RTS000), miscela di reagenti ottimizzati, micropiastre da 0,2 ml e fogli adesivi per l'amplificazione real time. Nel caso sia previsto l'uso di uno strumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, si consiglia l'impiego del prodotto generico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., codice RTSACC02) micropiastre con pozzetti da 0,1 ml e fogli adesivi per l'amplificazione real time. Per l'allestimento delle reazioni di amplificazione real time è richiesto l impiego del prodotto principale (codice ), oligonucleotidi di innesco per l'amplificazione real time. Nel caso sia richiesta la rilevazione del DNA di C. trachomatis (analisi qualitativa) è richiesto l impiego del prodotto principale «CHLAMYDIA tr. - Positive Control» (ELITechGroup S.p.A., codice CTR098), controllo positivo di amplificazione di DNA plasmidico. Nel caso sia richiesta la rilevazione e quantificazione del DNA di C. trachomatis (analisi quantitativa) è richiesto l impiego del prodotto principale «CHLAMYDIA tr. Q - PCR Standard» (ELITechGroup S.p.A., codice STD098), quattro diluizioni di DNA plasmidico a quantità nota per ottenere la curva standard. SCH mrts098p 28/05/13 Revisione 06 Pag. 1/4 SCH mrts098p 28/05/13 Revisione 06 Pag. 2/4

14 CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS098-P CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE RTS098-P AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un' ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal fabbricante. Non utilizzare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti di altri fabbricanti. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rilevazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rilevazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione/ rilevazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i reagenti Le provette contenenti l'ampliprobe sono monouso e pertanto devono essere utilizzate una volta sola nella preparazione della miscela di reazione. L'AmpliPROBE non presenta frasi di rischio (R) e presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. SCH mrts098p 28/05/13 Revisione 06 Pag. 3/4 PROCEDURA Il prodotto «CHLAMYDIA tr. Q - PCR Alert AmpliPROBE» deve essere utilizzato con i prodotti «Q - PCR Alert AmpliMASTER» e per ottenere la miscela di reazione. L'AmpliPROBE è pronto all'uso, pertanto deve essere utilizzato aggiungendolo direttamente alla miscela di reazione. La procedura completa, che prevede l'allestimento e l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time), è descritta in modo dettagliato nel manuale di istruzioni per l'uso allegato al prodotto. Le caratteristiche delle prestazioni e i limiti della procedura del saggio completo rilevazione e la quantificazione del DNA di C. trachomatis sono descritte in modo dettagliato nel manuale di istruzioni per l'uso allegato al prodotto CONT BIBLIOGRAFIA Østergaard L. et al. (1990) J Clin Microbiol 28: K.S. Sriprakash et al. (1987) Plasmid 18: Tam J. E. et al. (1992) Plasmid 27: Numero di catalogo. Limite superiore di temperatura. Codice del lotto. LEGENDA DEI SIMBOLI Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Certificazione rilasciata da DEKRA Quality B.V., Paesi Bassi. Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuti. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Fabbricante. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione e la rilevazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ai prodotti licenziati "Positive Control" o Q - PCR Standard di ELITechGroup S.p.A. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH mrts098p 28/05/13 Revisione 06 Pag. 4/4

15 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 SOMMARIO USO PREVISTO pag. 1 DESCRIZIONE DEL PRODOTTO pag. 1 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO pag. 2 ALTRI PRODOTTI RICHIESTI pag. 2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI pag. 3 PROCEDURA pag. 4 LEGENDA DEI SIMBOLI pag. 4 USO PREVISTO Il prodotto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» è parte di saggi quantitativi di amplificazione degli acidi nucleici per la ricerca e il dosaggio di un DNA bersaglio con la metodica dell'amplificazione real time in campioni di DNA estratto o di cdna ottenuto per trascrizione inversa da RNA estratto e per la determinazione allelica con la metodica dell'amplificazione real time in campioni di DNA estratto. Il prodotto è un accessorio dei prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX», «Q - PCR Alert AmpliPROBE», «Q - PCR Standard» e «Positive Control» dell ELITechGroup S.p.A. Il prodotto trova impiego nell'allestimento di saggi diagnostici basati sulla metodica dell'amplificazione real time. DESCRIZIONE DEL PRODOTTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Uffici: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com