INFINITI CFTR-31 Assay Metodica

INFINITI CFTR-31 Assay Metodica Per uso diagnostico in vitro FOR EXPORT ONLY Prodotto da AutoGenomics, Inc., 2980 Scott Street, Vista, CA USA 92081 Rappresentante EU Autorizzato : BÜHLMANN Laboratories AG Baselstrasse 55 CH-4124, Schönenbuch, Switzerland 1 of 9

USO INFINITI CFTR-31 è un dispositivo diagnostico in vitro per la rilevazione e l identificazione simultanea di varianti del gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) in campioni di DNA genomico umano isolato da sangue intero periferico. INFINITI CFTR-31 è un test qualitativo da eseguirsi in laboratori clinici dietro richiesta del medico curante. INFINITI CFTR-31 si utilizza, insieme all anamnesi clinica e ad altri dati di laboratorio, nello screening dei portatori adulti di fibrosi cistica (in età riproduttiva), come supporto nello screening dei neonati e come test diagnostico per confermare la fibrosi cistica in neonati e bambini. INFINITI CFTR-31 non è indicato per la diagnosi prenatale o pre-impianto INFORMAZIONI GENERALI La fibrosi cistica (FC) è una malattia ereditaria autosomica recessiva dovuta a mutazioni associate alla regolazione dei canali del cloro (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator o CFTR). I bambini malati presentano alla nascita ileo da meconio o nell infanzia sono colpiti da malnutrizione e polmoniti. Nel gene della fibrosi cistica sono state trovate più di 1.000 mutazioni, la maggior parte delle quali è molto rara. La mutazione più comune, che rappresenta il 70% delle mutazioni relative alla fibrosi cistica nei caucasici, è la delezione della fenilalanina in posizione 508 della proteina CFTR. Circa il 50% dei malati Caucasici sono omozigoti per questa mutazione. L incidenza della patologia nei Caucasici, Afro Americani ed Asiatici è, rispettivamente, di circa 1:2.500, 1:15.000, 1:30.000. (1) PRINCIPIO DEL TEST INFINITI CFTR-31rivela la presenza delle seguenti mutazioni del gene CFTR G85E deltaf508 3659delC R117H 1717-1G>A 3849+10kbC>T I148T G542X R1162X R334W G551D W1282X R347P R553X N1303K 621+1 G>T R560T IVS8-5T/7T/9T 711+1 G>T 1898+1G>A I506V A455E 2184delA I507V 1078delT 2789+5G>A F508C deltai507 3120+1G>A INFINITI CFTR-31 è basato su cinque processi principali: (a) Estrazione del DNA da campione di sangue umano (b) Amplificazione mediante PCR del DNA purificato (c) Estensione del primer analita specifico con incorporazione del marcato (ASPE) (d) Ibridazione del primer esteso e fluorescente su un microarray e successivo lavaggio (e) Scannerizzazione del microarray (f) Rilevazione del segnale e elaborazione 2 of 9

I passaggi da (c) a (f) sono automatizzati sull Analizzatore INFINITI. Di seguito lo schema del test: DESCRIZIONE DEL DISPOSITIVO INFINITI CFTR-31 è un dispositivo diagnostico in vitro basato sulla tecnologia del microarray su film brevettata da AutoGenomics, associata a processi di automazione, gestione dei reagenti e impiego di software per la rilevazione e la genotipizzazione del gene della fibrosi cistica (CFTR) ottenuto da campioni di sangue intero EDTA. INFINITI CFTR-31 comprende BioFilmChip Microarray, Modulo Reagenti Intellipac ed è automatizzato con l Analizzatore INFINITI - Software Operativo Qmatic. Il BioFilmChip Microarray è formato da una pellicola di poliestere coattata con componenti multi-strato brevettati per ottimizzare l analisi del DNA. Gli strati sono stati progettati per fornire una superficie versatile che aumenti le prestazioni del test. INFINITI CFTR utilizza un microarray chip (Q-chip) che contiene Sonde a Cattura non utilizzate che potrebbero essere potenzialmente impiegate per aggiungere altri test specifici. Quindi test multipli possono essere sviluppati utilizzando lo stesso microarray). Il Modulo Reagenti Intellipac contiene quattro scomparti che alloggiano i reagenti del test. Il Modulo Reagenti Intellipac ha un chip di memoria integrato; le informazioni sui reagenti quali numero di lotto, data di scadenza, volumi sono archiviate nel chip di memoria e evidenziate quando si compila la lista di lavoro. La PCR Amplification Mix contiene i reagenti necessari per la PCR. Ogni confezione di PCR Amplification Mix contiene 4 flaconi di reattivo L Analizzatore INFINITI è uno strumento multiplex che misura i segnali in fluorescenza di target marcati di DNA ibridati a BioFilmChip microarray. L Analizzatore INFINITI automatizza il test INFINITI CFTR integrando tutti i singoli processi di gestione dei campioni (PCR amplicon), dei reagenti, l ibridazione, la rilevazione e l analisi dei risultati. I test sono processati automaticamente e gli spot vengono letti dal microscopio confocale interno. I risultati sono analizzati ed espressi come genotipo. L analizzatore INFINITI è marcato CE. Le istruzioni per il suo corretto utilizzo sono contenute nel Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI. 3 of 9

