GLI ALLERGENI ALIMENTARI E LA SICUREZZA ALIMENTARE

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1 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA GLI ALLERGENI ALIMENTARI E LA SICUREZZA ALIMENTARE S. FRAGASSI, L. DECASTELLI

2 PARLEREMO DI Allergeni e allergie Normativa allergeni alimentari Piano di monitoraggio Regione Piemonte Linee guida Metodi di laboratorio e criticità Progetto di ricerca finalizzata

3 ALLERGIE ALIMENTARI Definizione alimenti allergizzanti Vengono considerati alimenti allergizzanti tutti i cibi che possono essere responsabili di reazioni avverse al nostro organismo, immediate o ritardate, causate sia da un componente naturale presente nell alimento stesso, sia da un componente aggiunto, quali additivi e conservanti.

4 Allergeni e allergie ALLERGIE ALIMENTARI Ipersensibilità di natura immunitaria (IgE) INTOLLERANZE ALIMENTARI Ipersensibilità di natura non allergica Disordini metabolici o stati carenziali

5 ALIMENTI PIU COMUNEMENTE CAUSA DI ALLERGIE ALIMENTARI Il 90% delle allergie è attribuito a: latte vaccino, uova, crostacei, pesce, arachidi, soia, frutta con guscio, cereali

6 PREVENZIONE DELLE ALLERGIE ALIMENTARI L unico modo per prevenire la reazione allergica nei soggetti sensibili è eliminare tali alimenti o componenti dalla dieta o dall ambiente. Il miglior sistema di difesa consiste nel leggere attentamente le informazioni relative agli ingredienti riportate sulle etichette dei prodotti e nel sapere quali sono gli alimenti che scatenano allergie, intolleranze o asma.

7 LEGISLAZIONE Direttiva 2000/13/CE D.Lgs. n. 109 del 27/01/1992 Direttiva 2003/89/CE D.Lgs. n. 114 del 08/02/2006 E sancito l obbligo per i produttori di dichiarare in etichetta tutti gli ingredienti e le sostanze da loro derivate (Tabella 1) abolendo la regola del 25% prevista dalla vecchia Direttiva 2000/13/CE (D. Lgs. N. 109 del 27/01/1992 a livello nazionale), secondo la quale era possibile non indicare i componenti degli ingredienti composti che rappresentavano meno del 25% del prodotto finito e la possibilità di indicare uno degli ingredienti solo con il nome della categoria di appartenenza.

8 segue LEGISLAZIONE Direttiva 2006/142/CE Direttiva 2007/68/CE a) sciroppi di glucosio a base di grano, incluso destrosio; b) maltodestrine a base di grano; c) sciroppi di glucosio a base d'orzo; d) cereali utilizzati per la fabbricazione di distillati o di alcol etilico di origine agricola per liquori ed altre bevande alcoliche Integrazione della lista degli allergeni con lupino e prodotti a base di lupino e con i molluschi e prodotti a base di molluschi Esclusione dal regime degli allergeni (obbligo di dichiarazione in etichetta) di alcuni ingredienti o sostanze alimentari derivati dagli ingredienti di cui all'allegato III bis della direttiva 2000/13/CE, in quanto gli studi effettuati e validati dall EFSA ne hanno evidenziato la non tossicità

9 Tabella 1. Allergeni alimentari che devono essere dichiarati ove presenti (Sezione III, Allegato I della Direttiva 2003/89/CE, previsto dall art. 8 comma 1) Cereali contenenti glutine (cioè frumento, segale, orzo, avena, farro, kamut o i loro ceppi ibridati) e prodotti derivati Crostacei e prodotti derivati Molluschi e prodotti a base di molluschi Uova e prodotti derivati Pesce e prodotti derivati Arachidi e prodotti derivati Soia e prodotti derivati Latte e prodotti derivati (compreso il lattosio) Frutta a guscio cioè mandorle (Amigdalus communis L.), nocciole (Corylus avellana), noci comuni (Juglans regia), noci di acagiù (Anacardium occidentale), noci pecan [Carya illinoiesis (Wangenh) K. Koch], noci del Brasile (Bertholletia excelsa), pistacchi (Pistacia vera), noci del Queensland (Macadamia ternifolia) e prodotti derivati Sedano e prodotti derivati Senape e prodotti derivati Semi di sesamo e prodotti derivati Lupino e prodotti a base di lupino Anidride solforosa e solfiti in concentrazioni superiori a 10 mg/kg o 10 mg/l espressi come SO 2.»

