Work kshop MIC CPRINCEM Micotossine principali ed emergenti nei cereali Sviluppo e validazione di un metodo UPLC-DAD per la determinazione i simultanea di deossinivalenolo e nivalenolo nel frumento M. Pascale, G. Panzarini, A. Visconti ISPA-CN NR, Bari Roma, 18 aprile 2013
Coinvolgimento o dell ISPA-CNR nel WP1. Definizione e validazione di metodiche analitiche utili per la determinazione di micotossine nei cereali WP3. Valutazione dell'incidenza delle principali micotossine utile per la costruzione di un sistema nazionale di valutazione del rischio WP4. Analisi della diffusione nelle aree a rischio dell incidenza delle principali specie fungine potenzialmente micotossigene. Verifica della correlazione tra presenza del fungo sulla pianta e contaminazione da micotossine Task 1.2 Definizione i i delle metodiche analitiche per la determinazione di micotossine emergenti nei cereali Task 1.3 Studio di metodi rapidi e/o innovativi di indagine per l'accertamento delle micotossine i e delle fitopatie i fungine (in collaborazione con CRA QCE) Task 3.3 Valutazione dell'incidenza di micotossine emergenti in frumento, mais e orzo nei diversi areali agro-climatici italiani (in collaborazione con CRA QCE e CRA-MAC) Task 4.2 Analisi delle principali specie fungine produttrici di tossine T-2 e HT-2 in Italia (in collaborazione con CRA PAV)
Deossinivaleno lo/nivalenolo Cereali H 3 C CH 2CH3 Deossinivalenolo (DN) a rischio contaminazione frumento mais orzo seg gale avena H 3 C FUNGHI PRDUTTRI CH 2CH3 Nivalenolo (NIV) DN Fusarium graminearum F. culmorum NIV Fusarium graminearum F. culmorum F. poae F. crookwellense
DN e NIV: effetti t ossici sugli animali Inibizione i della sintesi i del DNA, RNA e delle proteine Effetti neurotossici ed immunosoppressivi Vomito Rifiuto cibo Riduzione peso corp poreo Ritardo nella crescit ta DN TDI 1 µg/kg b.w./day NIV t-tdi 0.7 µg/kg b.w./day Scientific Committee on Food, European Union (2002)
Frequenza di contam minazione da tossine di Fusarium in Europa Scientific Coope eration (SCP) Task 3.2.10 (Aprile 2003) micotossina n. ca ampioni campioni analizzati positivi Deossinivalenolo 1 1022 57% Nivalenolo 4166 16% Tossina T-2 3490 20% Tossina HT-2 3030 14% Zearalenone 5018 32% Fumonisina B1 3863 46% Fumonisina B2 1010 42%
DN in Livelli di DN n cereali in Europa Scientific Cooperation (SCP) - Task3210 3.2.10 % media positivi (µg/kg) Pae ese Media (µg/kg) Paese Max. (µg/kg) Frumento 61 205 Svezia 1427 Francia 50000 Mais 89 594 Francia 1056 Francia 8500 rzo 47 37 landa 153 Finlandia 619 Avena 33 95 Finla andia 628 Finlandia 5004 Segale 41 42 landa 150 Francia 595 Turner, 2010
Livelli di NIV in cereali in Europa Scientific Cooperation (SCP) - Task3210 3.2.10 % media positivi (µg/kg) Pae ese Media (µg/kg) Paese Max. (µg/kg) Frumento 14 24 Finlandia 199 Danimarca 440 Mais 35 - - - Francia 340 rzo 8 15 Finlandia 55 Finlandia 351 Avena 21 56 Aus stria 197 Austria 1860 Segale 5 - - - Danimarca 48 - non fornito dallo SCP Turner, 2010
Livelli di DN in frumento duro prodotto o in Italia (rete naziona le 2006-2008) 2008) Risultati del MICCER NRD CENTR SUD-ISLE ANNI n. cam. n. pos. Media pos. (ppb) max. (ppb) n. cam. n. pos. Media pos. (ppb) max. (ppb) n. cam. n. pos. Media pos. (ppb) max. (ppb) 2006 84 55 129 46 291 1280 258 225 791 297 (65%) (5 0%) (15%) 62 219 2007 135 131 (97%) 174 502 264 189 (7 2%) 155 1285 305 173 (57%) 88 459 2008 66 66 (100%) 2211 6764 102 81 (8 0%) 480 4613 132 44 (33%) 57 233 totale 285 252 (88%) - - 624 399 (6 4%) - - 734 263 (36%) - - metodo di analisi ELISA, LD = 18,5 ppb Aureli et al., 2009
