UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI FIRENZE Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Tesi di Laurea Triennale in SCIENZE NATURALI di Giulia Santalmasi Relazione tra ordine di accoppiamento e paternità nella tartaruga terrestre Testudo hermanni hermanni. Relatore: Prof. Marco Vannini Correlatrice: Dott.ssa Sara Fratini Anno Accademico 2010/2011

INDICE 1. INTRODUZIONE pag. 4 1.1. La selezione sessuale pag. 4 1.2. La competizione spermatica pag. 6 1.2.1. Adattamenti fisiologici pag. 7 1.2.2. Adattamenti morfologici pag. 8 1.2.3. Adattamenti comportamentali pag. 9 1.2.4. Adattamenti a livello di spermi pag. 10 1.3. Scelta criptica femminile pag. 12 1.3.1. Teoria di Fisher pag. 13 1.3.2. Teoria dei buoni geni pag. 14 1.3.3. Teoria last in- first out pag. 14 1.4. Benefici della poliandria pag. 15 1.4.1. Riserve spermatiche nei Chelonidi Testudinae pag. 16 1.5. Biologia riproduttiva nei Chelonidi Testudinae pag. 17 1.6. Cenni sull analisi di paternità pag. 19 1.7. Microsatelliti pag. 21 1.7.1. Applicazione dei microsatelliti pag. 25 1.8. Scopo della tesi pag. 26 2. MATERIALI E METODI pag. 28 2.1. Specie di studio pag. 28 2.2. Biologia riproduttiva di T. h. hermanni pag. 31 2.3. Disegno sperimentale pag. 34 2.4. Prelievo di tessuto epiteliale ed estrazione del DNA pag. 38 2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction) pag. 39 2.6. Microsatelliti utilizzati in T. h. hermanni pag.42 2.7. Sizing (analisi genotipica) pag. 42 2.8. Analisi dei dati pag. 43 2

3. RISULTATI pag. 46 3.1. Analisi del polimorfismo allelico pag. 46 3.2. Successo di shiusa pag. 47 3.3. Analisi di paternità pag. 49 3.4. Analisi delle covate miste pag. 53 4. DISCUSSIONI E CONCLUSIONI pag. 55 5. APPENDICE pag. 60 5.1. Estrazione del DNA da tampone boccale pag. 60 5.2. Reazione a catena della polimerasi (PCR) pag. 60 6. BIBLIOGRAFIA pag. 62 7. RINGRAZIAMENTI pag. 72 3

1. INTRODUZIONE 1.1 LA SELEZIONE SESSUALE La riproduzione sessuale è quel processo attraverso il quale un nuovo individuo eredita metà del patrimonio genetico dai genitori, differenziandosi da questi grazie a meccanismi di ricombinazione genetica (che genera nuove combinazioni di alleli sullo stesso cromosoma) e di assortimento casuale (che dà luogo a nuove combinazioni di cromosomi nelle cellule germinali). L effetto della ricombinazione genetica e dell assortimento casuale è semplicemente quello di rimescolare i geni esistenti in una popolazione in modo che, ad ogni generazione, nuove combinazioni di alleli siano esposte alla selezione. La riproduzione sessuale genera dunque una notevole diversità genetica, aumentando le possibilità di evoluzione e dotando la popolazione di un adattabilità all ambiente di gran lunga superiore a quella raggiungibile da una specie agamica. Entrambi i sessi che partecipano alla riproduzione mirano a massimizzare il loro successo riproduttivo così che, nel corteggiamento e nell accoppiamento, si verificano conflitti d interesse tra maschio e femmina. Secondo questa prospettiva gli individui dei due sessi giungono ad un alleanza travagliata in cui ciascuno tenta di trasmettere la massima quantità possibile di geni alla generazione successiva. Il risultato di questo conflitto sessuale ha più il carattere di uno sfruttamento di un sesso da parte dell altro piuttosto che l aspetto di una collaborazione. Importante nella riproduzione sessuale è quello che viene definito investimento parentale. Questo termine venne usato per la prima volta da Robert Trivers e consiste nel tempo e nelle energie investite nelle cure parentali, anche a discapito della possibilità di riprodursi ulteriormente in futuro. Il sesso che investe maggiormente diventa una risorsa limitante per l altro sesso che si trova a dover competere, a volte anche furiosamente, per i partner disponibili. Di solito le femmine investono nelle cure parentali maggiormente rispetto ai maschi e le differenze cominciano già a livello dei gameti (le femmine 4

