I composti fenolici negli alimenti

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Antonietta Baiano Carmela Terracone I composti fenolici negli alimenti Classificazione, distribuzione, metodi di estrazione ed analisi

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Indice 7 Capitolo I I composti fenolici 1.1. Composti fenolici: definizione e funzioni 1.2. Classificazione dei composti fenolici 1.3. Proprietà chimico-fisiche dei composti fenolici 1.4. Attività antiossidante dei composti fenolici 1.5. Metabolismo dei composti fenolici 1.5.1. Biosintesi dei composti fenolici: la via metabolica dell acido scichimico e il metabolismo fenilpropanoidico 1.5.2. Biosintesi dei flavonoidi 1.5.3. Reazioni dei composti fenolici 39 Capitolo II Distribuzione dei composti fenolici nei prodotti agro-alimentari 2.1. Contenuti, distribuzione e biodisponibilità dei composti fenolici negli alimenti 2.2. Cenni relativi all'assorbimento e al metabolismo dei composti fenolici 2.3. I composti fenolici delle olive e degli oli 2.3.1. Aspetti salutistici legati al consumo di olio di oliva 2.3.2. Aspetti sensoriali dell'olio di oliva correlati alla presenza di composti fenolici 2.4. Composti fenolici delle uve e dei vini 2.4.1. Aspetti salutistici dei prodotti vitivinicoli correlabili ai composti fenolici 2.4.2. Aspetti sensoriali correlabili ai composti fenolici di uve e vini 2.5. Composti fenolici della soia e dei derivati della soia 2.5.1. Aspetti salutistici degli isoflavoni della soia 2.6. I composti fenolici dei prodotti ortofrutticoli 91 Capitolo III Metodi di estrazione e di analisi dei composti fenolici 3.1. Metodi di estrazione dei composti fenolici 3.1.1. Estrazione Liquido-Liquido 3.1.2. Estrazione Solido-Liquido 3.1.3. Altri sistemi di estrazione 3.1.4. Estrazione dei composti fenolici dai prodotti olivicolooleari 3.1.5. Estrazione dei composti fenolici dai prodotti viti-vinicoli 5

6 I composti fenolici negli alimenti 3.1.6. Estrazione dei composti fenolici da sfarinati e prodotti di soia 3.1.7. Estrazione dei composti fenolici dai prodotti ortofrutticoli 3.2. Metodi di analisi dei composti fenolici 3.2.1. Analisi dei composti fenolici dei prodotti olivicoli-oleari 3.2.2. Analisi dei composti fenolici dei prodotti viti-vinicoli 3.2.3. Analisi di sfarinati e derivati della soia 3.2.4. Analisi dei composti fenolici dei prodotti ortofrutticoli 123 Capitolo IV Metodi di misura del potere antiossidante 4.1. Metodi di misura del potere antiossidante 4.2. Attività antiossidante di composti fenolici singoli e di estratti fenolici 149 Capitolo V Correlazione tra contenuto fenolico e attività antiossidante 5.1. Correlazione tra tenore fenolico e attività antiossidante 155 Bibliografia

Capitolo I I composti fenolici 1.1. Composti fenolici: definizione e funzioni I composti fenolici rientrano nel gruppo dei composti definiti fitochimici comprendenti un insieme estremamente eterogeneo di sostanze per le quali studi recenti hanno dimostrato un azione protettiva sulla salute umana se assunti a livelli significativi. I composti fenolici sono metaboliti secondari, che differiscono dai metaboliti primari (clorofilla, amminoacidi e carboidrati semplici) in quanto, pur possedendo importanti funzioni ecologiche, non intervengono nei processi di assimilazione, respirazione, trasporto e differenziazione della pianta (Taiz & Zeiger, 2009). Le sostanze fenoliche rappresentano una famiglia numerosa ed eterogenea di circa 10000 molecole, accomunate da una caratteristica chimica comune: si definisce, infatti, fenolica qualunque molecola caratterizzata, almeno in una sua parte, dalla presenza di un nucleo aromatico (l anello benzenico) legato ad uno o più gruppi funzionali ossidrilici (-OH). La grande varietà di strutture fenoliche riflette la diversificazione delle loro funzioni. I composti fenolici possono: proteggere la pianta dagli erbivori e dagli insetti fungendo da repellenti; fungere da schermo nei confronti delle radiazioni UV favoni e flavonoli, due importanti gruppi appartenenti alla classe dei fla- 7

