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1 ie~éãçéüáäìëqéëíjéçáìã^ö~ê immtpum oéîkms céääê~áçommt I II III mol`barobaf`lkqoliilafnr^ifqè INTRODUZIONE Haemophilus Test Medium Aar è un terreno aar destinato all uso in test di sensibilità ali antibiotici mediante discodiffusione per Haemophilus spp. PROCEDURA DEL TEST 1. Inoculare i campioni rappresentativi con le colture sotto elencate. a. Preparazione dell inoculo Preparare una sospensione del microranismo in brodo Mueller Hinton o brodo Mueller Hinton II. Correere la sospensione in modo da ottenere 0,1 unità di assorbanza a 625 nm. Questa sospensione conterrà circa 1 4 x 10 8 UFC/mL. b. Entro 15 min dalla correzione della torbidità dell inoculo, immerere un tampone sterile nella sospensione di brodo. Comprimere il tampone ruotandolo varie volte sulla parete interna della provetta, al di sopra del livello del liquido, per rimuovere dal tampone l inoculo in eccesso. c. Inoculare la superficie della piastra strisciando il tampone su di essa. Ripetere questa procedura altre due volte, ruotando oni volta la piastra di 60 radi. d. Coprire la piastra con l apposito coperchio e attendere almeno 3 min ma non più di 15 per consentire l assorbimento dell inoculo, prima di applicare i dischi per i test di sensibilità ali antibiotici Sensi-Disc. e. Usando il dispensatore Sensi-Disc da 6 od 8 posti per piastre da 100 mm e il sistema dispensatore Sensi-Disc Desiner da 12 posti per piastre da 150 mm, posizionare i dischi appropriati sulle rispettive colture. Posizionare al massimo quattro e nove dischi antibiotici su piastre sinole rispettivamente da 100 mm e da 150 mm, inclusi non più di sei dei dischi seuenti: cefalosporine di terza enerazione, aztreonam, imipenem o ciprofloxacina. f. Entro 15 min dall applicazione dei dischi, capovolere le piastre e incubare a 35 ± 2 C in ambiente aerobico arricchito di anidride carbonica al 5%. 2. Esaminare le piastre dopo h e misurare i diametri delle zone complete di inibizione, arrotondando al millimetro. Assumere come endpoint l area che non evidenzia alcuna crescita visibile; inorare la crescita debole di colonie minute rilevabili con difficoltà all estremità della zona di inibizione. Con trimetoprim e sulfonamidi, inorare una crescita modesta (non oltre il 20% del piano di crescita) e misurare il marine più evidente per determinare il diametro della zona. 3. Risultati attesi a. Microranismi per il test * Haemophilus influenzae ATCC * Haemophilus influenzae ATCC Haemophilus influenzae ATCC (per la verifica delle proprietà favorenti la crescita) b. Le dimensioni della zona devono rientrare nei limiti del controllo di qualità per i diametri di zona accettabili per H. influenzae, specificati dal Clinical and Laboratory Standards Institute (ià NCCLS). Tali limiti sono pubblicati nel documento CLSI M100-S17 (M2), incluso nel documento CLSI M2-A9, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 9th ed.; Approved Standard. 1 Venono periodicamente pubblicate tabelle interative, contenenti tabelle aiornate dei dischi di antibiotici e dei criteri di interpretazione. Consultare le tabelle più recenti e seuire le raccomandazioni vienti. Per maiori informazioni, vedere il riquadro nel pararafo RISULTATI nella sezione INFORMAZIONI SUL PRODOTTO. c. La crescita di H. influenzae ATCC deve essere moderata intensa. *Ceppo batterico raccomandato per il controllo di qualità a cura dell utente. CONTROLLO DI QUALITÀ SUPPLEMENTARE 1. Esaminare le piastre come descritto in Deterioramento del prodotto. 2. Eseuire un esame visivo delle piastre rappresentative per arantire che l eventuale presenza di difetti fisici non interferisca con l uso. 3. Determinare il ph mediante potenziometria a temperatura ambiente per verificare che rientri nel rane specificato di 7,3 ± 0,1. 4. Verificare la stabilità delle piastre durante la procedura di inoculo. 5. Incubare a 35 ± 2 C per 72 h le piastre rappresentative non inoculate ed esaminarle per verificare la contaminazione microbica. 1