10 Tabella 2. Elenco degli ingredienti temporaneamente esclusi in attesa di verifica del potenziale allergenico da parte dell EFSA Cereali contenenti glutine Uova Pesce Soia Latte Frutta a guscio Sedano Sciroppi di glucosio a base di frumento compreso il destrosio; Maltodestrine a base di frumento; Sciroppi di glucosio a base di orzo; Cereali utilizzati per la distillazione di alcool Lisozima (prodotto da uova) utilizzato come additivo del vino; Albumina (prodotta da uova) utilizzata come chiarificante del vino e del sidro Gelatina di pesce impiegata come supporto per la preparazione di vitamine o di carotenoidi e per gli aromi; Gelatina di pesce utilizzata come choarificante della birra, del sidro e del vino Olio e grasso di soia raffinato; Tocoferoli misti naturali (E 306), tocoferolo D-alfa naturale, tocoferolo acetato D-alfa naturale, tocoferolo succinato D-alfa naturale a base di soia; Olii vegetali derivati da fitosteroli e fitosteroli esteri a base di soia; Estere di stanolo vegetale prodotto da steroli di olio vegetale a base di soia Siero di latte utilizzato nella distillazione per alcool; Lactitolo; Prodotti a base di latte (caseine) utilizzati come chiarificanti del vino e del sidro Frutta a guscio utilizzata nei distillati di alcool; Frutta a guiscio (mandorle e noci) utilizzate (come aromi) in alcool Olio di foglie e di semi di sedano; Oleoresina di sedano Senape Olio di senape; Olio di semi di senape; Oleoresina di semi di senape

11 Gazzetta Ufficiale N. 40 del 18 Febbraio 2010 MINISTERO DELLA SALUTE ORDINANZA 29 gennaio 2010 Misure urgenti in merito alla tutela della salute del consumatore con riguardo al settore della ristorazione Art. 1 1 A chiunque operi nel settore della ristorazione è fatto divieto di detenere e di impiegare additivi e miscele di additivi alimentari per i quali la normativa vigente ha stabilito campi e dosi massime di impiego, fatto salvo l impiego di edulcoranti, a condizione che sia garantita la corretta informazione. 2 La norma CE n. 852/2004 stabilisce i campi e le dosi massime. Art 2 Chiunque operi nel settore della ristorazione deve assicurare la corretta informazione ai consumatori sull aggiunta di additivi e di miscela di additivi.

12 PRISA

13 Campionamento per ricerca proteine Campionamento ufficiale (4 o 5 aliquote) Prelievo eseguito dai Servizi Veterinari Regionali Campioni non conformi: segnalazione e possibilità richiesta analisi di revisione

14 Il Verbale di prelievo

15 L esperienza piemontese Tabella 1 Campioni analizzati per β-lattoglobuline dal 2007 al 2010 categoria alimento N. campioni analizzati per β-lattoglobuline N. campioni non conformi % campioni non conformi Preparazioni di carni ,0 Prodotti a base di carne ,3 Altri prodotti ,9 Totale ,8

16 L esperienza piemontese Tabella 2 Campioni analizzati per ovoproteine dal 2007 al 2010 categoria alimento N. campioni analizzati per ovoproteine N. campioni non conformi % campioni non conformi Preparazioni di carni ,0 Prodotti a base di carne ,2 Altri prodotti ,6 Totale ,8

17 L esperienza piemontese Tabella 3 Campioni analizzati per crostacei e molluschi dal 2008 al 2010 Allergene target N. campioni analizzati N. campioni non conformi % campioni non conformi Crostacei Molluschi Totale

