Replicazione e genetica virale

Replicazione e genetica virale Replicazione virale scaricato da www.sunhope.it 1

L infezione avviene attraverso tre fasi: 1) fase primaria che comprende: adsorbimento: ancoraggio del virione a specifici recettori sulla superficie i cellullare per mezzo di siti i stereochimicamente complementari (detti "antirecettori"). Richiede solo una partecipazione passiva della cellula; penetrazione: nel caso dei virus batterici interessa solo l acido nucleico genomico (ed alcune proteine interne), mentre nel caso dei virus dei vertebrati questo fenomeno implica sempre la partecipazione di tutto il virione; scapsulamento: esposizione dell acido nucleico virale, che nei virus batterici é contemporaneo alla penetrazione, mentre nei virus dei vertebrati avviene successivamente. Tre differenti strategie per lo svestimento (uncoating) dei virioni scaricato da www.sunhope.it 2

2) fase replicativa che comprende: - sintesi degli acidi nucleici virali; - sintesi dell RNA messaggero; - sintesi delle proteine virali. 3) fase di rilascio che comprende assemblaggio con un processo morfogenetico dei vari componenti virali neosintetizzati; maturazione: : fuoriuscita it dei virioni i della progenie all esterno della cellula ospite (a seconda dei virus può avvenire con la lisi della cellula oppure per gemmazione dalla membrana citoplasmatica, cioé in modo non traumatico per la cellula). Subito dopo, o contemporaneamente alla penetrazione, inizia la cosiddetta "fase di eclisse" che dura per un periodo che va da minuti a ore, a seconda del tipo di virus. In questa fase i virioni, perdendo la loro integrità strutturale, sembrano scomparire alle comuni indagini immunologiche e virologiche. Queste proprietà, tipiche dei virioni completi, ricompaiono solo in presenza della progenie virale, che può essere dimostrata anche prima della liberazione dalla cellula infettata. scaricato da www.sunhope.it 3

Genomi Virali. I genomi virali variano in grandezza da circa 3,500 nucleotidi (nt) e.s. batteriophago della famiglia Leviviridae (MS2) a circa 280 coppie di kilobasi (kbp) e.s. la famiglia Herpesviridae (CMV) Il genoma dei virus (1) 30% dei virus animali ha un genoma a DNA 5-300 kb 3 100 proteine L acido nucleico di tutti i virus a DNA, eccetto i Parvovirus, è a doppio filamento (ma il DNA degli Hepadnavirus è parzialmente a singolo filamento quando non è in fase di replicazione) scaricato da www.sunhope.it 4

Il genoma dei virus (2) 70% dei virus animali ha un genoma ad RNA 7 30 kb 4 18 proteine Sempre a singolo filamento, tranne nei Reovirus Genomi virali. I genomi a RNA sono più piccoli: massimo 30Kb. Perchè? Le RNA polimerasi virali sono prone all errore se paragonate alle DNA polimerasi. La fedeltà di replicazione potrebbe limitarne la taglia. I genomi a DNA? Fino a 300kb Il tipo di genoma e la sua grandezza dettano I vari step della replicazione virale. scaricato da www.sunhope.it 5

31/08/2009 Organizzazione dei Genomi Genomi molto condensati Un infinità ità di strategie t per massimizzare i la capacità codificante Differenti strategie per codificare proteine nei genomi virali scaricato da www.sunhope.it 6

Differenti strategie per codificare proteine nei genomi virali Differenti strategie per codificare proteine nei genomi virali scaricato da www.sunhope.it 7

Differenti strategie per codificare proteine nei genomi virali Diagramma schematico delle diverse strade che i virus devono seguire per giungere alla sintesi dei propri RNA-messaggeri specifici scaricato da www.sunhope.it 8

Tutti i virus sono parassiti del sistema di traduzione dell RNA messaggero delle cellule Classificazione di Baltimore scaricato da www.sunhope.it 9