producono infatti gameti grandi, ricchi di sostanze nutritive e privi di capacità di movimento mentre i maschi producono gameti piccoli e mobili) per essere poi amplificate in altri tipi di investimento che comprendono, ad esempio, il cibo e la protezione che i genitori forniscono ai figli. Quindi i maschi hanno una maggior variabilità nel successo riproduttivo e sono sottoposti ad un intensa selezione per quanto riguarda la capacità di trovare le femmine e di competere per loro con gli altri maschi (male-male competition). Riassumendo possiamo dire che: 1) Il successo riproduttivo di un maschio dipende dal numero di femmine che riesce a fecondare mentre per le femmine è sufficiente un solo accoppiamento per raggiungere il massimo successo possibile. 2) Il successo riproduttivo dei maschi ha una variabilità maggiore a causa della competizione per le femmine; al contrario queste hanno quasi tutte lo stesso successo. La diversità in investimento riproduttivo tra i sessi genera differenze anche nella sex ratio, ossia nel rapporto degli individui dei due sessi che sono disponibili a riprodursi in un determinato momento, in quanto la numerosità del sesso che ha il potenziale riproduttivo più basso è inferiore rispetto all altro che dovrà quindi competere per l accesso alla riproduzione (Kvanremo e Ahnesjo, 1996). Il fatto che l investimento riproduttivo delle femmine sia maggiore di quello dei maschi e che il rapporto numerico tra i sessi nella popolazione sia di 1:1 portano di solito i maschi a competere tra loro per le femmine ed esistono fortissime pressioni selettive a favore dei maschi più abili ad accoppiarsi. La selezione dei caratteri che hanno esclusivamente a che fare con l aumento del successo degli accoppiamenti viene indicata come selezione sessuale. Essa può agire in due modi: 1) favorendo l abilità dei maschi a competere direttamente tra loro per l accoppiamento con una femmina (selezione intra-sessuale ). 2) promuovendo nei maschi l insorgenza di caratteri sessuali secondari e/o comportamenti controadattativi e costosi che attraggono maggiormente le femmine (selezione inter-sessuale). 5

La selezione intrasessuale si origina quindi dalla competizione diretta tra gli individui dello stesso sesso per l accesso agli individui del sesso limitante favorendo la comparsa di quei caratteri che aumentano il successo negli scontri per la conquista della compagna. Questi tratti possono essere rappresentati da vere e proprie armi (corna, zanne etc.) ma anche da comportamenti utilizzati durante forme di lotta ritualizzate (Andersson,1994). La selezione intersessuale agisce invece quando un sesso, generalmente la femmina, sceglie attivamente gli individui con cui accoppiarsi preferendoli sulla base di alcuni caratteri, spesso penalizzanti, come ad esempio colorazioni, piumaggi vistosi, canti, display di corteggiamento etc. I benefici che possono arrivare alla femmina sono di tipo diretto o indiretto e per capire cosa c è alla base della scelta femminile (female choice) nelle specie promiscue è necessario capirne l entità. I benefici diretti derivano, ad esempio, dal contributo parentale alla cura della prole (garanzia di un territorio ricco di risorse, difesa della prole, cibo, aiuto alla costruzione del nido etc.). I benefici indiretti, invece, aumentano la qualità genetica e la variabilità della prole in modo da garantire una maggior adattabilità alle condizioni ambientali future. Sono benefici che non incidono sulla fitness della femmina che manifesta la preferenza ma sulla fitness della discendenza. Nelle specie che manifestano un sistema di accoppiamento promiscuo la competizione sessuale non sempre finisce con l accoppiamento ma può continuare sotto forme diverse attraverso meccanismi che coinvolgono direttamente i gameti maschili (competizione spermatica) o il comportamento post-copula della femmina (scelta criptica femminile). 1.2 COMPETIZIONE SPERMATICA Con il termine competizione spermatica si intende la competizione tra gli spermatozoi di maschi diversi per la fecondazione delle uova appartenenti alla medesima femmina. 6

Il primo a cogliere pienamente il significato evolutivo della competizione spermatica fu Parker (1970) il quale sottolineò che un maschio, per ottenere rappresentanza genetica nella generazione successiva, deve riuscire non solo ad accoppiarsi con la femmina, ma anche a fecondare l uovo femminile escludendo dalla competizione gli spermatozoi di possibili maschi rivali. Ovviamente i presupposti fondamentali perché si verifichi competizione spermatica sono che la femmina si accoppi con almeno due maschi diversi e che gli spermatozoi di questi maschi coesistano temporalmente e spazialmente (ad esempio all interno della spermateca). Oggi grazie alle moderne tecniche molecolari è stato possibile evidenziare come il fenomeno della paternità multipla sia comune in molte popolazioni di vertebrati (Uccelli: Griffith el al., 2002; Westneat e Stewart, 2003; Mammiferi: Kitchen et al., 2006; Gottelli et al., 2007; Pesci: Avise et al., 2002; Rettili: Pearse et al., 2002; Laloi et al., 2004; Anfibi: Adams et al., 2005). Ad esempio, negli uccelli la paternità extracoppia è diffusa nel 70% delle specie esaminate, con forti variazioni tra specie: si documentano fino al 76% di figli nati da relazioni extraconiugali (EPC extra pair copulation ; Birkhead, 1998). La competizione spermatica può agire con adattamenti comportamentali, fisiologici, morfologici ed a livello degli stessi spermatozoi che diventano veri e propri armamenti per vincere la competizione. 1.2.1 Adattamenti fisiologici. I maschi hanno evoluto adattamenti fisiologici alla competizione spermatica che includono tappi spermatici e prodotti di ghiandole seminali che in genere funzionano sia come offesa sia come difesa. I tappi copulatori vengono usati dai maschi di molti insetti, rettili e marsupiali ed in alcuni mammiferi come roditori, pipistrelli e primati. Queste strutture prendono forma nella vagina, in seguito alla coagulazione dell eiaculato, appena pochi minuti dopo la copula. Sono state avanzate diverse ipotesi circa la funzione di questi tappi che potrebbero prevenire la fuoriuscita degli spermatozoi, formare un serbatoio per il graduale rilascio di spermi o ridurre il rischio che un altro maschio insemini la femmina. 7

