Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations

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1 Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations Brian J O Roak1, Pelagia Deriziotis2, Choli Lee1, Laura Vives1, Jerrod J Schwartz1, Santhosh Girirajan1, Emre Karakoc1, Alexandra P MacKenzie1, Sarah B Ng1, Carl Baker1, Mark J Rieder1, Deborah A Nickerson1, Raphael Bernier3, Simon E Fisher2,4, Jay Shendure1 & Evan E Eichler1,5 I disordini dello spettro autistico (ASDs) sono caratterizzati da: dilagante compromissione del linguaggio, della comunicazione e della capacità di socializzazione; interessi ristretti o comportamenti stereotipati. L eziologia dei ASDs ha una forte componente genetica, complicata da una forte eterogeneità di locus. Esistono infatti diverse evidenze a supporto dell ipotesi che la base genetica dei ASDs, inerente ai casi sporadici, differisca molto dai casi di ASDs di famiglie con più soggetti affetti, per cui i primi sembrano essere causati principalmente da mutazioni de novo, mentre i secondi da varianti ereditate. In questo studio gli autori sequenziano l esoma di 20 trii con ASD idiopatico, per testare l ipotesi che le mutazioni de novo, che alterano la funzione di determinate proteine, contribuiscano sostanzialmente allo sviluppo di ASDs sporadici. Questi trii sono stati selezionati in base a: valutazioni cliniche; struttura del pedigree; valutazione dei fenotipi dei famigliari; storia familiare; elevata età dei genitori. Inizialmente, per ogni famiglia, è stato effettuato uno screening tramite acgh. Non sono stati identificati CNVs de novo 250 kb, ma, in una famiglia, è stata identificata una delezione ad eredità materna di circa 350 kb nel cromosoma 15: 15q11.2. Questa delezione è stata associata ad un maggiore rischio di manifestare l epilessia e la schizofrenia, ma non è stata considerata una possibile causa dell autismo. E stato poi svolto il sequenziamento dell esoma di ognuno dei 60 individui considerati. In breve: il DNA genomico, estratto da sangue intero, è stato sottoposto a cattura in soluzione per arricchire il pool di esoni. La libreria di esoni ottenuta è stata sequenziata tramite Illumina Genome Analyzer.

2 La concordanza genotipica, evidenziata utilizzando SNP array, era molto alta (99,7%) e, in media, il 96% dei siti variati nei probandi erano anche visibili nei genitori. Data la rara previsione di veri eventi de novo (< 1per ogni trio), gli autori hanno dedotto che la maggior parte di queste mutazioni de novo, riscontrate nei probandi, altro non erano che falsi positivi. A questo punto i dati ottenuti sono stati filtrati confrontandoli con le varianti osservate in dbsnp database, 1000 Genome Pilote Project e in 1490 esomi sequenziati alla University of Washington. Alla fine viene effettuato il sequenziamento Sanger su meno di 5 varianti per ogni trio, convalidando 18 eventi (mutazioni missenso, sinonime e di splicing) all interno della sequenza codificante e 3 eventi addizionali mappati nelle regioni 3 non trascritte. Viene anche fornita una lista di siti variabili predetti all interno di questi geni, a partire da dati ottenuti dal 1000 Genome Pilot Project, per effettuare una comparazione. Dal confronto con studi precedenti, la percentuale di mutazioni de novo riscontrata all interno delle regioni codificanti (0.9), era più alta di quella attesa (0.591), suggerendo l identificazione della maggior parte degli eventi di mutazionali in questi trii.

3 11 dei 18 eventi di mutazione de novo sono stati predetti alterare la funzione della proteina. E stato utilizzato a questo proposito PolyPhen-2, per predire il possibile impatto funzionale e strutturale di una sostituzione amminoacidica all interno di una sequenza polipeptidica. E stato poi valutato se le mutazioni de novo nel probando erano arricchite di eventi distruttivi, considerando due misure quantitative indipendenti: la natura della sostituzione amminoacidica (Grantham matrix score); il grado di conservazione nell evoluzione a livello di nucleotide (Genome Evolutionary Rate Profiling, GERP). Per il confronto sono stati sequenziati 20 esomi di controllo (HapMap), etnicamente non correlati, applicando questi filtri e sono state quindi identificate le mutazioni nelle sequenze codificanti comuni o specifiche di ogni campione. L ammontare delle varianti nei singoli campioni e nei controlli era molto simile, suggerendo che il contributo di nuovi eventi somatici è comunque minimo. Sono stati determinati, mediante simulazione, i livelli di conservazione attesi GERP e le distribuzioni Grantham per 10 SNVs, comuni o specifici, presi a random. Comparando le varianti de novo, che alterano la funzione della proteina nei 10 probandi ASD, alla distribuzione dei SNVs di controllo, le prime corrispondevano a mutazioni amminoacidiche maggiormente conservate, suggerendo che questi siti di mutazioni de novo sono soggetti ad una più forte selezione e che quindi hanno un impatto maggiore sulla funzione della proteina. E stato identificato un sottogruppo di trii, 4 su 20, con mutazioni de novo potenzialmente causative e con geni già precedentemente associati ad autismo, disabilità intellettiva ed epilessia. Esaminando i dati clinici disponibili per queste 4 famiglie è stato osservato che gli affetti mostravano un IQ molto basso ed una severità della malattia (CSS) molto più alta rispetto a tutti gli altri individui analizzati. In particolare: il probando presenta una sostituzione di una singola base (IVS9-2A>G) nel sito di splicing 3 dell esone 10, all interno del gene GRIN2B, che codifica per il recettore ionotropico del glutammato, N-Metil-D-Aspartato. Studi di espressione e di associazione hanno suggerito che la neurotrasmissione glutaminergica giochi un ruolo importante nei ADSs.