Metodi di analisi per la determinazione simultanea d i DN e NIV clean-up vantaggi svantaggi GC-ECD, MS MycoSep Analisii simultanea di tricoteceni Buona sensibilità Conferma dell analita (MS) Derivatizzazione Effetto matrice Effetto memoria Interferenze di matrice Scarsa accuratezza e precisione i HPLC-UV MycoSep Buona precisione Interferenze di matrice Bassa sensibilità s HPLC-FLD SPE Buona Buona sensibilità precisione Derivatizzazione Interferenze di matrice LC-MS MycoSep, SPE Analisii simultanea di micoto ossine Buona sensibilità Conferma dell analita Strumentazione costosa Effetto matrice Curva di calibrazione in matrice o uso di standard isotopici
Determinazione simult tanea di di DN e NIV Nuova colonna ad immunoaffinità H 3 C Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC ) CH 2CH3 H 3 C CH 2CH3 Anticorpo monoclonale l Nuova fase stazionaria (dimensioni delle particelle <2,0 µm). specifico per DN e NIV in grado Vantaggi (prestazioni migliori rispetto HPLC): di isolare simultaneamente le due - migliorata risoluzione; micotossine dall estratto - migliorata sensibilità; - migliorata velocità; - ridotto uso di solventi organici. Tempi delle corse cromatografiche fino a 9 volte inferiori a quelli HPLC.
Metodo di analisi Estrazione doppia filtrazione (filtro di carta e filtro a microfibra di vetro) Purificazione dell estratto con colonna ad immunoaffinità (DN-NIV NIV TM WB, Vicam) Strumentazione: Acquity UPLC (Waters) Colonna: Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 100 2,1 mm i.d.).) Volume iniettato: 10 µl Fase mobile: H 2 :CH 3 (85:15) Flusso: 0,4 ml/min Rivelatore: PDA ( =220 nm) Analisi UPLC /PDA
ttimizzazione della pr rocedura di estrazione (campione artificialm mente contaminato) Livello di contaminazione: 1000 0 µg/kg DN e 1000 µg/kg NIV Condizioni di estrazione acqua (agitazione orbitale, 1 h) metanolo:acqua, 80:20 (agitazione orbitale, 1 h) DN NIV Rec. RSD* Rec. RSD* (%) (%) (%) (%) 93,9 a 2,9 89,0 a 3,6 92,0 a 2,1 87,6 a 2,3 * RSD, deviazioni standard relative (n=3); valori seguiti dalla stessa lettera nella stessa colonna non sono significativamente differenti a P<0.001 (test di Student Newman Keuls)
ttimizzazione della pr rocedura di estrazione (campione di frumento na aturalmente contaminato) Condizioni di estrazione Media ( µg/kg) DN RSD* (%) Media (µg/kg) NIV RSD* (%) acqua blending, 3 min acqua agitazione orbitale, 1 h metanolo:acqua, 80:20 blending, 3 min metanolo:acqua, 80:20 agitazione orbitale, 1 h 663 a 1,0 491 a 1,0 673 a 2,3 501 a 1,6 384 b 5,8 334 b 4,3 449 c 2,6 441 c 3,1 * RSD, deviazioni standard relative (n=6); valori seguiti dalla stessa lettera nella stessa colonna non sono significativamente differenti a P<0.001 (test di Student Newman Keuls)
ttimizzazione della pr rocedura di estrazione (materiale di riferi mento certificato) ERM BC600 DN ± SD * NIV ± SD * (µg/kg) (µg/kg) Valore certificato 102 ± 11 1000 ± 130 Valore trovato acqua (agitazione orbitale, 1h) Valore trovato t metanolo:acqua, 80:20 (agitazione orbitale, 1h) 110 ± 3 1082 ± 38 49 ± 9 605 ± 17 * Deviazione standard, n=5
Metodo di analisi ottimizzato Estrazione (acqua, agitazione orbitale, 1h) doppia filtrazione (filtro di carta e filtro a microfibra di vetro) Purificazione dell estratto con colonna ad immunoaffinità (DN-NIV NIV TM WB, Vicam) Lavaggio con acqua Eluizione con metanolo Analisi UPLC /PDA Limite di rivelabilità (LD) NIV = 20 µg/kg DN =30 µg/kg