8 I composti fenolici negli alimenti vonoidi e contenuti nei vacuoli delle cellule epidermiche delle foglie, sono in grado di proteggere le cellulle da un eccesso di radiazione UV in quanto in grado di assorbire le radiazioni elettromagnetiche denominate UV-B (280-320 nm), lasciando invece passare le radiazioni del visibile che sono importanti ai fini della fotosintesi (Taiz & Geiger, 2009); fungere da difesa rispetto agli insetti e dalle infezioni indotte dai patogeni microbici ricoprendo il ruolo di antibiotici alcuni composti aventi struttura riconducibile agli isoflavonoidi, altro importante gruppo dei flavonoidi, hanno mostrato attività insetticida. Gli isoflavonoidi rappresentano anche delle fitoalessine ossia composti dotati di attività antimicrobica, prodotti ed accumulati in grande quantità a seguito di infezioni indotte da batteri e funghi allo scopo di arginare l invasione da parte dei patogeni. Il meccanismo di tossicità dei tannini è invece correlato alla capacità di questi composti di inibire gli enzimi extracellulari dei patogeni. Gli stessi tannini rappresentano dei deterrenti nell alimentazione degli insetti; costituire un sostegno meccanico è il caso ad esempio, della lignina, della suberina e di altri costituenti presenti nella parete cellulare; rappresentare dei pigmenti fiorali capaci di attrarre gli impollinatori e gli animali in grado di effettuare la dispersione del frutto i pigmenti delle piante appartengono principalmente ai carotenoidi (terpenoidi) e ai flavonoidi (composti fenolici). Tra i flavonoidi, alle antocianine è attribuibile la maggior parte delle colorazioni rosa, rosso, porpora e blu (Taiz & Geiger, 2009). Diversi impollinatori hanno spesso preferenze diverse per i colori. Oltre alle antocianine, flavoni e flavonoli assorbono a lunghezze d onda minori rispetto alle antocianine e, pur non essendo visibili all occhio umano, lo sono per molti insetti, api comprese. I flavonoli formano nei fiori le cosiddette guide del nettare ossia cerchi concentrici, macchie e strisce che servono a guidare gli insetti verso le posizioni di polline e nettare (Lunau, 1992);

1. I composti fenolici 9 fungere da inibitori di crescita rispetto a piante competitrici che crescono nelle immediate vicinanze della pianta che li produce lo studio degli effetti sulle altre piante dei metaboliti primari e secondari rilasciati da foglie e radici di una pianta si chiama allelopatia. Questi effetti includono l inibizione della germinazione dei semi o della crescita con l obiettivo di eliminare dei competitor per luce, acqua, elementi nutritivi. L acido caffeico e l acido ferulico sono esempi di composti che in laboratorio hanno mostrato attività allelopatica (Inderjit & Dakshini, 1995). Chimicamente, i composti fenolici derivano da idrocarburi aromatici per sostituzione di uno o più atomi di idrogeno con ossidrili e sono paragonabili agli alcooli terziari della serie grassa in quanto, a seguito di ossidazioni, si determinano rotture intramolecolari. Si distinguono in monovalenti, bivalenti, trivalenti e polivalenti: tra i primi è da ricordare il fenolo, detto anche acido fenico, di formula C 6 H 5 OH, in cui un atomo di idrogeno del benzene è sostituito da un gruppo -OH: I composti fenolici subiscono molto facilmente reazioni di sostituzione elettrofila nelle posizioni orto e para che possono mascherare la funzione ossidrilica, come nel caso delle orto-metilazioni. La funzione ossidrilica può essere mascherata, ma anche affiancata da gruppi funzionali, contribuendo a determinare le proprietà chimicofisiche della molecola. Sia i gruppi OH che gli altri sostituenti presenti sulla molecola possono a loro volta formare legami con altre molecole. Le sostanze fenoliche si trovano essenzialmente negli alimenti di origine vegetale (Lattanzio & Ruggiero, 2003), mentre la loro presenza negli alimenti di origine animale è assai meno significativa e, in ogni caso, legata all ingestione di mangimi vegetali da

10 I composti fenolici negli alimenti parte dell animale stesso. Nei prodotti alimentari, i composti fenolici si trovano principalmente sotto forma di glicosidi, ossia legati ad una molecola di zucchero, soprattutto in parti della pianta quali foglie, fiori, frutti e semi. Gli agliconi, ovvero le molecole prive di zucchero, sono invece diffusi soprattutto nei tessuti legnosi e nei semi. Le piante in cui il metabolismo secondario è particolarmente sviluppato sono tendenzialmente più ricche in sostanze antiossidanti (Soldatini, 1997). Gli animali e l uomo hanno tratto vantaggio, durante la loro evoluzione, dalla disponibilità di sostanze presenti negli alimenti e, pertanto, non hanno sviluppato la capacità di sintetizzare in proprio gli antiossidanti diventando, di fatto, dipendenti dal regno vegetale per l assunzione di tali composti. Il contenuto in composti fenolici nei tessuti vegetali varia in funzione della specie, della varietà, dell organo considerato, dello stadio fisiologico, delle condizioni pedoclimatiche e da pianta a pianta all interno di una popolazione. Gli enzimi preposti alla biosintesi dei composti fenolici si differenziano, infatti, in funzione dell organo e dello stadio fisiologico della pianta. All interno di un particolare organo, inoltre, la variazione di attività enzimatica nelle fasi di biosintesi e turnover dei composti fenolici implica la formazione di un gradiente decrescente apice-base secondo il quale varia il tenore in composti fenolici. I composti fenolici si accumulano preferenzialmente negli organi aerei piuttosto che nelle radici e maggiormente negli strati epidermici e sub-epidermici dei vari tessuti della pianta per l effetto induttore della luce sul metabolismo fenolico. La lignina, la sostanza organica più abbondante nelle piante dopo la cellulosa, è l eccezione alla regola, rappresentando l unico composto fenolico che si accumula nelle radici delle piante. È importante sottolineare che a livello subcellulare esiste una distinzione tra sito di accumulo e sito di sintesi dei composti fenolici, quale strategia di detossificazione dei composti fenolici attuata dalla pianta. I fenoli presentano, infatti, una certa reattività nei confronti dei principali costituenti protoplasmatici e, conseguentemente, una potenziale tossicità per la stessa cellula che