Classe I La prima classe comprende i virus a DNA bicatenario, cioé la quasi totalitàt dei virus a DNA. In questo casola sintesi i di mrna virale può essere realizzata dalla RNA-polimerasi della cellula ospite, che ha sede nel nucleo, come avviene per Herpesvirus, Adenovirus e Papovavirus. Questi generi costituiscono la sottoclasse 1 a esvolgono la maggior parte degli eventi replicativi nel nucleo della cellula. Gli altri virus, con genoma a DNA bicatenario, come i Poxvirus e gli Iridovirus, possiedono una propria RNA-polimerasi associata al virione, che consente loro di replicarsi a livello del citoplasma. Questi costituiscono la sottoclasse 1 b. Strategie replicative dei genomi Genomi a doppio filamento di DNA (dsdna) Classe I 2 fasi: early e late RNApol cellulare scaricato da www.sunhope.it 10

Virus con genomi a DNA (ss/dsdna) che usano un passaggio intermedio a singolo filamento di RNA (ssrna) DNApol virale nel virione RNApol cellulare Transcriptasi inversa virale Classe II La seconda classe comprende i virus con genoma a DNA a singolo filamento positivo (+) come i Parvovirus. La replicazione avviene nel nucleo e prevede la sintesi del filamento complementare del DNA; la doppia elica di DNA viene poi usata come stampo per la sintesi degli RNA messaggeri e dei nuovi genomi virali. A differenza dei virus a DNA a doppia elica, quelli a filamento singolo codificano soltanto le proteine del capside. Essi si affidano ai sistemi cellulari per ciò che concerne la loro replicazione e trascrizione. scaricato da www.sunhope.it 11

Herpesviridae Penetrazione per fusione dell envelope con la membrana citoplasmatica. I recettori cellulari sono rappresentati dall eparano solfato che si lega a gc, in seguito un legame più stabile viene fornito dal legame di gd con diversi recettori (a seconda del tipo di cellula) che appartengono alla famiglia del TNF. La fusione avviene a ph neutro sulla superficie della cellula mediante interazione con le proteine gh/gl e gb. Dal tegumento si liberano due proteine strutturali: 1) VHS (Virino Host Shut-off protein) che inibisce la sintesi delle proteine cellulari, 2) α-tif (α-gene Trans Inducine Factor) che serve ad avviare la prima fase della trascrizione del DNA una volta che questo è stato portato, ancora all interno del capside, a livello del nucleo e qui rilasciato. La trascrizione del DNA in RNAm avviene nel nucleo, in tre fasi distinte, con produzione di RNAm (e proteine) di tipo α (immediate early), β (early) e γ (late). L estressione di questi 3 gruppi di geni è finemente controllata da una serie di meccanismi a feedback. Le proteine α attivano la trascrizione dei geni β e contemporaneamente regolano la propria espressione. Le proteine α e β, insieme i sono in grado di regolare l espressione dei geni g. Il ciclo è completato t dalla sintesi delle proteine g, alcune delle quali bloccano l ulteriore sintesi di proteine α e β. La maggior parte dei prodotti dei geni β sono coinvolti nella replicazione del DNA virale (DNA polimerasi, elicasi/primasi, timidino-chinasi, etc). Questi enzimi rendono la replicazione del virus del tutto indipendente dall attività degli enzimi cellulari. L acido nucleico sembra replicarsi con un meccanismo a circolo rotante, che prevede la circolarizzazione del DNA ed è caratterizzato dalla formazione di concatameri, lunghe molecole di dsdna costituite dall insieme di monomeri di lunghezza gnomica. La processazione dei concatameri e la formazione dei genomi virali avvengono al momento dell inserzione del DNA nei capsidi in via di formazione. La maggior parte delle proteine γ sono componenti strutturali che, una volta prodotti nel citoplasma,, rientrano nel nucleo, dove si assemblano. L acquisizione dell envelope avviene adurante la fuoriuscita del capside dal nucleo: acquisizione dalla membrana interna del nucleo, vestimento in seguito a fusione con la membrana esterna del nucleo e acquisizione finale nell apparato del Golgi. Genomi a singolo filamento di DNA (ssdna), tipici dei piccoli genomi. Classe II RNApol cellulare DNApol cellulare scaricato da www.sunhope.it 12