AVVERTENZE E PRECAUZIONI Ad uso diagnostico in vitro. Da utilizzarsi solo a cura di personale di laboratorio qualificato. Questo test deve essere utilizzato solo per campioni di sangue intero EDTA. Non congelare/scongelare il campione. I campioni devono essere processati prima possibile. Non utilizzare Eparina: l Eparina può interferire con la PCR. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazioni crociate, la preparazione del campione, il set up della reazione di PCR e l analisi del prodotto della PCR dovrebbero essere effettuate seguendo linee guida approvate come le CLSI (Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases: Approved Guideline). Tutti i campioni dei pazienti sono da considerarsi potenzialmente pericolosi. Prestare attenzione nel trattamento di materiali di origine umana. Nessun metodo può garantire l assenza di HCV, HIV o di altri agenti infettivi. Seguire le Linee Guida CLSI (Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases; Approved Guidelines; MM3-A). Non costituire pool o miscele di reagenti di lotti diversi. Non usare kit o reagenti oltre la data di scadenza. Conservare kit e reagenti secondo quanto riportato sull etichetta del prodotto. Procedure di Laboratorio Seguire le normali procedure per il trattamento dei reagenti di laboratorio. Non mescolare i reagenti di contenitori diversi o di lotti diversi. Seguire le norme di sicurezza del laboratorio: non pipettare con la bocca; indossare indumenti protettivi (ad es., guanti monouso, camici da laboratorio) e protezioni oculari; non mangiare, bere o fumare nelle aree di lavoro del laboratorio; lavare le mani accuratamente dopo aver manipolato campioni e reagenti. Manipolazione dei Rifiuti Smaltire reagenti non usati, campioni e rifiuti secondo quanto previsto dalla vigente normativa nazionale. Le Schede di Sicurezza (MSDS) sono disponibili presso il Customer Service Medical Systems S.p.A. Preparazione del Campione Fare riferimento alle istruzioni di sicurezza riportate nella metodica fornita con il kit per l estrazione del DNA. Il prodotto ottenuto dalla PCR non può essere conservato prima di essere caricato nell Analizzatore INFINITI. Usare immediatamente. Analizzatore INFINITI Leggere il Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI prima di utilizzare lo strumento. Fare particolare attenzione alle Note. Seguire le indicazioni relative a Avvertenze e Precauzioni di Sicurezza contenute nel Manuale dell Operatore. Fare riferimento alla Sezione Requisiti di Installazione per l installazione dello strumento. Fare riferimento alla Sezione Errori quando si riscontrano errori durante l operatività dello strumento. Fare riferimento alla Sezione Help quando si riscontrano problemi. 4 of 9

CONSERVAZIONE/STABILITA BioFilmChip Microarray: Reagente Intellipac: Mix di Amplificazione: 12 mesi dalla data di produzione, refrigerato (da 2 C a 8 C) 12 mesi dalla data di produzione, refrigerato (da 2 C a 8 C) Nota: Non usare il Reagente Intellipac oltre quattro settimane dall apertura. 18 mesi dalla data di produzione, congelato (da -30 C a -15 C) Nota: la data di scadenza per ogni singola confezione è stampata sull etichetta. RACCOLTA CAMPIONE E STABILITA Sangue periferico prelevato in provetta EDTA (tappo porpora). Non congelare/scongelare i campioni di sangue. I campioni devono essere processati nel più breve tempo possibile. MATERIALI FORNITI (SUFFICIENTI PER 48 TEST) AutoGenomics Codice n 01-1060-02 INFINITI CFTR BioFilmChip Microarray Magazine AutoGenomics Codice n 01-2060-02 INFINITI CFTR Intellipac Modulo reagenti: 24 tests per modulo (2 moduli per kit) contenente: 1.0 ml ASPE master mix composto da: Buffer PCR dntps ASPE Primer Set per CFTR 2.6ml Buffer di Ibridazione SSC Hybridization Positive Control Conservante Sodio Azide 0.08% AutoGenomics Codice n 01-3060-02 INFINITI CFTR Amp Mix: 4 x 250µl provette di PCR reaction master mix contenente: Buffer PCR MgCl 2 dntps PCR Set Primer per CFTR AutoGenomics Codice n 12-0010-00: Tampone di lavaggio REAGENTI NECESSARI MA NON FORNITI Kit di Estrazione DNA - INFINITI CFTR può rilevare il gene CFTR da DNA genomico isolato da sangue con sufficiente purezza, i.e. A260/280 1.60. Può essere utilizzato ogni sistema di estrazione del DNA che rispetti queste specifiche. INFINITI CFTR è stato testato con diversi kit commerciali. Gli utilizzatori possono contattare il Servizio Prodotti Medical Systems per ulteriori informazioni. Acqua Distillata (DNAse and RNAse free) Titanium Taq DNA Polimerasi ATTREZZATURA Attrezzatura necessaria non fornita con i reagenti: AutoGenomics Codice n 10-0010-99: Analizzatore INFINITI con software operativo Qmatic. AutoGenomics Codice n 11-0080-00: Puntali INFINITI AutoGenomics Codice n 11-0030-00: INFINITI micropiastre da 24 pozzetti/coperchi Pipette 5 of 9