1. I composti fenolici 11 li produce. La rigida ripartizione cellulare, così come i processi di coniugazione ed i fenomeni di secrezione, risultano indispensabili nel prevenire la tossicità. La lignina è assente in alghe e funghi, probabilmente perché tali organismi sono privi della parete cellulosica in cui il processo di acilazione della cellulosa precede la formazione della lignina. Alghe e funghi contengono invece fenoli semplici e chinoni (Lattanzio & Ruggiero, 2003). Nei funghi sono presenti solo occasionalmente dei flavonoidi di struttura diversa da quelli comunemente presenti nelle piante. Talvolta, anche nei batteri sono presenti derivati dei composti fenolici. 1.2. Classificazione dei composti fenolici I composti fenolici si distinguono in diverse classi in funzione del numero degli anelli fenolici e degli elementi strutturali che legano tali anelli: 1) fenoli semplici: sono molecole con un solo anello benzenico e contenenti, come sostituenti, solo gruppi ossidrilici (es. fenolo e idrochinone). Si trovano principalmente negli oli essenziali ricavati dalle piante; 2) aldeidi fenoliche: contengono sia il gruppo fenolico che il gruppo aldeidico (es. aldeide p-idrossibenzoica ed aldeide vanillica); 3) acidi fenolici: sono molto diffusi in natura e rappresentano una classe molto studiata. Sono costituenti della lignina e dei tessuti delle piante e, se legati a zuccheri, antocianine o altri fenoli, hanno un importante funzione nella struttura dei tannini. Le uve ed i vini sono ricchi di un particolare gruppo di acidi fenolici rappresentato dagli acidi cinnamici; 4) fenil-ammine: sono una famiglia relativamente piccola ma molto importante che, per la coesistenza nella propria struttura chimica di un gruppo debolmente acido (l ossidrile) e di uno molto basico, hanno natura anfotera. Fanno parte di questo gruppo l adrenalina, la tirosina e la fenilalanina;

12 I composti fenolici negli alimenti 5) fenoli composti: in queste molecole, l anello fenolico è legato ad un altro anello benzenico o ad altri composti eterociclici aventi gruppi funzionali ossidrilici, lattonici e chetonici (es. cumarine e xantoni); 6) flavonoidi: sono sostanze la cui struttura chimica è composta da due anelli benzenici collegati mediante una catena a tre atomi di carbonio costituente un anello eterociclico ossigenato. Le varie classi di flavonoidi differiscono tra loro per la natura di tale anello centrale, la cui struttura varia soprattutto nello stato di ossidazione (i flavonoidi più ossidati sono i flavoni mentre i più ridotti sono le catechine). A questo grande gruppo appartengono molecole molto importanti: le catechine, i calconi, i flavanoni, i flavoni, i flavanonoli, i flavanoli, le leucoantocianidine e le antocianidine; 7) tannini: non sono un ulteriore famiglia di composti fenolici, ma una combinazione di vari tipi di queste sostanze. Ancor oggi una classificazione rigorosa di tale raggruppamento è difficile, pertanto essi sono distinti essenzialmente in idrolizzabili e condensati. Le sostanze fenoliche possono essere distinte in funzione del numero di atomi di carbonio (Lattanzio & Ruggiero, 2003): fenoli semplici e benzochinoni (C 6 ): non sono molto diffusi nei tessuti vegetali. Esempi sono rappresentati da resorcinolo (il più raro), cresolo, guaiacolo, florogucinolo e idrochinone (nella forma monoglucosidica, l arbutina, è il più diffuso). Nei cloroplasti e nei mitocondri delle cellule vegetali sono stati identificati alcuni chinoni: ne è un esempio l ubichinone, coinvolto nelle reazioni del metabolismo primario; acidi fenolici e aldeidi fenoliche (C 6 -C 1 ): gli acidi fenolici sono distribuiti nelle piante principalmente in forma di esteri legati alla lignina. Ne sono esempi gli acidi salicilico, p-idrossibenzoico, protocatecuico, vanillico e siringico. L acido gallico, a differenza dei precedenti, è stato ritrovato soprattutto nelle specie legnose in forma solubile o legato al glucosio (è il caso