Classe III La terza classe comprende i virus con genoma ad RNA bicatenario (es. Reovirus). Il genoma di questi virus è suddiviso in 10-12 segmenti contenuti in un doppio capside isometrico. Ogni segmento è detto "minicromosoma", perché é trascritto separatamente e dà luogo ad un singolo RNA messaggero monocistronico. Poiché non esistono enzimi cellulari per la trascrizione diretta di RNA in RNA, sono necessari enzimi virali associati ai virioni che, dopo la penetrazione e lo scapsulamento trascrivono il filamento genomico negativo (-) per produrre mrna. Genomi a doppio filamento di RNA (dsrna) Classe III Più piccoli dei genomi a DNA. Tutti i virus a dsrna hanno un genoma costituito da 2 a 12 molecole diverse di RNA ( genoma segmentato ). RNApol virale associata al capside scaricato da www.sunhope.it 13

Genomi a singolo filamento di RNA (ssrna) Possono essere divisi in 2 gruppi: quelli che funzionano come l mrna (senso positivo) Picorna, Calici, Corona, Flavi, Togaviridae. quelli che sono complementari all mrna prodotto da loro stessi (senso negativo) Orthomyxo, Paramyxo, Rhabdo, Filoviridae. Polarità positiva AUGGCACGA met-ala-arg arg Polarità negativa UACCGUGCU scaricato da www.sunhope.it 14

Classe IV La quarta classe comprende i virus con genoma ad RNA a singolo filamento positivo(+). Di questa classe fanno parte i Poliovirus, i Picornavirus e il virus dell epatite epatite A (sottoclasse IVa). All estremitá 3 il genoma é poliadenilato mentre all estremitá 5 é legato covalentemente ad una piccola molecola proteica. Dopo lo scapsidamento, questa proteina viene rimossa da una proteasi cellulare ed il genoma può quindi legarsi ai ribosomi e funzionare come RNA messaggero. La trascrizione origina un unica proteina, corrispondente alla capacità codificativa totale del virus. Questa molecola proteica viene detta "poliproteina", perchè in seguito a tagli operati da proteasi cellulari vengono generate diverse proteine funzionali più piccole. Una di queste è l RNA-polimerasi RNA-dipendente, nt necessaria a per la replicazione del genoma, che avviene all interno di un "complesso replicativo". Viene sintetizzato un filamento ad RNA negativo(-) che funziona da stampo. Alla sottoclasse IVb appartengono i Togavirus che necessitano di due o più cicli di traduzione per produrre l RNA genomico. Genomi a singolo filamento di RNA con polarità positiva (ssrna) Classe IV scaricato da www.sunhope.it 15

Classe VI La sesta classe comprende i virus con genoma "diploide" cioé formato da due identiche molecole di RNA monocatenario tenute insieme in un dimero speculare a livello delle rispettive estremità 5 da legami a idrogeno, mentre le estremità 3 delle due molecole sono libere. A questa classe appartengono i Retrovirus. In questo caso il genoma ha la stessa polarità dell RNA messaggero, ciò nonostante non funziona da mrna, ma viene trascritto in un filamento complementare di DNA da una DNA-polimerasi RNA-dipendente associata al virione, detta "trascrittasi inversa". Successivamente una delle subunità di questo enzima funziona da RNasi, depolarizzando il filamento di RNA genomico presente nell'ibrido RNA/DNA. Lo stesso enzima agisce poi da DNA-polimerasi DNAdipendente e duplica il filamento di DNA negativo (-). Infine, il DNA a doppio filamento migra nel nucleo della cellula dove viene integrato in uno dei cromosomi (legame covalente al DNA cellulare). l Questo DNA a doppio filamento che contiene l informazione genetica virale viene detto "provirus" per analogia con il profago dei batteri e si comporta come un insieme di geni cellulari. In particolare, il suo filamento negativo (-) può essere trascritto in molecole di mrna ad opera della RNA-polimerasi cellulare. Virus con genomi a singolo filamento di RNA (ssrna) che usano un passaggio intermedio a doppio filamento di DNA (dsdna, un provirus) Classe VI Transcriptasi inversa virale RNApol cellulare scaricato da www.sunhope.it 16