2 IV V VI fkcloj^wflkfprimolalqql USO PREVISTO Haemophilus Test Medium Aar (HTM Aar) è un terreno aar destinato all uso in test di sensibilità ali antibiotici mediante disco-diffusione per Haemophilus spp. come descritto nella norma Approved Standard M2-A9, pubblicata dal Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). 1 SOMMARIO E SPIEGAZIONE Nel 1966, Bauer, Kirby et al. svilupparono una procedura standardizzata per i test di sensibilità ali antibiotici di comuni batteri a crescita rapida utilizzando come terreno di test l aar Mueller Hinton. 2-4 Questo terreno non è però soddisfacente per microranismi esienti come streptococchi, onococchi ed Haemophilus spp. Il terreno in precedenza raccomandato per Haemophilus influenzae era l aar Mueller Hinton supplementato con emolobina all 1% e IsoVitaleX Enrichment all 1% (aar cioccolato Mueller Hinton). 5 Jorensen et al. condussero studi approfonditi che portarono allo sviluppo di Haemophilus Test Medium (HTM). 6,7 Questo terreno è un aar Mueller Hinton o brodo supplementato con fattore X (emina o ematina), fattore V (nicotinamide-adenin dinucleotide, NAD) ed estratto di lievito. Un importante vantaio dell aar HTM rispetto all aar cioccolato Mueller Hinton è la chiarezza ottica, che consente misurazioni dei diametri di zona dal fondo della piastra come nella procedura di test standard per microranismi non esienti su aar Mueller Hinton. L aar HTM contiene inoltre bassi livelli di timidina ed è pertanto adatto per testare trimetoprim/sulfometoxazolo. I criteri di interpretazione per i test di sensibilità ali antibiotici di Haemophilus sono illustrati nel documento CLSI M100-S17 (M2), 8 a sua volta incluso nel documento CLSI M2-A9, 1 a cui si rimanda per ulteriori dettali. PRINCIPI DELLA PROCEDURA La procedura Bauer-Kirby si basa sulla diffusione in el aar delle sostanze antibiotiche di cui sono imprenati i dischi di carta. A differenza delle prime metodiche che impieavano dischi con concentrazioni di antibiotici basse e alte e la cui interpretazione si basava sulla presenza o assenza di zone di inibizione, questa metodica impiea dischi con una sola concentrazione di antibiotico e i diametri delle zone sono correlati alle concentrazioni minime inibenti (CMI). 1-3,9 La procedura del test prevede la distribuzione di una sospensione standardizzata del microranismo su tutta la superficie del terreno. I dischi di carta imprenati di quantità specifiche di antibiotici o altri aenti antimicrobici venono quindi posti sulla superficie del terreno, dopodiché la piastra viene incubata e si misurano le zone di inibizione intorno a oni disco. Per decidere se la risposta del microranismo all aente è sensibile, resistente o intermedia, i diametri delle zone così ottenuti venono comparati con quelli riportati nel documento CLSI M100-S17 (M2). 8 È stato accertato che i test di sensibilità mediante disco-diffusione sono influenzati da svariati fattori quali il terreno, la profondità dell aar, la potenza del disco, la concentrazione dell inoculo, il ph e la produzione di β-lattamasi da parte dei microranismi da testare. 1,5,9,10 VII REAGENTI Haemophilus Test Medium Aar Formula approssimata* per L di acqua purificata Estratto di carne bovina...2,0 Idrolizzato acido di caseina...17,5 Amido...1,5 Aar...17,0 Estratto di lievito...5,0 Ematina...15,0 Nicotinamide-adenin dinucleotide...15,0 *Compensata e/o corretta per soddisfare i criteri di performance. Avvertenze e precauzioni Per uso dianostico in vitro. Se si riscontra un umidità eccessiva, capovolere il fondo su un coperchio e lasciare asciuare all aria per evitare la formazione di aderenze tra la parte superiore e inferiore della piastra durante l incubazione. Durante tutte le procedure, adottare techniche asettiche e seuire le precauzioni standard control i rischi microbioloici. Dopo l uso, le lastre preparate, i contenitori dei campioni e li altri materiali contaminati devono essere sterilizzati in autoclave prima dello smaltimento. Istruzioni per la conservazione Al ricevimento, conservare le provette al buio a 2 8 C. Evitare conelamento e surriscaldamento. Aprire soltanto al momento dell uso. Ridurre al minimo l esposizione alla luce. Le piastre preparate, conservate nell involucro oriinario a 2 8 C sino al momento dell uso, possono essere inoculate fino alla data di scadenza e incubate per i tempi di incubazione raccomandati. Prima dell inoculo, attendere che il terreno si porti a temperatura ambiente. m m 2