1. I composti fenolici 13 dei tannini idrolizzabili). Gli acidi fenolici più importanti sono i seguenti: l acido ellagico, che può ridurre la probabilità di comparsa del cancro al colon e all esofago; inibisce la formazione degli addotti del DNA e potenzia l azione degli enzimi che legano le sostanze cancerogene a molecole che ne favoriscono l escrezione; è presente nel lampone e nella fragola; l acido clorogenico, che è in grado di rigenerare la vitamina E ossidata. Si trova soprattutto in mirtilli, pomodori e nella polpa dell uva insieme all acido ellagico; l acido cinnamico, che è un potente antibatterico, antifungino ed antiparassitario. Si combina con altri flavonoidi e derivati dell acido benzoico per formare tannini e pigmenti che conferiscono il particolare bouquet aromatico e il colore ai vini. È presente soprattutto nella cannella, a cui dà il caratteristico odore e sapore. Gli acidi fenolici, presenti principalmente nei succhi derivanti da alcune tipologie di frutta (ad esempio, mirtillo e melograno), sono in grado di ridurre la capacità di adesione dei batteri ai denti e al tratto urinario dimostrando, pertanto, ottime capacità antibatteriche. È bene, però, sottolineare che i processi di addolcimento a cui vengono sottoposti i succhi derivanti dai frutti contenenti acidi fenolici tendono a ridurre il contenuto fenolico. Gli acidi fenolici si sono dimostrati efficaci anche nella riduzione dell ossidazione del colesterolo LDL e nella prevenzione della formazione di nitrosamine (sostanze prodotte a seguito di diete ricche in nitriti e nitrati). Tra i composti C 6 -C 1 sono da annoverarsi aldeidi quali la salicilaldeide, la p-idrossibenzaldeide, la p-anisaldeide e l aldeide protocatecuica, costituenti comuni di vari oli essenziali. La vanillina (4-idrossi-3- metossibenzaldeide), estratta da baccelli di Vanilla planifolia, risulta essere l aldeide ritrovata più di frequente. acetofenoni e acidi fenilacetici (C 6 -C 2 ): sono composti poco comuni. Appartengono a questa classe il p-idrossiacetofenone, la

14 I composti fenolici negli alimenti xantoxilina e l acido p-idrossifenilacetico, a cui è riconosciuta una discreta attività biologica; acidi idrossicinnamici, fenilpropeni, cumarine, isocumarine, cromoni (C 6 -C 3 ): queste sostanze, raggruppate nella classe dei fenilpropanoidi, sono ampiamente presenti nelle piante e sono caratterizzate dalla presenza di una catena alifatica laterale con tre atomi di carbonio legata all anello aromatico. L acido caffeico e gli acidi p-cumarico, ferulico e sinapico sono gli acidi idrossicinnamici più spesso rinvenuti. L acido caffeico e l acido ferulico, in particolare, si trovano in discrete quantità nel suolo, dove esercitano la loro attività allelopatica, inibendo la germinazione dei semi di altre specie presenti nelle vicinanze (Inderjit & Dakshini, 1995) e la crescita di molte piante. I composti appartenenti a questo gruppo sono presenti soprattutto in forma coniugata, ma è possibile ritrovarli anche in forma libera quando, durante l estrazione dei tessuti vegetali, avviene l idrolisi chimica o enzimatica. In natura, la forma degli acidi idrossicinnamici e dei loro derivati è prevalentemente quella trans (E), che è la forma più stabile. Le forme cis (Z) e trans sono interconvertibili l una nell altra specialmente per effetto delle radiazioni UV. Nei tessuti vegetali le cumarine si trovano soprattutto sotto forma di β-o-d-glucosidi. Sono state rinvenute principalmente l umbelliferone, l esculetina e la scopoletina, che dal punto di vista strutturale corrispondono agli acidi p-cumarico, caffeico e ferulico, essendo le cumarine considerate dei derivati lattonici dell acido 2-idrossicinnamico. Le furanocumarine, una variante strutturalmente più complessa delle cumarine, derivano essenzialmente dall umbelliferone per condensazione con una unità isoprenica (C5) e spesso si presentano con gli -OH fenolici protetti da O-metilazione o da isoprenilazione. La caratteristica fisiologica delle furanocumarine è la capacità di inibire la germinazione dei semi fungendo da inibitori esogeni oppure da agenti allelopatici quando sono rilasciati nel terreno. Le furanocumarine sono composti fototossici (la tossicità