Classe V La quinta classe comprende i virus con genoma a RNA a singolo filamento negativo (-). Di questa classe fanno parte Orthomyxovirus, Paramyxovirus e Rhabdovirus. In questo caso il genoma non può legarsi ai ribosomi ma deve prima essere trascritto in molecole complementari ad opera di una RNA-polimerasi RNA-dipendente associata al virione. La sottoclasse Va (Orthomyxovirus) presenta un genoma segmentato. La sottoclasse Vb (Rhabdovirus) presenta un genoma non segmentato. Genomi a singolo filamento di RNA con polarità negativa (ssrna) Classe V RNApol virale associata al virione scaricato da www.sunhope.it 17

Assemblaggio L assemblaggio implica la raccolta di tutti i componenti necessari per la formazione del virione vrone maturo in un punto particolare della cellula (viroplasma) dovesiformalastrutturadi base della particella virale Il sito di assemblaggio dipende dal sito di replicazione e dal meccanismo usato dal virus per uscire dalla cellula Nella maggior parte dei virus a RNA l assemblaggio avviene nel citoplasma Nella maggior parte dei virus a DNA l assemblaggio avviene nel nucleo scaricato da www.sunhope.it 18

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Esempi di Assemblaggio Assemblaggio dei poliovirus nel citoplasma della cellula infetta scaricato da www.sunhope.it 20

Assemblaggio dell HSV-1 nel nucleo Assemblaggio del virus dell influenza scaricato da www.sunhope.it 21

Assemblaggio di un retrovirus da una poliproteina precursore Assemblaggio di adenovirus nel nucleo scaricato da www.sunhope.it 22

Viral assembly at cellular membranes Impacchettamento del DNA scaricato da www.sunhope.it 23

Maturazione La maturazione rappresenta lo stadio del ciclo replicativo in cui il virus diventa infettivo La maturazione, generalmente, consiste in cambiamenti strutturali della particella virale che possono essere conseguenti a tagli proteolitici specifici delle proteine del capside per formare prodotti maturi o cambiamenti conformazionali delle proteine durante l assemblaggio Le proteasi virali sono frequentemente coinvolte nella maturazione anche se enzimi cellulari o una miscela di enzimi cellulari e virali può essere utilizzata La maturazione può avvenire all interno della cellula durante l assemblaggio e la furiuscita o anche all esterno dopo che i virus della progenie sono usciti dalla cellula Quando i virus sono sprovvisti di envelope, i virioni neoformati si accumulano nella sede di montaggio, formando ammassi talora cospiqui che possono assumere un ordinato aspetto tridimensionale di formazioni cristalline (fattorie). In questi casi la liberazione del virus neoformato nell ambiente esterno, si verifica solo per lisi della cellula scaricato da www.sunhope.it 24

Microscopia elettronica di fattorie citoplasmatiche in una cellula infetta con un reovirus scaricato da www.sunhope.it 25

Rilascio Liberazione della progenie virale a) Virus con pericapside gemmazione dalla membrana plasmatica esocitosi A golgi B C D scaricato da www.sunhope.it 26

Gemmazione del virus VSV dalla superficie di cellule CHO Gemmazione di un retrovirus alla superficie di una cellula infetta C ll l i f d i d ll h Cellula infetta da virus dell herpes simplex osservata al microscopio elettronico: dx: nucleocapsidi icosaedrici nel nucleo sx: virioni extracellulari provvisti di envelope scaricato da www.sunhope.it 27

Poxvirus scaricato da www.sunhope.it 28

Assemblaggio e rilascio Herpesvirus La genetica interviene in tutti gli aspetti della virologia L evoluzione naturale dei virus Il management clinico delle infezioni virali La virologia sperimentale scaricato da www.sunhope.it 29