3 Deterioramento del prodotto Non usare le piastre se presentano tracce di contaminazione microbica, alterazione di colore, essiccamento o altri seni di deterioramento. VIII RACCOLTA E TRATTAMENTO DEI CAMPIONI Questo terreno non è destinato all uso diretto con campioni clinici o colture miste. Il test di sensibilità mediante discodiffusione è destinato all uso con colture pure. Sono necessarie una colorazione di Gram e un identificazione presuntiva di Haemophilus. Per informazioni dettaliate sulle procedure di raccolta e trattamento dei campioni, consultare la documentazione appropriata. 11,12 IX PROCEDURA Materiale fornito Haemophilus Test Medium Aar Materiali necessari ma non forniti 1. Brodo per inoculo in provetta in aliquote di 5 ml, come per esempio brodo Mueller Hinton, brodo Mueller Hinton II o soluzione fisioloica allo 0,9% per la preparazione dell inoculo standard. 2. Standard McFarland 0,5 solfato di bario per la correzione dell inoculo (preparato dispensando 0,5 ml di 0,048 M BaCl2 [1,175% peso/vol BaCl2 2 H2O] a 99,5 ml di 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1% vol/vol]). 3. Dispositivo fotometrico per correere la torpidità della sospensione dell inoculo in modo da renderla equivalente allo standard McFarland 0,5. 4. In alternativa ai materiali suddetti (1-3), si può utilizzare il sistema di inoculo BBL Prompt (dispositivo di preparazione volumetrica dell inoculo). 13,14 5. Colture di controllo Haemophilus influenzae ATCC 49247, ATCC e ATCC Dischi di carta imprenati di quantità specifiche di aenti antimicrobici, come per esempio dischi per test di sensibilità BBL Sensi-Disc. 7. Dispositivo di dispensazione dei dischi, come per esempio il dispensatore auto-applicatore da 12 posti Sensi-Disc. 8. Dispositivo per la misurazione o l interpretazione dei diametri di zona con approssimazione al millimetro, come per esempio un calibro a cursore o un reolo. 1 In alternativa, a tale scopo si può utilizzare un set di interpretazione zone Sensi-Disc (n. di cataloo ), costituito da calibri saomati ed etichette di misurazione delle zone. 9. Un reaente o dispositivo per eseuire un test rapido delle β-lattamasi, come per esempio i dischi BBL Cefinase. 10. Un incubatore in rado di produrre un atmosfera contenente CO2 al 5% o un altro dispositivo che produca aerobiosi arricchita di CO Terreni di coltura accessori, reaenti e apparecchiature di laboratorio necessarie. Procedura del test 1. Preparare una colorazione di Gram prima di iniziare i test di sensibilità per confermare la purezza delle colture e l identificazione tentativa di Haemophilus. 2. Usare alcune colonie ben isolate prelevate direttamente da una piastra di aar cioccolato incubata per una notte (preferibilmente h) come fonte di inoculo. 3. Per la rilevazione rapida di ceppi resistenti a penicillina, ampicillina o amoxicillina, usare un test rapido delle β- lattamasi. 4. Preparare una sospensione del microranismo da testare in brodo Mueller Hinton, brodo Mueller Hinton II o soluzione fisioloica allo 0,9%. Con l ausilio di un dispositivo fotometrico, correere questa sospensione per portarne la torbidità allo standard McFarland 0,5. Questa sospensione conterrà circa 1 4 x 10 8 UFC/mL. Prestare attenzione durante la preparazione della sospensione perché concentrazioni di inoculo superiori possono determinare risultati falsamente resistenti con alcuni antibiotici β-lattamici, soprattutto quando si testano ceppi di H. influenzae produttori di β-lattamasi. 