1. I composti fenolici 15 è, cioè, indotta dall esposizione alla luce) largamente presenti in piante appartenenti alla famiglia delle Umbelliferae quali, ad esempio, sedano e prezzemolo. Appartengono alla classe delle cumarine anche le 4-fenilcumarine (classificate come neoflavonoidi) identificate essenzialmente nelle leguminose. In natura sono poco diffusi i cromoni, che rappresentano una forma isomerica delle cumarine e sono caratterizzati dalla presenza di un gruppo metilico od alchilico sul C2 e da gruppi ossidrilici sul C5 e sul C7; naftochinoni (C 6 -C 4 ): sono una classe di pigmenti chinonici, strutturalmente architettati come il naftalene e presenti nei tessuti vegetali in forma ridotta, incolore e legati a molecole di zuccheri. Lo juglone (5-idrossinaftochinone) è presente nei frutti di noce; xantoni (C 6 -C 1 -C 6 ): strutturalmente sono analoghi ai flavonoidi e di solito si presentano nella forma ossigenata come idrossixantoni o metossixantoni. Sono limitatamente presenti nei tessuti vegetali, tanto da essere stati rinvenuti essenzialmente nelle radici, nelle foglie e nel legno di due famiglie di piante superiori, le Gentianaceae e le Guttiferae; stilbeni e antrachinoni (C 6 -C 2 -C 6 ): gli stilbeni sono ampiamente diffusi nelle piante superiori e contengono, nella loro molecola, due anelli benzenici separati da un etano o da un ponte etenico. Agiscono da regolatori di crescita o da fitoalessine (molecole dotate di attività antipatogena). I composti a struttura stilbenica hanno da tempo attratto l attenzione di molti ricercatori per il loro ampio spettro di attività biologiche. Uno degli stilbeni più interessanti ed ampiamente studiato è il resveratrolo, una fitoalessina presente nell uva e in altri prodotti naturali, dotata di attività chemiopreventiva e citotossica nei confronti delle cellule tumorali. Gli stilbeni sono presenti nelle uve come composti prodotti dalla pianta in risposta a stress biotici (attacchi di funghi patogeni) e abiotici (raggi ultravioletti, ferite, metalli pesanti, ozono, ecc.) ed esplicano un attività fungistatica (fitoalessine). Anche nelle foglie e nei fiori della vite si trovano

16 I composti fenolici negli alimenti stilbeni che agiscono come fitoalessine, tuttavia questi organi non sono utilizzati come prodotti alimentari o medicine e, quindi, hanno un basso interesse dal punto di vista dietetico o medico. Gli stilbeni sono presenti anche come composti costitutivi (non indotti da stress) nelle parti legnose della vite (tralci), nelle radici, nei semi e in organi semilegnosi come i raspi. È probabile che siano coinvolti nei meccanismi di resistenza del legno alla decomposizione. Gli antrachinoni sono composti triciclici, isolati da foglie, steli, baccelli, tegumenti ed embrioni di diverse specie appartenenti alle famiglie delle leguminose e delle liliaceae. Sono presenti in molte piante officinali impiegate per le loro proprietà purgative (ad esempio, il rabarbaro); flavonoidi e isoflavonoidi (C 6 -C 3 -C 6 ): rappresentano una delle più vaste classi di composti fenolici e sono ubiquitari nelle piante superiori. La struttura chimica dei flavonoidi o 2-fenil-benzo-α-pironi (Figura 1.1) è costituita da uno scheletro carbonioso di 15 atomi con due anelli aromatici collegati da un ponte a 3 atomi di carbonio: un anello cromonico è, quindi, legato ad un secondo anello aromatico (B), in posizione 2, 3 o 4. Figura 1.1 - Struttura base dei flavonoidi. I flavonoidi, le cui forme principali sono rappresentate in Figura 1.2, possono essere suddivisi in classi in base allo stato di ossidazione dell eterociclo C e alla posizione dell anello B:

1. I composti fenolici 17 anello B in posizione 2: flavanoni, flavoni, flavonoli, antocianine; anello B in posizione 3: isoflavonoidi; anello B in posizione 4: neoflavonoidi. I flavonoidi sono presenti in natura principalmente nella forma glicosilata, cioè legati attraverso i gruppi -OH a molecole di zucchero, che a loro volta possono essere legate ad un sostituente acilico (ad esempio, malonato, p-cumarato, caffeato e ferulato). La classe dei flavonoidi riveste particolare importanza perché, tra le diverse migliaia di strutture fenoliche attualmente identificate, è sicuramente quella più numerosa, comprendente oltre 4000 glicosidi e circa 1800 agliconi. Rientrano nella classe dei flavonoidi 13 tipi di flavonoidi in senso stretto ed almeno 10 tipi di isoflavonoidi. I flavanoidi costituiscono una categoria di sostanze polifunzionali ad elevata bioattività. Essi possiedono proprietà biochimiche di interesse funzionale dal punto di vista nutrizionale e terapeutico. Sono infatti utilizzati come antibiotici, antidiarroici, antiulcera, antinfiammatori e nel trattamento di alcune patologie quali ipertensione, fragilità vascolare, allergie, ipercolesterolemia. In alcune specialità farmaceutiche sono, ad esempio, presenti composti quali rutina ed esperidina. Molti estratti fitoterapici sono preparati a partire dai flavonoidi di piante quali ginkgo biloba, biancospino e vite rossa. Infine, sono molti i flavonoidi contenuti negli alimenti: a titolo Figura 1.2 - Strutture chimiche dei principali flavonoidi. Fonte: Carratù & Sanzini, 2005.