Mini Centrifuga Puntali per pipette Racks per provette da Microfuge Thermocycler Vortex Provette a parete sottile per PCR da 0.2 ml Provette per microcentrifuga da 0,5 ml Piastra 24-Well (24 WP) PROCEDURA DEL TEST Estrazione del DNA Seguire le istruzioni fornite nel kit usato per l estrazione del DNA. Reazione PCR Nota: Il prodotto della PCR non può essere conservato: caricarlo immediatamente nell analizzatore INFINITI. 1. Scongelare e portare a temperatura ambiente la provetta della Amp Mix e mantenere in ghiaccio la Taq DNA polimerasi. 2. Vortexare la provetta Amp Mix ottenuta 2-5 sec per mescolare i reagenti e centrifugare brevemente per portare il contenuto sul fondo della provetta. Includere un controllo negativo in ciascun set up della reazione di PCR. Preparare la Master Mix secondo il protocollo seguente Amp Mix 17.5 µl Taq DNA polimerasi 0.25 µl Template DNA (25ng/ul) 2.00 µl Totale 20.0 µl Per il Controllo negativo PCR, aggiungere 1µl di acqua DNase free. 3. Vortexare le provette 2 5 secondi per miscelare i componenti e poi centrifugare brevemente. Importante: Assicurarsi che i tubi siano perfettamente tappati per evitare evaporazione o fuoriuscite del materiale 4. Posizionare le provette nel thermocycler impostando le seguenti condizioni Condizioni di PCR Multiplex 2 Tm Step No. Temperatura C Tempo No. di Cicli 1 94 2 Minuti 1 2 94 50 72 20 Secondi 30 Secondi 30 Secondi Nota: Si raccomanda di impostare la reazione PCR nelle micropiastre INFINITI da 24 pozzetti (WP24) per ridurre al minimo la manipolazione del campione nei passaggi successivi. 40 6 of 9

Per evitare una potenziale contaminazione, si raccomanda un area di lavoro separata per la PCR. Assicurarsi che non ci sia evaporazione abnorme del prodotto della PCR. A PCR completata, verificare visivamente eventuali anomalie di volume. I volumi delle PCR devono essere circa 20 l : in caso contrario, non procedere con il test. Caricamento Campioni Seguire le istruzioni del Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI (codice N EM-34000). 1. Dispensare i 20 µl di prodotto della PCR nella piastra WP24 e caricarla nell Analizzatore INFINITI. 2. Caricare il BioFilmChip Magazine, il Modulo Intellipac, i puntali e il tampone di lavaggio specifici. Operazioni dell Analizzatore INFINITI Fare riferimento al Manuale dell Operatore dell Analizzatore INFINITI (codice N EM-34000). CONTROLLO DI QUALITA Si raccomanda di inserire in ciascuna seduta un controllo positivo (eterozigote e/o omozigote per il gene CFTR), un controllo negativo (un campione che non contenga la mutazione di interesse, i.e. un campione wild type) ed un Controllo No Template (acqua Molecular Grade). Contattare la Medical Systems S.p.A. per ulteriori informazioni. Nota: Il thermocycler usato deve essere regolarmente sottoposto a manutenzione e calibrato con uno standard esterno di temperatura, secondo le norme del laboratorio ed i requisiti del CQ. LIMITAZIONI I risultati ottenuti con INFINITI CFTR dovrebbero essere usati ed interpretati soltanto in un contesto globale di diagnosi clinica. AutoGenomics non è responsabile di qualsiasi decisione clinica venga presa. INTERPRETAZIONI DEI RISULTATI INFINITI CFTR rileva e genotipizza il gene CFTR. I risultati sono espressi come genotipo, cioè indicano quale genotipo è stato rilevato nel campione. La risposta no call indica che non sono stati prodotti risultati, i.e. non è stato trovato il genotipo. Questo potrebbe essere dovuto allo strumento, alla qualità del DNA del campione, ad errori dell operatore. Quando INFINITI genera un messaggio di errore, far riferimento alla sezione Risoluzione dei Problemi del Manuale dell Operatore INFINITI. Importante: tutti i risultati no call devono essere ripetuti. PRESTAZIONI DEL TEST Specificità Analitica Durante lo sviluppo di questo test sono stati condotti studi di specificità. La specificità dei primer della PCR è stata determinata dalla dimensione della banda del frammento amplificato su gel e dalla sequenza del frammento amplificato. La specificità del primer ASP è stata confermata ottenendo risultati corretti da campioni genomici noti. La specificità delle sonde di cattura è stata determinata per ibridazione con diversi oligonucleotidi e dimostrando che l oligo corretto ibridizza lo spot noto. Sensibilità Analitica Studi hanno dimostrato che INFINITI CFTR può rilevare da 3 a 300 ng di DNA. Per questo test, si raccomanda di utilizzare un minimo di 25 ng di DNA. 7 of 9