sito WEB: +2 C +8 C Il prodotto nel formato intero (codice RTS000) fornisce la miscela di reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time AmpliMASTER, in una soluzione stabilizzante aliquotata in quattro provette e pronta all'uso, tre Micropiastre per amplificazione da 96 pozzetti e tre Fogli adesivi per amplificazione. Il prodotto nel formato ridotto (codice RTS000/2) fornisce la miscela di reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time AmpliMASTER, in una soluzione stabilizzante aliquotata in due provette e pronta all'uso, due Micropiastre per amplificazione da 96 pozzetti e due Fogli adesivi per amplificazione. La miscela di reagenti fornisce il sistema tampone, il magnesio cloruro, i nucleotidi trifosfati, il fluoroforo ROX di riferimento passivo per la normalizzazione della fluorescenza, l'enzima Uracil-N-glicosidasi (UNG) per l'inattivazione delle contaminazioni da prodotto di amplificazione, l'enzima Taq DNA polimerasi ad attivazione termica (hot start). Il prodotto nel formato intero (codice RTS000) consente di effettuare 96 determinazioni, standard e controlli compresi. Il prodotto nel formato ridotto (codice RTS000/2) consente di effettuare 48 determinazioni, standard e controlli compresi. Prodotto formato intero codice RTS000 MATERIALE INCLUSO NEL PRODOTTO Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura AmpliMASTER miscela di reagenti ottimizzati 4 x 340 µl Amplification microplate micropiastra a 96 pozzetti da 0,2 ml TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerolo, Cloruro di magnesio, Desossiribonucleotidi trifosfati, ROX, Uracil-N-glicosidasi, Taq DNA polimerasi Amplification Sealing Sheet foglio adesivo sigillante Prodotto formato ridotto codice RTS000/2 Componente Descrizione Quantità Composizione Etichettatura AmpliMASTER miscela di reagenti ottimizzati 2 x 340 µl Amplification microplate micropiastra a 96 pozzetti da 0,2 ml TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerolo, Cloruro di magnesio, Desossiribonucleotidi trifosfati, ROX, Uracil-N-glicosidasi, Taq DNA polimerasi Amplification Sealing Sheet foglio adesivo sigillante MATERIALE RICHIESTO NON INCLUSO NEL PRODOTTO - Cappa a flusso laminare. - Guanti monouso senza polvere in lattice o simili. - Miscelatore vortex. - Microcentrifuga da banco ( RPM). - Micropipette e puntali sterili con filtro per aerosol o a dispensazione positiva (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Acqua bidistillata sterile. - Termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time). ALTRI PRODOTTI RICHIESTI I reagenti di innesco (oligonucleotidi), i reagenti di rivelazione (sonde fluorescenti), i DNA standard a quantità nota e i controlli positivi di DNA plasmidico non sono inclusi in questo prodotto. Per eseguire queste fasi analitiche si consiglia l impiego dei seguenti prodotti accessori dell ELITechGroup S.p.A.: serie «Q - PCR Alert AmpliMIX», oligonucleotidi di innesco per l'amplificazione real time. serie «Q - PCR Alert AmpliPROBE», sonde fluorescenti per l'amplificazione real time. serie «Q - PCR Standard», DNA plasmidico a quantità nota per ottenere la curva standard. serie «Positive Control», controllo positivo di DNA plasmidico. - - Nota bene: le Micropiastre per amplificazione non devono essere utilizzate con gli strumenti Applied Biosystems della serie 7000 che montano il blocco termico "FAST". SCH mrts000 28/05/13 Revisione 04 Pag. 1/4 SCH mrts000 28/05/13 Revisione 04 Pag. 2/4

16 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagenti ottimizzati per l'amplificazione real time RTS000 RTS000/2 AVVERTENZE E PRECAUZIONI Questo prodotto è riservato esclusivamente all'uso in vitro. Avvertenze e precauzioni generali Manipolare e smaltire tutti i campioni biologici come se fossero in grado di trasmettere agenti infettivi. Evitare il contatto diretto con i campioni biologici. Evitare di produrre schizzi o aerosol. Il materiale che viene a contatto con i campioni biologici deve essere trattato con ipoclorito di sodio al 3% per almeno 30 minuti oppure trattato in autoclave a 121 C per un' ora prima di essere smaltito. Manipolare e smaltire tutti i reagenti e tutti i materiali usati per effettuare il saggio come se fossero potenzialmente infettivi. Evitare il contatto diretto con i reagenti. Evitare di produrre schizzi o aerosol. I rifiuti devono essere trattati e smaltiti secondo le opportune regole di sicurezza. Il materiale monouso combustibile deve essere incenerito. I rifiuti liquidi contenenti acidi o basi devono essere neutralizzati prima dell'eliminazione. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi / la faccia. Non pipettare a bocca alcuna soluzione. Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree di lavoro. Lavarsi bene le mani dopo avere maneggiato i campioni e i reagenti. Eliminare i reagenti avanzati ed i rifiuti secondo le norme vigenti. Leggere tutte le istruzioni fornite nel prodotto prima di eseguire il saggio. Attenersi alle istruzioni fornite nel prodotto durante l'esecuzione del saggio. Rispettare la data di scadenza del prodotto. Utilizzare solo i reagenti presenti nel prodotto e quelli consigliati dal produttore. Non scambiare reagenti provenienti da lotti diversi. Non utilizzare reagenti provenienti da prodotti di altri produttori. Avvertenze e precauzioni per la biologia molecolare Le procedure di biologia molecolare, come l'estrazione, la trascrizione inversa, l'amplificazione e la rivelazione di acidi nucleici, richiedono personale addestrato per evitare il rischio di risultati errati, in particolare a causa della degradazione degli acidi nucleici dei campioni o della contaminazione dei campioni da parte di prodotti di amplificazione. E' necessario disporre di aree separate per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai introdurre un prodotto di amplificazione nell'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. E' necessario disporre di camici, guanti e strumenti dedicati per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione e per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione. Mai trasferire camici, guanti e strumenti dall'area per l'amplificazione / rivelazione dei prodotti di amplificazione all'area per l'estrazione / allestimento delle reazioni di amplificazione. I campioni devono essere dedicati esclusivamente a questo tipo di analisi. I campioni devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. Provette contenenti campioni diversi non devono mai essere aperte contemporaneamente. Le pipette utilizzate per manipolare i campioni devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I reagenti devono essere manipolati sotto una cappa a flusso laminare. I reagenti necessari per l'amplificazione devono essere preparati in modo da essere utilizzati in una singola sessione. Le pipette utilizzate per manipolare i reagenti devono essere dedicate solo a questo uso. Le pipette devono essere del tipo a dispensazione positiva o utilizzare puntali con filtro per gli aerosol. I puntali utilizzati devono essere sterili, esenti da DNasi ed RNasi, esenti da DNA ed RNA. I prodotti di amplificazione devono essere manipolati in modo da limitarne al massimo la dispersione nell'ambiente per evitare la possibilità di contaminazioni. Le pipette utilizzate per manipolare i prodotti di amplificazione devono essere dedicate solo a questo uso. Avvertenze e precauzioni specifiche per i componenti L'AmpliMASTER non presenta frasi di rischio (R) e presenta i seguenti consigli di prudenza (S): S Non respirare i gas/fumi/vapori/aerosol. Evitare il contatto con gli occhi. PROCEDURA Il prodotto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» deve essere utilizzato con i prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX» e «Q - PCR Alert AmpliPROBE» per ottenere la miscela di reazione. L'AmpliMASTER è pronta all'uso, pertanto deve essere utilizzata direttamente nella preparazione della miscela di reazione. La procedura completa, che prevede l'allestimento e l'esecuzione di una reazione di amplificazione real time in micropiastra con un termostato programmabile con sistema ottico di rilevamento della fluorescenza (thermal cycler per real time), è descritta in modo dettagliato nel manuale di istruzioni per l'uso allegato ai prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX». Le caratteristiche delle prestazioni e i limiti della procedura dei saggi completi di ricerca e dosaggio del DNA bersaglio sono descritte in modo dettagliato nei manuali di istruzioni per l'uso allegati ai prodotti della serie «Q - PCR Alert AmpliMIX». CONT Numero di catalogo. Limiti di temperatura. Codice del lotto. LEGENDA DEI SIMBOLI Da utilizzare prima del (ultimo giorno del mese). Dispositivo medico diagnostico in vitro. Conforme ai requisiti della Direttiva Europea 98\79\CE relativa ai dispositivi medici diagnostici in vitro. Contenuto sufficiente per "N" test. Contenuto. Attenzione, consultare le istruzioni per l uso. Fabbricante. L'acquisto di questo prodotto permette all'acquirente di utilizzarlo per l'amplificazione e la rivelazione di sequenze di acidi nucleici al fine di fornire servizi di diagnostica umana in vitro. Questo diritto è conferito solo se il prodotto fornito è utilizzato insieme ai prodotti licenziati "Positive Control" o Q - PCR Standard dell ELITechGroup S.p.A. Nessun diritto generale o altra licenza di alcun tipo diversa da questo specifico diritto d'uso è conferito per mezzo dell'acquisto. SCH mrts000 28/05/13 Revisione 04 Pag. 3/4 SCH mrts000 28/05/13 Revisione 04 Pag. 4/4