18 I composti fenolici negli alimenti di esempio, la quercetina nel tè, il kemferolo in broccoli e cavoli, la miricetina nell uva e nel mirtillo. Le antocianine sono dei glucosidi aventi lo zucchero legato quasi sempre in posizione 3 e talvolta in altre posizioni. Gli agliconi delle antocianine rappresentano le antocianidine. Il colore delle antocianine dipende dal numero e dalla posizione dei gruppi ossidrilici e metossilici legati all anello B, dalla presenza di metalli quali ferro e alluminio, dal ph del succo vacuolare e dalla eventuale formazione di complessi supramolecolari con ioni metallici chelati e pigmenti flavonici. Le antocianine più diffuse sono la pelargonidina (4 -OH; arancio-rosso), la cianidina (3 -OH; 4 -OH; rosso porpora), la delfinidina (3 -OH; 4 -OH; 5 -OH; blu porpora), la peonidina (3 -OCH 3 ; 4 - OH; rosa scuro), la petunidina (3 -OCH 3 ; 4 -OH; 5 -OCH 3 ; porpora) (Taiz & Geiger, 2009). È stato dimostrato che i flavonoidi svolgono un ruolo importante come cardioprotettori: secondo molti studi, infatti, diete ricche in flavonoidi riducono il rischio di malattie cardiovascolari. Packer et al. (1991) hanno studiato, ad esempio, le attività biologiche del picnogenolo estratto dalla corteccia del pino marittimo francese (Pinus Maritima) e costituito da un miscuglio di flavonoidi (procianidine e acidi fenolici). È stato riportato che il picnogenolo è dotato di attività vasorilassante, attività di inibizione nel convertire l enzima angiotensina e capacità di miglioramento della microcircolazione attraverso l aumento della permeabilità capillare. Sembra anche che essi siano coinvolti in meccanismi di neuroprotezione: frutti ricchi di antocianine rallentano il declino della funzione cognitiva legato all invecchiamento. L attività biologica dei flavonoidi è strettamente influenzata da numero e specifiche posizioni dei gruppi OH e natura dei gruppi funzionali in funzione dei quali questi composti fenolici possono comportarsi come agenti antiossidanti o antinfiammatori o addirittura citotossici e mutageni in vitro o in vivo. La Tabella 1.1 riporta la classificazione dei flavonoidi in sottogruppi con le relative sostanze più rappresentative. La categoria degli isoflavoni ha ricevuto recentemente particolare attenzione per le sue peculiari proprietà. Questi composti fanno parte del gruppo di sostanze vegetali ad attività estrogenica

1. I composti fenolici 19 Tabella 1.1. Suddivisione dei flavonoidi in classi e relativa indicazione delle sostanze più rappresentative. Adattato da Carratù & Sanzini, 2005. Classe Sostanza Alimento Isoflavoni Genisteina Soia Daidzeina Soia Flavoni Rutina Cipolla, mela, uva, broccoli e tè Luteolina Limone, olive e sedano Crisina Buccia della frutta Apigenina Sedano e prezzemolo Esperidina Arance Tangeretina Agrumi Flavonoli Quercetina Tè, cipolle, broccoli, fagioli, cereali, mele e uva Miricetina Uva Kemferolo Indivia, broccoli e tè Antocianine Enina Uva nera e vino rosso Cianidina Uva, lamponi e fragole Delfinidina Melanzane Flavanoli Catechine Mele, tè, vino e cioccolata Epicatechina Uva nera e vino rosso Epigallocatechine Mele, tè, vino e cioccolata Flavanoni Naringinina Buccia degli agrumi Tassifolina Agrumi denominate fitoestrogeni. Essi si trovano in concentrazioni elevate nella soia e in quantità inferiori in molti tipi di frutta, verdura e cereali integrali. Negli alimenti di origine vegetale sono presenti i fitoestrogeni precursori delle forme attive che, dopo la loro ingestione, devono essere metabolizzati ed attivati da parte della flora batterica intestinale per essere assorbiti e risultare biologicamente attivi (Uzzan et al., 2004). Le evidenze epidemiologiche e sperimentali sugli effetti benefici degli isoflavoni si riferiscono soprattutto alle seguenti condizioni: patologie cardiovascolari, iper-