Precisione e Riproducibilità Per dimostrare la riproducibilità di INFINITI CFTR sono stati condotti tre studi inter-laboratorio. Gli studi sono stati condotti con tre lotti di INFINITI CFTR. I laboratori hanno testato campioni identici costituiti cinque da DNA genomici e tre da sangue intero. I tre laboratori hanno lavorato in cieco circa l identità dei campioni. In ogni laboratorio ciascun campione è stato testato in triplicato per giorno/operatore per sei giorni. In ogni laboratorio hanno lavorato tre diversi operatori. Sono stati utilizzati tre strumenti diversi. Riproducibilità in diversi strumenti Strumento # campioni testati # risposte/ genotipi corrette* (1 st corsa) corrette** (Finale) 1 132 3,336 99.97% 100% 2 132 3,336 99.0% 99.6% 3 132 3,336 98.6% 99.7% Riproducibilità di lotto Lotto # campioni testati # risposte/ genotipo corrette* (1 st corsa) corrette** (Finale) A 132 3,336 99.3 99.8% B 132 3,336 99.0 99.6% C 132 3,336 99.2 99.9% Riproducibilità inter laboratorio laboratorio # campioni testati # risposte/ genotipo corrette* (1 st corsa) corrette** (Finale) 1 132 3,336 99.97% 100% 2 132 3,336 98.6% 99.7% 3 132 3,336 99.0% 99.6% Total 396 10,008 99.2% 99.8% * corrette= # risposte di genotipi corrette/ # totale di genotipi ** Ratio di risposte corrette finale, dopo un retest Interferenze E stato valutato l effetto di sostanze potenzialmente interferenti. I risultati degli studi dimostrano che non c è interferenza con bilirubina (8 mg/dl e 0,08 mg/ml), colesterolo (70 mg/dl e 7 mg/dl), ed eparina (1333 U/dl e 133 U/dl). Nessuno studio è stato condotto con anticoagulanti orali. Non sono state registrati reclami. Trascinamento fra Campioni (Carry-over) Non è stato rilevato trascinamento caricando varie concentrazioni di DNA in sequenza (una seduta) 8 of 9

Comparazione fra metodi I risultati di INFINITI CFTR sono stati comparati a quelli ottenuti con altri kit commerciali (Tag-It ). Lo studio è stato condotto in tre diversi laboratori,. Ogni laboratorio ha utilizzato propri campioni di FTR. Mutazioni CF * # di Campioni % Concordanza alla % concordanza prima corsa* finale** delta F 508 30 90% 100% G542X 8 100% 100% W1282X 12 83.33% 100% G551D 12 83.3% 100% 621+1G>T 6 66.7% 100% N1303K 5 100% 100% R553X 2 100% 100% delta I507 3 66.7% 100% 3849+10kbC>T 8 75% 100% 3120+1G>A 3 100% 100% R117H 22 100% 100% 1717-1G>A 4 100% 100% 2789+5G>A 2 100% 100% R347P 1 100% 100% 711+1G>T 1 100% 100% Mutazioni CF * # di Campioni % Concordanza alla % concordanza prima corsa* finale** R334W 2 50% 100% R560T 2 100% 100% R1162X 5 100% 100% 3659delC 2 100% 100% A455E 2 100% 100% G85E 2 100% 100% 2184delA 1 100% 100% 1898+1G>A 3 100% 100% 1078delT 0 n/a 100% I148T 4 75% 100% IVS8-7T 1 100% 100% Total 143 91.6% 100% * Mutazioni determinate con Tag-It (Metodo di Riferimento) ** Dopo una ripetizione BIBLIOGRAFIA 1. ACCE review of CF/Prenatal Clinical Validity http://www.cdc.gov/genomics/gtesting/acce/fbr/cf/cfclival.htm 9 of 9