Virologia sperimentale Goal Comprendere l organizzazione funzionale del genoma di un virus Determinazione della struttura di un genoma virale a livello nucleotidico Isolamento di varianti mutate del virus alterate in ciascun gene Analisi degli effetti di ciascuna mutazione sulla replicazione e/o la patogenesi I primi metodi per identificare, mappare, e caratterizzare i geni virali 1940s, 1950s, e 1960s L analisi genetica dei virus consisteva in: 1) casuale, forzato isolamento di numerosi virus individuali mutati seguito da analisi di complementazione per raggruppare i diversi mutanti 2) ricombinazione i per determinare l ordine fisico dei geni nel genoma virale 3) analisi fenotipica dei mutanti per determinare la funzione dei geni Colture cellulari Inizio dell era moderna dell analisi genetica dei virus 1970s Nuove tecniche mappatura con enzimi di restrizione marker rescue sequenziamento del DNA Reverse Genetics ma Tecnologia del DNA ricombinante Le tecniche classiche continuano ad essere utilizzate La struttura del genoma virale viene determinata e dopo la funzione dei singoli geni viene analizzata attraverso mutanti specificamente costruiti scaricato da www.sunhope.it 30

Mappatura dei siti di restrizione sul genoma virale DNA lineare tagliato con enzimi di restrizione A e B 0 2 4 6 8 (-) A B 5.0 4.5 3.0 2.5 (+) 1.0 What genes do you need to survive, and why do you need them? scaricato da www.sunhope.it 31

VARIABILITA VIRALE C è più diversità tra i virus che in tutti gli altri esseri biologici esistenti in natura. Nuove varianti si formano in continuazione E impossibile descrivere tutti i gruppi di virus non solo per la loro quantità, ma anche perché in continuo cambiamento Wild-Type Virus (ceppo selvatico) I virus definiti come wild type possono essere molto diversi da quelli realmente presenti in natura La genetica virale si fonda sulla coltivazione e l analisi dei virus in colture cellulari Isolati virali di campo possono essere soggetti a diverse modificazioni genetiche durante l adattamento alla coltivazione in vitro su colture cellulari In più I virus designati wild type devono essere purificati mediante selezione di placca prima di iniziare uno studio genetico unico background genetico scaricato da www.sunhope.it 32

Genotipo Fenotipo Concetti fondamentali di genetica Genotipo/Fenotipo Reale modificazione genetica rispetto al wt Manifestazione misurabile della modificazione in un sistema di analisi specifico Singolo genotipo Diversi fenotipi Secondo il sistema utilizzato Mutazione di un gene virale ESEMPIO Mutante temperatura sensibile su es.: VERO SI es.: BHK21 NO Concetti fondamentali di genetica Selezione e screen genetico si riferiscono a due metodi fondamentalmente diversi per identificare singole varianti virali contenute in una popolazione mista di virus La selezione implica la presenza di una condizione in cui solo il virus desiderato è in grado di crescere mentre gli altri vengono soppressi ESEMPIO Identificazione di un virus resistente ad un farmaco da una popolazione mista contenente anche virus sensibili Infettare un monostrato di cellule e trattarlo con il farmaco - drug + drug scaricato da www.sunhope.it 33

Concetti fondamentali di genetica Screen genetico Mutante desiderato (es.: tm) + molti altri virus Coltivati con le stesse condizioni permissive (temperatura ottimale) Analisi delle singole placche (a temperature più elevate) Introduzione di un marker fenotipico Inserimento del gene della betagalattosidasi al posto del gene da inattivare Virus wt (placche bianche) In presenza dell appropriato cromogeno (X-gal) Virus mutato (placche blu) Concetti fondamentali di genetica Essenziale/Nonessenziale Essenziale Nonessenziale Necessariamente richiesto per la replicazione in specifiche condizioni Non richiesto per la replicazione in specifiche condizioni Eventualmente alcuni geni possono essere essenziali per la replicazione nell ospite naturale, ma non per la replicazione in vitro Gene mutato Isolamento Analisi funzione Gene nonessenziale Gene essenziale Facile (il gene può essere deleto) Condizioni difficili da trovare Difficile (no fenotipo) Caratterizzazione precisa della mutazione causa del difetto replicativo scaricato da www.sunhope.it 34