20 I composti fenolici negli alimenti colestorolemia, sindrome premestruale, menopausa, osteoporosi e neoplasie. Le sostanze fenoliche possono essere presenti in forma monomerica, dimerica, oligomerica e polimerica. Alle classi fenoliche descritte fino ad ora, si aggiungono dunque le forme che vanno da dimeri a grandi oligomeri: lignani e neolignani (C 6 -C 3 ) 2 : i lignani sono un ampio gruppo di metaboliti secondari delle piante costituti da unità fenilpropanoidiche. Nelle piante edibili sono presenti come glucosidi strettamente associati ai costituenti della fibra; nelle parti legnose sono principalmente presenti come agliconi. I semi di lino sono ricchi di lignani. Esplicano attività antibatterica, antifungina e antitumorale (particolarmente nei confronti del tumore al colon e al seno). I lignani aiutano l organismo femminile ad utilizzare gli estrogeni. Nelle donne in età fertile con livelli elevati di estrogeni, i lignani possono prevenirne il sovraccarico e, di conseguenza, lo sviluppo dei tumori indotto dagli estrogeni. Nelle donne in menopausa, i lignani agiscono come gli estrogeni prevenendo la perdita di materiale osseo; biflavonoidi (C 6 -C 3 -C 6 ) 2 : ne sono esempi l amentoflavone e la ginkgetina; e le forme polimeriche: lignine (C 6 -C 3 ) n : il nome deriva dal termine latino lignum, che significa legno, per il contributo che questi polimeri danno alla parete cellulare di tutte le piante vascolari, incluse le specie erbacee, come costituenti della parete cellulare associata alla matrice cellulosica tramite ponti idrogeno o legami covalenti. Questa polimero fenolico costituisce sia un metabolita primario che secondario. Potenzialmente, tutte le cellule vegetali sono in grado di produrre lignina in risposta a situazioni di stress biotico od abiotico, ma essa si accumula principalmente nei tessuti di sostegno o con-

1. I composti fenolici 21 duttori, come le tracheidi ed i vasi xilematici. La capacità delle piante di formare lignina è considerata un fattore determinante nel processo di adattamento delle piante all habitat terrestre. La caratteristica principale della lignina è la rigidità meccanica dalla quale dipende il rafforzamento dei fusti e dei tessuti vascolari che consentono la crescita verso l alto e permettono all acqua e agli elementi minerali di essere trasportati attraverso lo xilema senza il collasso dei tessuti anche in presenza di pressioni negative. La sua durezza ne riduce l appetibilità per gli animali. Essa risulta inoltre relativamente indigeribile per gli erbivori. A livello subcellulare, la lignina è depositata nella parete cellulare, contrariamente agli altri composti fenolici che sono immagazzinati nel vacuolo; catecolmelanine (C 6 ) n : le melanine sono dei pigmenti scuri che si formano in seguito a polimerizzazione ossidativa di substrati orto-difenolici e sono generalmente presenti in forma combinata con proteine; tannini condensati (C 6 -C 3 -C 6 ) n : sono polimeri che fanno capo a due sottogruppi, distinti per le loro caratteristiche strutturali: polimeri dell unità base dei flavonoidi, il flavan-3-olo, normalmente non associati a zuccheri (tannini condensati o proantocianidine); frequenti nelle piante legnose; polimeri eterogenei contenenti acidi fenolici e zuccheri semplici, più piccoli dei tannini condensati, che liberano zuccheri (normalmente D-glucosio) per idrolisi acida, basica o, in alcuni casi, enzimatica (tannini idrolizzabili). I tannini sono polimeri fenolici vegetali con proprietà difensive, efficaci come repellenti nei confronti di predatori e parassiti, tanto da essere considerate tossine generiche. Infatti, grazie alla proprietà dell astringenza (capacità di far precipitare le proteine salivari), rendono i tessuti vegetali sgradevoli per gli animali. Questo meccanismo difende la pianta dall invasione da parte di organismi parassiti. I frutti immaturi, ad esempio, hanno solitamente un elevato con-

22 I composti fenolici negli alimenti tenuto di tannini, fattore deterrente fino a quando il frutto non è maturo. Altro polimero fenolico indispensabile per le piante è sicuramente la suberina che, legandosi alle pareti cellulari del periderma, funge da barriera nei confronti dell acqua e di vari soluti. La formazione della suberina è spesso indotta da ferite provocate nei tessuti vegetali a causa di attacchi fungini o danni meccanici. 1.3. Proprietà chimico-fisiche dei composti fenolici I fenoli, come gli alcoli, possono trasformarsi in esteri, in quanto il gruppo ossidrilico reagisce con le anidridi ed i cloruri degli acidi, oppure possono trasformarsi in eteri per reazione dei corrispondenti fenossidi (buoni nucleofili) con alogenuri o solfati alchilici (Russo et al., 1998). Natura acida. La presenza di gruppi OH, come per gli alcoli, influisce notevolmente sulle proprietà chimico-fisiche dei composti fenolici, in particolare aumentandone il carattere idrofilico e conferendo loro una natura acida. Tale natura acida si spiega con la delocalizzazione per risonanza (Figura 1.3) della carica negativa, che nello ione fenossido è suddivisa su quattro atomi, con l effetto di stabilizzare la struttura. Tuttavia, a differenza degli alcoli alifatici (pka~14), una soluzione acquosa di un composto fenolico presenta solo una debole acidità (pka ~10) e quindi una debole dissociazione in anione fenos- Figura 1.3 - Stabilizzazione per risonanza dello ione fenossido. Fonte: William H. Brown. Chimica Organica.