1 A intervalli reolari, eseuire diluizioni e conte da piastra delle sospensioni di inoculo per confermare che la metodica di correzione adottata produca un inoculo contenente circa 1 4 x 10 8 UFC/mL. 5. Ai fini dei test di routine, sono risultate accettabili metodiche che impieano dispositivi che consentono la standardizzazione diretta deli inoculi senza correzione della torbidità, come per esempio il sistema di inoculo BBL Prompt, 13 risultato soddisfacente per i test di H. influenzae Entro 15 min dalla correzione della torbidità dell inoculo, immerere un tampone di cotone sterile nell inoculo correttamente diluito ed eliminare il liquido in eccesso facendo ruotare il tampone e premendolo varie volte sulla parte superiore della parete interna della provetta. 7. Inoculare tre volte l intera superficie di una piastra aar, irando oni volta la piastra di 60 per ottenere un inoculo uniforme. Al termine, strisciare con un tampone il delimitare dell aar. 8. Si può lasciare il coperchio socchiuso per 3 5 min, ma non più di 15 min, per permettere l assorbimento di eventuale umidità superficiale, prima di applicare i dischi imprenati di antibiotico. 3

4 9. Applicare i dischi con l ausilio di un dispensatore di dischi di antibiotici, adottando tecniche asettiche. Le zone di inibizione prodotte dalla maior parte deli antibiotici in caso di test di Haemophilus sono più ampie di quelle enerate durante i test di altri microranismi. Di conseuenza, posizionare al massimo quattro e nove dischi antibiotici su piastre sinole rispettivamente da 100 mm e da 150 mm, inclusi non più di sei dei dischi seuenti: cefalosporine di terza enerazione (es. cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, ceftizoxime), aztreonam, imipenem o ciprofloxacina. Una volta posizionati i dischi sull aar, comprimerli con un ao o pinze sterili in modo da realizzare un contatto completato con la superficie del terreno. Questa operazione non è necessaria se i dischi venono depositati usando un dispensatore autoapplicatore da 12 posti Sensi-Disc (li applicatori non scendono dai fori senza cartucce). 10. Entro 15 min dall applicazione dei dischi, capovolere le piastre e incubare per h a 35 C in ambiente aerobico arricchito di anidride carbonica al 5%. 11. Strisciare una piastra di HTM Aar con H. influenzae ATCC e incubare insieme alle piastre dei test di sensibilità per determinare se il terreno supporta una crescita adeuata. Controllo di qualità a cura dell utente Vedere Procedure di controllo di qualità. Includere colture di controllo oni volta che si eseue un test di sensibilità oppure una volta alla settimana nel caso in cui si possano documentare performance soddisfacenti in conformità alle norme CLSI. 1 I diametri di zona corretti sono riportati nel documento M100-S17 (M2). 8 X RISULTATI 1. Esaminare le piastre dopo h di incubazione. Si deve ottenere un piano di crescita confluente. La sola crescita di colonie isolate indica che l inoculo è troppo leero; in tal caso, il test deve essere ripetuto. 2. Con l ausilio di calibri, un reolo o una saoma appositamente predisposti, misurare il diametro delle zone di inibizione completa (valutata a occhio nudo), incluso il diametro del disco, approssimando al millimetro. Tenere il dispositivo di misurazione sul retro della piastra, a sua volta posta su un fondo nero non riflettente e illuminata dall alto. Assumere come endpoint l area che non evidenzia alcuna crescita visibile ad occhio nudo. Inorare la crescita debole di colonie minute rilevabili con difficoltà all estremità della zona di inibizione evidente. Con trimetoprim e sulfonamidi, li antaonisti nel terreno possono consentire qualche modesta crescita; di conseuenza, inorare tale crescita (non oltre il 20% del piano di crescita) e misurare il marine più evidente per determinare il diametro della zona. 3. Per l interpretazione dei risultati ottenuti con isolati clinici di Haemophilus, consultare il documento CLSI M100-S17 (M2). 