Mutazioni Mutazioni Spontanee Mutazioni Indotte Mutazioni doppie Mutanti doppi (o multipli) possono contenere più di una mutazione per portare un fenotipo Mutazioni Spontanee Sia i virus a DNA che ad RNA possono andare incontro a mutazioni spontanee RNA viruses > DNA viruses 10 3-10 6 per ciclo replicativo 10 8-10 11 per ciclo replicativo Trascrittasi inversa/ RNA polimerasi RNA-dipendente No proofreading DNA polimerasi DNA-dipendente funzione proofreading Differenze nel tasso di frequenza di mutazioni spontanee Biologia del virus Analisi genetica dei virus I virus RNA in natura esistono come: quasi-species scaricato da www.sunhope.it 35

Mutazioni indotte La frequenza di mutazioni può comunque essere bassa che indurre mutazioni è necessario per isolare virus mutati normalmente single-base changes Mutageni chimici in vitro Alterazione dell acido nucleico trattando i virioni in assenza di replicazione idrossilamina acido nitroso agenti alchilanti Modificazioni chimiche di specifiche basi causano disaccoppiamento che porta ad mutazioni missenso in vivo Analoghi nucleosidici Devono essere incorporati durante la replicazione del virus nitrosoguanidine mutazioni missenso L uso di mutageni chimici porta ad un aumento della frequenza delle mutazioni di varie centinaia di volte 0.5% della popolazione totale di virus Sostituzione di base Genotipo mutato Delezione/inserzione GCG GCA CUC-AGC-GUU Ala Silente Ala DEL Leu Ser Val INS GAC GAG Asp Glu Missenso CUC-GUU CUC-AGC-CAU-GUU Leu Val Leu Ser His Val Del/Ins di triplette o multipli UAG UAA CUC-AGG-UU CUC-AAG-CGU-U Leu Arg Leu Lys Trp Stop Non-senso Del/Ins di singole basi Mutazioni non-senso, frameshift, grosse delezioni/inserzioni in frame: inattivazione del gene Mutazioni missenso: cambiamenti nel fenotipo (es.: resistenza farmaci) Arg scaricato da www.sunhope.it 36

Fenotipo mutato Goal Funzione di ciascun gene virale Inibiscono la replicazione inattivando uno specifico gene Mutanti utili Necessità di coltivazione Mutazione non letale Fenotipi Spettro d ospite Nonsense Temperatura-sensibili Dipendenti dai farmaci Morfologia di placca Mutanti virali per spettro d ospite Virus mutante Virus wt Cellula A Cellula B Cellula A Cellula B Crescita SI NO SI SI Naturale o ingegnerizzato Raro Delezione di un gene essenziale Creazione di una linea cellulare (su cui coltivare il virus) che esprime in modo costitutivo o transiente il gene deleto in modo da fornire al virus la funzione mancante scaricato da www.sunhope.it 37