18 Linee guida in bozza Ministero della Salute DIPARTIMENTO PER LA SANITA PUBBLICA VETERINARIA, LA NUTRIZIONE E LA SICUREZZA DEGLI ALIMENTI DIREZIONE GENERALE DELLA SICUREZZA DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE Direttore Dott. Silvio Borrello ALLERGIE ALIMENTARI E SICUREZZA DEL CONSUMATORE

19 Linee guida..considerano ALLERGIA ALIMENTARE: aspetti clinici ed epidemiologici METODI Metodi immunochimici e criticità Metodi di biologia molecolare e criticità Metodi cromatografici e criticità Criteri di validazione ed accettabilità delle metodiche analitiche INFORMAZIONE E FORMAZIONE: CRITICITA

20 I METODI Ricerca di ovoproteine e β-lattoglobulina Metodo qualitativo 1 g di alimento + 20 ml buffer di estrazione Passaggio in Stomaker 10 a 60 C e filtrazione su membrana nitrocellulosa Kit ELISA per ovoproteine Limite di rilevabilità 0,6 mg/kg Kit ELISA per β-lattoglobulina Limite di rilevabilità 0,4 mg/kg

21 VALIDAZIONE DEI METODI Per i metodi ELISA sono state effettuate le prove di validazione secondo la PGS 20AQ021 VALIDAZIONE DEI METODI DI PROVA CHIMICI QUALITATIVI E/O QUANTITATIVI. Nello specifico sono stati considerati i seguenti parametri: SPECIFICITA SENSIBILITA ROBUSTEZZA

22 SPECIFICITA Esecuzione di almeno 20 campioni negativi costituiti da differenti matrici. Sono stati utilizzati prodotti e preparazioni a base di carne, prodotti da forno, prodotti di pasticceria (con esclusione del cioccolato), gelati senza uovo e lattosio. I kit testati si sono dimostrati specifici.

23 SENSIBILITA Esecuzione di almeno 20 campioni positivizzati costituiti da differenti matrici. Sono stati utilizzati prodotti e preparazioni a base di carne, prodotti da forno, prodotti di pasticceria (con esclusione del cioccolato), gelati senza uovo e latte. I kit valutati hanno dimostrato avere una sensibilità del 100% e limiti di rilevabilità molto bassi

24 ROBUSTEZZA Sono state valutate le performance del kit in seguito a: variazioni di temperatura nell ambito di ± 2 C. Variazioni di volume ± 5%. Variazioni dei tempi di incubazione I kit valutati si sono dimostrati robusti, quindi non soggetti a cali di efficienza nei range considerati.

25 LIMITI DELLE METODICHE ELISA Le metodiche di laboratorio per la determinazione di allergeni in alimenti si basano sul principio ELISA, che è diventato il metodo di riferimento ( gold standard ) in questo campo. L inconveniente principale è rappresentato dai possibili errori di interpretazione causati da cross reattività o dall effetto matrice, motivo per cui spesso può essere necessaria una fase preliminare di purificazione e di arricchimento del campione. La validazione è un aspetto fondamentale; nonostante gli sforzi dei produttori di kit, la molteplicità delle matrici consiglia comunque una validazione in-house.

26 I METODI Ricerca di DNA crostacei e molluschi Metodo qualitativo Estrazione del DNA da matrice alimentare Amplificazione DNA e rilevazione in tempo reale REAL TIME PCR Limite di rilevabilità 1 copia genomica di DNA

27 VALIDAZIONE DEI METODI Per le real-time PCR sono state effettuate le prove di validazione secondo la PGS 20PB002 VALIDAZIONE DEI METODI DI PROVA BIOMOLECOLARI PCR-BASED. Nello specifico sono stati considerati i seguenti parametri: SPECIFICITA SENSIBILITA ROBUSTEZZA PRECISIONE

28 PARAMETRI DI VALIDAZIONE PCR RICERCA DNA DI CROSTACEI Specificità: 100% LOD: ng di DNA di crostacei in 100 ng totali (circa 1 copia genomica) Robustezza: ottima Precisione: K=1

29 PARAMETRI DI VALIDAZIONE PCR RICERCA DNA DI MOLLUSCO Specificità: 100% LOD: 0.1 ng di DNA di mollusco in 100 ng totali (circa 6 copie gnomiche) Precisione: K=1