8 A seconda dei diametri di zona ottenuti, i risultati possono essere referti come resistenti, intermedi o sensibili. NOTA: Venono periodicamente pubblicate tabelle interative del documento CLSI M2-A9, contenenti tabelle aiornate dei dischi di antibiotici e dei criteri di interpretazione. Consultare le tabelle più recenti e seuire le raccomandazioni vienti. Per informazioni sulle pubblicazioni correnti, rivolersi al rappresentante locale di BD. Il documento completo e i supplementi possono essere richiesti al Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA USA. Telefono: +1 (610) I microranismi con test positivo per la produzione di β-lattamasi devono essere considerati ampicillino-resistenti indipendentemente dai diametri di zona ottenuti. Notare che sono stati descritti ceppi ampicillino-resistenti di H. influenzae privi di attività β-lattamasica. 15 Se il diametro di zona indica resistenza ad ampicillina, l isolato deve pertanto essere refertato come resistente a tale antibiotico, anche in caso di test neativo per le β-lattamasi. XI LIMITAZIONI DELLA PROCEDURA Con alcune combinazioni di microranismi-antibiotici, la zona di inibizione può presentare un bordo non chiaramente demarcato e dare luoo a interpretazioni errate. Una concentrazione di inoculo inappropriata può produrre risultati inesatti. Un inoculo troppo intenso può determinare zone di inibizione eccessivamente limitate, mentre un inoculo troppo leero può enerare zone di dimensioni eccessive e difficili da misurare. Posizionare al massimo quattro e nove dischi antibiotici su piastre sinole rispettivamente da 100 mm e da 150 mm, inclusi non più di sei dei dischi seuenti: cefalosporine di terza enerazione (es. cefotaxime, ceftazidime, ceftriaxone, ceftizoxime), aztreonam, imipenem o ciprofloxacina. Una conservazione inappropriata dei dischi di antibiotici può provocare una perdita di potenza e risultati falsamente resistenti. La sensibilità in vitro di un microranismo a un antibiotico specifico non indica necessariamente l efficacia di tale aente in vivo. Per una uida all interpretazione dei risultati, consultare la documentazione appropriata. 5,10 4

5 XII PERFORMANCE A. Studio di riproducibilità 16 Sono stati valutati tre lotti di produzione di HTM Aar, usando la procedura di test di sensibilità con dischi di antibiotici (M2-A4) al momento raccomandata da NCCLS. 17 Nello studio, sono stati complessivamente usati 12 antibiotici (amoxicillina/clavulanato, ampicillina, ampicillina/sulbactam, cefaclor, cefonicid, ceftriaxone, cefuroxime, cloramfenicolo, ciprofloxacina, rifampicina, tetraciclina, trimetoprim/sulfometoxazolo) e 14 ceppi di H. influenzae. Sette dei 14 ceppi erano American Type Culture Collection (ATCC), mentre i sette restanti erano colture stock, comprendenti sei isolati clinici e una coltura per controllo di qualità industriale. I diametri di zona ottenuti con ciascuno dei tre lotti di terreno sono stati comparati con i criteri di interpretazione (Tabella 2A) nel documento M2- A4. 17 In soli sei casi le zone ottenute con un lotto hanno prodotto una cateoria di interpretazione diversa rispetto ali altri due lotti. Delle sei discrepanze, quattro sono state riscontrate con tetraciclina, una con cefaclor e una con cefuroxime. Nel caso della tetraciclina, il risultato ha dato luoo a una cateoria di interpretazione definibile sensibile o intermedia (errore secondario). Con cefaclor e cefuroxime, la differenza di 1 mm riscontrata ha dato luoo a una cateoria definibile intermedia o resistente, anch essa considerabile errore secondario. In questo studio, cinque ceppi di H. influenzae hanno prodotto β-lattamasi. Con ciascuno di tali ceppi, oni lotto di HTM ha prodotto diametri di zona con ampicillina interpretati come resistenti. Due dei cinque ceppi hanno anche prodotto cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT). Le zone di cloramfenicolo ottenute con questi due ceppi sono risultate conruenti con la resistenza al cloramfenicolo. 18,19 B. Comparazione con aar cioccolato Mueller Hinton 16 La procedura su disco NCCLS è stata eseuita con 213 isolati clinici di H. influenzae su HTM Aar e aar cioccolato Mueller Hinton. 