Mutanti temperatura-sensibili Virus mutante Virus wt Bassa Temp. Alta Temp. Bassa Temp. Alta Temp. Crescita SI NO SI SI Generalmente mutazioni in un singolo aminoacido che rendono la proteina target instabile a temperature più alte rendendo il gene non funzionale Metodo di selezione Mutagenesi random indotta e poi screening alle due temperature Raccolta e test delle singole placche Lo screening può essere reso più facile dall utilizzo ddella tecnica dell allargamento delle placche: si coltivano i virus a temperatura permissiva, poi si spostano a temperatura più elevata (non permissiva per i mutanti) e si selezionano le placche che restano della stessa taglia Farmaco resistenza/dipendenza Diverse sostanze ad attività antivirale Maggiore utilità (inibiscono diverse famiglie virali) sono state descritte Antivirali specifici per un singolo prodotto genico ESEMPI Guanidine polio 2C NTPase Acyclovir Amantidine IBT (Isatin-βthiosemicarbazone) herpes simplex virus thymidine kinase e DNA polymerase influenza virus M2 (proteina integrale di membrana) due geni dei poxviruses coinvolti nella trascrizione virale I farmaci più utili sono quelli che inibscono ib la crescita su colture cellulari l (trattate col farmaco) del wt permettendo la selezione delle placche formate da particelle virali resistenti Gli effetti tossici devono essere minimali per consentire la sopravvivenza delle cellule Utilizzo: a) marker di selezione b) identificazione del target o meccanismo d azione di un farmaco antivirale scaricato da www.sunhope.it 38

Diluzioni seriali in base 10 del virus wt o del mutante temperatura sensibile ts56 40 C temperature non-permissiva per ts56 Wt virus forma placche sia a 31 C sia a 40 C, ma la formazione di placche è inibita dal IBT ts56 contiene una mutazione missenso che lo rende incapace di crescere a 40 C, ma è anche dipendente dalla presenza di IBT, infatti cresce a 40 C solo in presenza di IBT Mutanti spontanei resistenti all IBT nel wt virus stock (placche a 10 3 e 10 4 in presenza di IBT Morfologia di placca Mutanti con diversa morfologia di placca sono facilmente distinguibili dal wt Le placche provocate dai virus mutati saranno di maggiori o minori dimensioni rispetto al wt Mutanti sinciziali Esempio Difetto nelle Glicoproteine di membrana wt Virus erpetici Estesa fusione delle cellule infette Gruppi di cellule arrotondate Con scarsa fusione scaricato da www.sunhope.it 39

Reversion Gene V A mutante ts Gene A V Mutante del mutante ts Reversione: il risultato di una mutazione spontanea che porta il genotipo del virus al genotipo originale Frequenza Mutazioni missenso Delezioni Riflette la frequenza degli errori degli enzimi di replicazione Estremamente rare (intera sequenza di nucleotidi da rimpiazzare) Complementazione A B p np Virus mutato A Virus mutato B Condizioni permissive Analisi genetica dei mutanti Serve a determinare se due mutanti virali hanno subito mutazione nello stesso gene o in geni differenti Condizioni non-permissive np np p + A A B B 1 2 3 Raccolta del virus A A+ B B Indice di Complementazione (CI) Titolazione Titolo (A+B)p Titolo (A+B)np Titolo (A)p + Titolo (B)np = CI scaricato da www.sunhope.it 40

Condizioni di crescita non permissive Complementazione? Mutante A Mutante B Gene X Gene Y A fornisce il gene Y a B B fornisce il gene X ad A SI Mutante A Mutante B Gene X Il gene X viene sempre a mancare Gene X Complementazione: CI maggiore di 1 NO Complementazione qualitativa ts12, ts15, ts28, ts54, ts61 Stesso gruppo di complementazione? Esperimento Monostrati di African green monkey kidney cell line BSC40 Infezione (0.03 pfu/cell) con virus mutati singoli o in coppie Controllo ts7 appartenente ad un diverso gruppo di complementazione Risultati Singoli virus Infezioni doppie Infezioni miste con ts7 NO NO SI ts12, ts15, ts28, ts54, ts61 appartengono allo stesso gruppo di complementazione scaricato da www.sunhope.it 41

Complementazione Non solo gruppi di complementazione Fondamentale per: crescita di virus deleti ingegnerizzati mediante infezione di cellule (a loro volta ingegnerizzate) che forniscono il gene mancante Interazione genetica: Due tipi di complementazione Complementazione allelica (intragenica): quando differenti mutanti hanno difetti complementanti nello stesso gene Complementazione non allelica (intergenica): risultante da da difetti in geni diversi scaricato da www.sunhope.it 42