4 Recentemente, uno studio ha descritto GRIN2A e GRIN2B come siti di frequenti mutazioni de novo negli individui con una modesta disabilità intellettiva e/o epilessia, suggerendo che mutazioni a carico di GRIN2B predispongano ad ASD. il probando ha una variante missenso (Pro1894Leu) in una posizione altamente conservata, all interno di SCN1A, che codifica per il canale ionico del sodio, già stato precedentemente associato all epilessia. È stato suggerito come gene candidato per i ASDs, nonostante siano stati condotti pochi screening in ASDs idiopatici. Questo probando presentava anche la delezione 15q11.2 ad eredità materna, che aumenta il rischio di essere affetti da epilessia (aveva infatti l epilessia!). il probando presenta una variante missenso (Asp399Gly) in una posizione altamente conservata, all interno del gene LAMC3 (catena gamma 3 della laminina). Questa mutazione era stata predetta essere funzionalmente deleteria. Le laminine hanno una struttura simile alla neurexina ed alla famiglia di proteine associate con la contactina, entrambe le quali sono state associate a ASDs. Il probando presenta un inserzione di una singola base nel gene FOXP1 che introduce un frameshift e un codone di stop prematuro (Ala339SerfsX4). Recentemente sono state riportate delle vaste delezioni de novo e varianti nonsenso, che distruggono FOXP1, in individui con una moderata disabilità intellettiva e difficoltà di linguaggio con o senza le caratteristiche ASD. FOXP1 codifica per un membro della famiglia forkhead-box dei fattori di trascrizione strettamente correlato al gene FOXP2, implicato in rare forme monogeniche di deficit del linguaggio. Le prove funzionali della formazione dell eterodimero e la sovrapposizione dei pattern di espressione neuronale suggeriscono che FOXP1 e FOXP2 possono co-regolare l espressione genica nel cervello. Inoltre il probando presenta una variante missenso (His275Ala) in una posizione conservata del gene CNTNAP2 (neurexina), la cui predizione è quella di essere funzionalmente deleteria. Questa variante sembra essere estremamente rara o personale, in quanto non è mai risultata nei 942 controlli precedentemente sequenziati, né negli altri 1490 esomi. CNTNAP2 è direttamente downregolato da FOXP2 ed è stato indipendentemente associato ai ASDs ed ai deficit del linguaggio.

5 Per studiare le caratteristiche funzionali dei geni FOXP1 e FOXP2 è stato messo a punto un saggio basato sull utilizzo delle cellule HEK293T. La 293T è una linea cellulare immortalizzata di cellule embrionali renali umane che presentano l antigenet; la linea cellulare, in diversi esperimenti, è stata così trasfettata con vettori di espressione contenenti i geni FOXP1e FOXP2 wt e mutati. E stato così osservato che FOXP1 wt riduce significativamente l espressione di CNTNAP2, mentre la presenza della proteina tronca induce un triplice aumento dell espressione di CNTNAP2. Complessivamente gli autori hanno ipotizzato che la aploinsufficienza, causata dal decadimento mediato da un nonsenso (NMD = meccanismo cellulare di sorveglianza di mrna per scoprire mutazioni non senso e prevenire l espressione di proteine tronche o erronee), insieme alla disfunzione della proteina mutante FOXP1, che sfugge a questo processo, possa risultare in una overespressione della proteina CNTNAP2, amplificando gli effetti deleteri della mutazione nel probando. Anche se il numero dei soggetti analizzati in questo studio pilota è esiguo, di fatto è stato possibile identificare 2 casi in cui è presente un importante mutazione de novo associata ad una potenziale variante ereditabile di rischio (probando 12817: FOXP1 e CNTNAP2, probando 12499: SCN1A e la delezione 15q11.2). Questo suggerisce che in alcune sporadiche famiglie ci possono essere più mutazioni a carico di un singolo probando, che quindi avrà maggiore probabilità di sviluppare ASDs. Tuttavia questa ipotesi è ancora da verificare e sarà necessario estendere l analisi ad un numero maggiore di controlli e di affetti.

6 Gli eventi de novo riscontrati nei geni analizzati, che sono risultati essere distrutti anche nei bambini che non presentano ASDs, ma con comunque disabilità intellettiva o epilessia, evidenzia che questi pathway genetici sono intrinsecamente dipendenti dal contesto sia genetico che ambientale.