Capacità della colonna ad immunoaffinità DN NIV + DN NIV La colonna ad immunoaffinità mostra saturazione dei siti dell anticorpo specifici per il DN e NIV a livelli maggiori di 2000 ng (singola micotossina o somma di DN e NIV). Range di applicabilità LD 4000 µg/kg
Recuperi e precisione Livello di fortificazione (µg/kg) DN Recupero (%) NIV RSD* Recupero RSD* (%) (%) (%) 100 94,9 500 89,9 1000 90,7 1750 89,8 2000 84,9 7,0 83,9 6,7 1,9 81,1 2,7 1,2 87,9 1,1 1,8 87,7 3,0 1,8 85,5 2,7 * RSD, deviazioni standard relative (n=4)
Validazione del metodo con materiale di rife erimento certificato ERM BC600 DN ± SD * (µg/kg) NIV ± SD * (µg/kg) Valore certificato 102 ± 11 1000 ± 130 Valore trovato ** 110 ± 3 1082 ± 38 *Deviazione standard, ** analisi effettuate per 5 giorni consecutivi (n=5 5)
Cromatogrammi UPLC-PDA di estratti di frumento contaminati da DN e NIV 0.0025 (a) 0.0020 AU 0.0015 0.0010 NIV DN Campione non contaminato (<20 µg/kg NIV and <30 µg/kg DN) 0.0005 0.0000-0.0005 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4. 00 Minutes 0.022 0.020 0.018 NIV (b) AU 0.016 0.014 0.012 0.010 0.008 0.006 DN Campione artificialmente contaminato con NIV (1750 µg/kg) e DN (1750 µg/kg) 0.004 0.002 0.000 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4..00 Minutes 0.011011 0.010 0.009 NIV (c) AU 0.008 0.007 0.006 0.005 0.004 Campione certificato ERM -BC600 (NIV = 1124 µg/kg, DN = 980 µg/kg) 0.003 0.002 0.001 DN 0.000 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.000 Minutes
Cromatogrammi Confronto cromatog UPLC-PDA rammi di estratti UPLC vs di HPLC frumento (materiale contaminati di riferimento da certificato DN ERM e NIV BC600) 0.011 NIV (1,2 min) 0.010 0.009 0.008 0.007 UPLC Strumentazione: Acquity UPLC (Waters) Colonna: Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 100 2,1 mm) AU 0.006 0.005 Volume iniettato: 10 µl 0.004 Fase mobile: H 2 :CH 3 (85:15) 0.003 0.002 0.001 DN (2,4 min) Flusso: 0,4 ml/min Rivelatore: PDA ( =220 nm) 0.000 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 Minutes 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8 3.2 3.40 3.60 3.80 4.00 3.6 4.0 0.022 0.020 0.018 0.016 0.014 NIV (4,9 min) HPLC Strumentazione: : Alliance HT (Waters) Colonna: Synergi 4µ Hydro-RP (4 µm, 150 x 3,0 mm) AU 0.012 0.010 0.008 Volume iniettato: 50 µl Fase mobile: H 2 :CH 3 (85:15) 0.006 0.004 0.002 0.000 DN (10,2 min) Flusso: 0,5 ml/min Rivelatore: PDA ( =220 nm) 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 Minutes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12.00 12 13.00 13 14.00 14 Tempo (min)
Performances del metodo UPLC-PDA per la determinazione di D N e NIV in frumento DN NIV LD 30 µg/kg 20 µg/kg Recuperi (n=4) 85-95% range 100-2000 µg/kg 81-88% range 100-2000 µg/kg Precisione (RSD) <7% 7% Tempo totale t di analisi i Corsa UPLC Capacità della colonna ad immunoaffinità 1 h 4min 2000 ng (singo la micotossina o somma di DN e NIV) Range di applicabilità 20-4000 µg/kg (2 ml of estratto su IMA) (singola micotossina o somma di DN e NIV)
Analisidicampioninaturalmente contaminati 20 campioni di frumento duro i rigine: i Nord It talia DN NIV positivi 100% 10% media (µg/kg) 560 37 valore max. (µg/kg) 26 698 46
Work kshop Micotossine i principali i ed emergenti nei cereali Grazie per l attenzione! michelangelo.pascale@ispa.cnr.it Roma, 18 aprile 2013