Ricombinazione Ricombinazione Sequenze di acido nucleico da due virus Parentali genotipicamente diversi vengono scambiate La progenie contiene sequenze di entrambi i virus Nei virus esistono tre diversi meccanismi di ricombinazione DNA Rottura fisica e ricongiunzione tra le due molecole di DNA attraverso regioni contenenti sequenze omologhe RNA non-segmentato Picornavirus, coronavirus, Togavirus e retrovirus (efficiente ricombinazione) Ricombinazione durante la replicazione dove attraverso il meccanismo (copy choice) viene alternativamente scelto il template RNA segmentato Riassortimento dei vari segmenti di RNA COPY CHOICE RECOMBINATION scaricato da www.sunhope.it 43

COPY CHOICE RECOMBINATION COPY CHOICE RECOMBINATION scaricato da www.sunhope.it 44

RIASSORTIMENTO Riassortimento dei segmenti di RNA del virus dell influenza Polyacrylamide gel degli RNA marcati con 32P e autoradiografia scaricato da www.sunhope.it 45

Ricombinazione classica RICOMBINAZIONE Comune nei virus a DNA RICOMBINAZIONE - SOME USES scaricato da www.sunhope.it 46

Ricombinazione mediante trasfezione di DNA plasmidico ed infezione con HSV-1 di cellule CR1 (cellule Vero che esprimono stabilmente gh) HSV - SynK gh UL21 UL23 UL53 LacZ A V Mutazione in gh da analizzare una volta inserita in HSV-1 UL22 - gh CMVp aa 280 pimplghmut280 fori AmpR HSV SynKgHMut280 UL21 UL23 UL53 UL22 - gh A V HSV SynKgHM280 Fenotipo: Syn/White UL53 UL22 A V HSV - gh Syn mutant LacZ flank seq. UL21 315 bp UL22 1 Kb UL22 flank seq. UL23 Fenotipo: Non-Syn/Blue HSV - SynK UL53 UL22 A V HSV - ghpa Syn mutant LacZ flank seq. UL21 flank seq. UL23 scaricato da www.sunhope.it 47

Selezione Selezione Co-infezione a 10 MOI (HSV-1 ghpa e HSV-1 SynK) su cellule CR1 24h Raccolta progenie viruale e preparazione di diverse aliquote Risultato Titolazione su CR1 3.3 x 107 pfu/ml 7,2% (% di ricombinazione) Syn/Blu Infezione di cellule CR1 con progenie virale 24h 6-8h Ricoprire le cellule con agarosio +X-gal Raccolta delle placche blu sinciziali Risultato 10 placche blu sinciziali raccolte 1 selezionata scaricato da www.sunhope.it 48

Selezione Infezione di cellule CR1 con placca selezionata 24h 6-8h Risultato Ricoprire le cellule con agarosio +X-gal Raccolta delle placche blu sinciziali 10 placche blu sinciziali raccolte 2.1 x 10 4 pfu/ml 20% Blu/Syn 1 selezionata La raccolta delle placche viene effettuata almeno 3-4 volte Infezione di cellule CR1 con placca selezionata 24h 6-8h Risultato Ricoprire le cellule con agarosio +X-gal Raccolta delle placche blu sinciziali 10 placche blu sinciziali raccolte 1 selezionata 8 x 10 4 pfu/ml 100% Blu/Syn HSV SynK gh 10 8 pfu/ml Southern blotting di ghpasynk scaricato da www.sunhope.it 49

Costruzione di virus mutato Trasfezione delle cellule con il DNA plasmidico contenente il gene mutato da sostituire DNA Infezione con il virus ricombinante Virus HSV - SynK gh UL21 LacZ UL23 UL53 A V CMVp UL22-gH aa 280 pimplghmut280 AmpR fori Selezione delle placche sinciziali bianche (il gene LacZ viene sostituito da gh) HSV SynKgHMut280 UL21 UL23 UL22-gH UL53 A V Southern blotting di HSV-1SynKpAgHM280 scaricato da www.sunhope.it 50