30 LIMITI METODICHE PCR La PCR, come l elisa, presenta alcune difficolta legate alla fase di estrazione per quanto concerne l allontamento degli inibenti dalle matrici e la resa quali/quantitativa di dna da alimenti termizzati e da matirici complesse Inoltre, si verifica una mancata riproducibilita tra kit diversi Mancanza di materiali di riferimento certificati e circuiti interlaboratorio per molluschi e crostacei Necessità di sviluppo e validazione di metodi di conferma (spettrometria di massa)

31 ACCREDITAMENTO Tutte le metodiche attualmente in uso nel laboratorio Controllo Alimenti hanno ottenuto l accreditamento dall ente di certificazione Accredia

32 ASPETTI CRITICI PER LA RICERCA DI ALLERGENI ALIMENTARI Mancanza di limiti di legge per i diversi allergeni nell alimento in relazione alla soglia di tolleranza individuale Presenza di allergeni occulti (non dichiarati) Maggiori problematiche in alimenti ready to eat Mancanza di dati scientifici validati sulle performance dei metodi utilizzati Scarsa uniformità di risultati ottenuti con metodiche differenti Assenza di circuiti inter-laboratorio per alcuni target

33 ATTIVITA DI RICERCA Approvazione di progetto di Ricerca Finalizzata Ministeriale 2008 dal titolo: Messa a punto di dispositivi nanotecnologici (biosensori) per il rilevamento di allergeni in alimenti di origine animale e vegetale

34 LISTA DEI PARTECIPANTI Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta ARNOLFO; Lucia Decastelli Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno LIMONE; Federico Capuano Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'emilia Romagna CINOTTI; Marina Nadia Losio Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie Antonia Ricci Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna DESSALVI; Rosalba Mancuso Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia RIELA; Rita Schiavo Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Lazio e della Toscana Remo Rosati / Romano Zilli Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'umbria e delle Marche Simone Barocci Rete Allergologica Gianni Cadario Ministero della Salute DS VET Ufficio II Istituto Superiore di Sanità GARACI; Giammarioli (Elisabetta Sanzini) ISPA-CNR VISCONTI; Giuffrida Politecnico di Torino Fabrizio Pirri Università degli Studi del Piemonte Orientale (DiSCAFF) CANONICO; Marco Arlorio

35 OBIETTIVI DEL PROGETTO 1 Valutazione delle performance delle metodiche analitiche (ELISA e PCR) per la ricerca di proteine e DNA in differenti matrici alimentari; Scelta delle metodiche efficaci da utilizzare in modo uniforme a livello nazionale; Elaborazione di un sistema di conferma dei metodi di screening per la ricerca di sostanze allergizzanti (spettrometria di massa su proteine di latte e uova); Progettazione e realizzazione di un prototipo innovativo (labon-a-chip basato su sistema a cantilever) che consenta la processazione semi-automatica di un numero elevato di campioni; Comparazione dei risultati ottenuti attraverso l utilizzo delle diverse metodiche di screening (lab-on-a-chip, ELISA, PCR);

36 OBIETTIVI DEL PROGETTO 2 Rendere disponibili e condividere nella rete IIZZSS e ISS metodiche analitiche standardizzate e linee guida per l applicazione dei regolamenti comunitari; Sviluppare una strategia di comunicazione diretta al consumatore, alla società scientifica ed alle istituzioni competenti; Ridurre il rischio all esposizione per i soggetti allergici attraverso la promozione di comportamenti corretti.

37 CONCLUSIONI Scarsa attenzione alle informazioni riportate in etichetta Etichette spesso di difficile comprensione Etichettatura corretta: vanno riportati gli ingredienti con la dicitura contiene oppure con oppure potrebbe contenere tracce di. Nel caso di assenza totale di allergeni è possibile riportare in etichetta una dichiarazione positiva di assenza di allergeni Indispensabile un piano di autocontrollo adeguato Le informazioni al consumatore devono essere trasparenti (presa di coscienza dell OSA) Implementazione e prosecuzione di piani di monitoraggio regionali

38 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE LIGURIA E VALLE D AOSTA S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni

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