17,20 Ampicillina, ampicillina-sulbactam, amoxicillina-clavulanato e cloramfenicolo sono stati li antibiotici testati, essendo questi i soli antibiotici per i quali erano stati definiti i criteri di interpretazione dei diametri di zona con aar cioccolato Mueller Hinton. 21,22 Sono stati ottenuti i seuenti risultati. BBL Haemophilus Test Medium Aar S I R Mueller Hinton S Aar cioccolato I R Concordanza: 99,6% S Sensibile I Intermedio R Resistente Con ampicillina sono stati riscontrati due errori rilevanti e un errore secondario. In entrambi li errori rilevanti, HTM ha prodotto un risultato resistente, mentre l aar cioccolato Mueller Hinton da dato un risultato resistente. Questi isolati sono risultati entrambi β-lattamasi positivi. Il risultato resistente è stato quindi considerato corretto. L unico errore secondario è stato riscontrato con un isolato che ha prodotto un risultato intermedio su HTM Aar e un risultato sensibile su aar cioccolato Mueller Hinton. XIII DISPONIBILITÀ N. di cat. Descrizione BBL Haemophilus Test Medium Aar, confezione da 8 piastre (150 x 15 mm) BBL Haemophilus Test Medium Aar, confezione da 10 piastre (100 x 15 mm) XIV BIBLIOGRAFIA 1. Clinical and Laboratory Standards Institute Approved standard: M2-A9. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 9th ed. CLSI, Wayne, Pa. 2. Bauer, A.W., W.M.M. Kirby, J.C. Sherris, and M. Turck Antibiotic susceptibility testin by a standardized sinle disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45: Ryan, K.J., F.D. Schoenknecht, and W.M.M. Kirby Disc sensitivity testin. Hospital Practice 5: Barry, A.L., F. Garcia, and L.D. Thrupp An improved sinle disk method for testin the antibiotic susceptibility of rapidly rowin pathoens. Am. J. Clin. Pathol. 53: Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach Cumitech 6, New developments in antimicrobial aent susceptibility testin. Coordinatin ed., J.C. Sherris. American Society for Microbioloy, Washinton, D.C. 6. Jorensen, J.H., J.S. Reddin, L.A. Maher, and A.W. Howell Improved medium for antimicrobial susceptibility testin of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25: Jorensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher Antimicrobial susceptibility testin of less commonly isolated Haemophilus species usin Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28: Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI disk diffusion supplemental tables, M100-S17 (M2). CLSI, Wayne, Pa. 9. Ericsson, H.M., and J.C. Sherris Antibiotic sensitivity testin. Report of an international collaborative study. Acta. Pathol. Microbiol. Scand. Suppl. 217: Jorensen, J.H., J.D. Turnide, and J.A. Washinton Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. 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6 15. Doern, G.V., J.H. Jorensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Reddin, and L.A. Maher A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance amon clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Aents Chemother. 32: Data on File, BD Dianostic Systems, Sparks, Md. 17. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. NCCLS, Villanova, Pa. 18. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Aents Chemother. 20: Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert In vitro chloramphenicol susceptibility testin of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25: National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. NCCLS, Villanova, Pa. 21. National Committee for Clinical Laboratory Standards Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testin. NCCLS, Villanova, Pa. 22. Doern, G.V. and R.N. Jones Antimicrobial susceptibility testin of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria onorrhoeae. Antimicrob. Aents Chemother. 32: Becton, Dickinson and Company BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland USA Shannon, County Clare, Ireland Tel: Fax: ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. Prompt is a trademark of 3M. BD, BD Loo, BBL, Cefinase, IsoVitaleX and Sensi-Disc are trademarks of Becton, Dickinson and Company BD 6