1. I composti fenolici 23 sido ed H + (Lattanzio & Ruggiero, 2003). L acidità dei fenoli varia inoltre in funzione dei sostituenti e della loro posizione nella struttura. Solubilità. Come risultato della contrapposizione tra la tendenza idrofila del gruppo ossidrilico e quella idrofoba dell anello idrocarburico aromatico, i fenoli sono solo moderatamente solubili in acqua (Russo et al., 1998). I fenoli si sciolgono completamente nelle soluzioni acquose di idrossido di sodio perchè si trasformano in sali (fenossido di sodio) grazie alla loro acidità e possono essere solubili in acqua se si trovano nella forma glucosidica. Per gli agliconi la solubilità in acqua migliora proporzionalmente all aumentare del numero di ossidrili presenti sull anello benzenico. I composti fenolici con pochi gruppi ossidrilici sono solubili in metanolo, etanolo, cloroformio, etere ed etilacetato. I fenoli aventi catene alifatiche laterali sono solubili in solventi poco polari. Reattività dei composti fenolici. I gruppi ossidrilici dei composti fenolici possono formare legami idrogeno intramolecolari o con altre molecole quali proteine ed alcaloidi, dando luogo ad aggregati polimolecolari. Per questo motivo, i punti di ebollizione e di fusione sono molto più alti di quelli degli idrocarburi aventi lo stesso peso molecolare (Russo et al., 1998). Le reazioni tra i composti fenolici e le proteine possono essere irreversibili se sono di tipo ossidativo o reversibili se portano alla formazione di legami idrogeno, in cui sembra sia coinvolto il gruppo carbonilico come accettore di idrogeno dalla molecola fenolica. Nel caso dei tannini, si possono formare deboli legami ionici tra i gruppi anionici della molecola fenolica e i gruppi cationici della struttura proteica. Nel caso dei complessi tannini-proteine, un ruolo importante è svolto dai legami ammidici e peptidici (Lattanzio & Ruggiero, 2003). I chinoni reagiscono con le proteine più rapidamente delle forme ridotte e con un meccanismo non enzimatico, portando alla formazione di legami più stabili; i chinoni possono, infatti, subire un attacco nucleofilo (da parte di molecole che posseggono gruppi amminici, tiolici o gruppi metilinici attivati) o essere ridotti. Le reazioni tra composti fenolici/chinoni e proteine hanno un ruolo biologico fondamentale perchè coinvolte nell inibizione o

24 I composti fenolici negli alimenti attivazione di enzimi, nei meccanismi che permettono alle piante di opporre resistenza agli attacchi microbici, nel metabolismo postraccolta dei prodotti ortofrutticoli. I composti fenolici e i corrispondenti chinoni intervengono anche nella respirazione cellulare. I chinoni, in particolare, trasformandosi in semichinoni riescono ad interferire con il flusso elettronico nella catena respiratoria, fungendo da accettori di elettroni dalle flavoproteine ridotte e interrompendo, così, il flusso di equivalenti riducenti verso il sistema dei citocromi. I gruppi fenolici, quelli ortodifenolici in particolare, sono estremamente suscettibili a reazioni di ossidazione che, nei sistemi biologici, sono catalizzate dalle polifenolissidasi. Le reazioni di ossidazione dei fenoli seguono un meccanismo radicalico che, passando per il radicale fenossido, stabile per risonanza, porta alla produzione di chinoni, quali prodotti finali della reazione ossidativa. I chinoni sono dotati di proprietà antimicrobiche, hanno la capacità di inibire gli enzimi formando legami non specifici o reagendo con i rispettivi substrati o cofattori e di precipitare alcune proteine. È proprio l abilità di reagire con enzimi e proteine che rende i chinoni capaci di inibire la fosforilazione e di conseguenza l attività catalitica. I chinoni possono polimerizzare dando luogo alle melanine. Oltre ai sopra descritti aspetti positivi, le reazioni di ossidazione dei composti fenolici comportano anche modifiche negative sul prodotto. A titolo esemplificativo, esse inducono modifiche del sapore e del colore: i chinoni sono infatti più colorati dei rispettivi fenoli e quasi sempre presentano una colorazione bruna, gradita solo in certi prodotti (è il caso del cacao, del caffè, del tè e dei datteri) ma assolutamente indesiderato in altri (frutta e verdura). La variazione di colore causata da reazioni ossidative è conosciuta come imbrunimento enzimatico, che è accelerato da lesioni e microlesioni del tessuto vegetale che, determinando la rottura delle cellule vegetali, inducono la fuoriuscita delle sostanze fenoliche dal loro sito di accumulo, i vacuoli, e il conseguente contatto con l ossigeno e con gli enzimi ossidanti, dando inizio alle reazioni ossidative. Il successivo paragrafo è dedicato alle proprietà antiossidanti dei composti fenolici.