Quest ultima ipotesi ha direttamente a che fare con la competizione spermatica e vede un maggior vantaggio per il maschio che non per la femmina. Alcuni studi hanno inoltre suggerito che i tappi in alcuni casi impediscono l inseminazione da parte di altri maschi. Questi tappi spermatici tuttavia sono barriere temporanee contro l inseminazione da parte di altri maschi: la femmina infatti può rigettare il tappo prima o durante l ovodeposizione e le stesse strutture possono essere rimosse dai maschi facilitati da adattamenti morfologici dei genitali. Un tipico esempio di adattamento fisiologico alla competizione spermatica è quello che si riscontra nel ragno di mare (Inachus phalangium). In questa specie le femmine copulano con molti maschi ma è l ultimo che di solito feconda le uova. Quando il maschio infatti copula con la femmina prima trasferisce solo liquido seminale privo di spermatozoi. Questo liquido è una sorta di resina epossidica: entra nel magazzino spermatico della femmina, spinge verso il fondo tutti gli spermatozoi messi da parte in precedenza dopo di che si indurisce sigillandoli. A questo punto il maschio introduce i propri spermatozoi e così facendo se è l ultimo maschio ad inseminare la femmina sarà lui il padre di tutti i figli. I prodotti delle ghiandole seminali inseriti nell eiaculato, invece, agiscono influenzando la fisiologia ed il comportamento della femmina inducendola a deporre le uova o riducendone la recettività. Inoltre è stato riscontrato che i prodotti seminali di alcuni maschi sono in grado di uccidere o inibire gli spermi di un accoppiamento precedente. Questo si pensa possa avvenire grazie a sostanze presenti nel liquido seminale, anche se queste devono essere selettive verso gli spermi di altri maschi lasciando intatti gli spermi del maschio focale, oppure dovrebbero avere breve durata, in modo che l azione spermicida termini prima dell effettivo trasferimento dei propri spermatozoi da parte del maschio. 1.2.2 Adattamenti morfologici. In alcune specie sono presenti, a livello degli organi copulatori, modificazioni morfologiche di vario tipo. 8

La principale funzione del pene è quella di trasferire il seme dal maschio alla femmina ma può svolgere anche altre funzioni secondarie, alcune dei quali strettamente legate alla competizione spermatica e alla scelta spermatica. Queste comprendono la rimozione o la ricollocazione degli spermatozoi rivali all interno della femmina, la rimozione del tappo copulatorio e la stimolazione della femmina. La rimozione degli spermatozoi è una delle forme più dirette di competizione spermatica e ne è un esempio il pene dell odonato Caloptera maculata adornato di piccoli corni ed uncini che vengono usati proprio per questo scopo. Nella maggior parte dei casi tuttavia il fine delle appendici del pene è di aiutare a mantenere il contatto genitale con la femmina. Si potrebbe quindi pensare che le spine facilitino la copula per entrambi i partner ma ancora una volta la loro esistenza è il riflesso di un conflitto sessuale in quanto spesso sono soltanto i maschi ad ottenere un notevole vantaggio da una copula prolungata dal momento che questa permette loro di trasferire alla femmina più spermatozoi ed altre sostanze atte a manipolare il suo comportamento a vantaggio del maschio stesso (Birkhead, 2000). Infine, secondo alcuni, sembra che peni elaborati si siano evoluti per stimolare la femmina durante la copula. La femmina valuta il livello di stimolazione per decidere se utilizzare o meno per la fecondazione gli spermatozoi di un determinato maschio. La prestazione del maschio consente dunque alla femmina di discriminare tra lui ed altri maschi e di esercitare così una scelta criptica verso gli spermatozoi. Quindi un particolare grado di stimolazione attiva l accettazione femminile degli spermatozoi di un determinato maschio (Eberhard, 1979). 1.2.3 Adattamenti comportamentali Tra gli adattamenti comportamentali nella competizione spermatica, due sono di primario interesse: il controllo sulla compagna e la copula frequente. Nel primo caso è interesse del maschio ridurre la possibilità che la sua partner riceva lo sperma di un altro maschio. In molte specie quindi i maschi restano per 9

un certo periodo di tempo presso la femmina con cui si sono accoppiati. Questo comportamento di guardia ha ovviamente un costo dato che il maschio non può accoppiarsi con un altra femmina per tutto il tempo in cui resta accanto alla compagna già inseminata. In generale i benefici del controllo sulla compagna crescono all aumentare della probabilità che la femmina, una volta lasciata sola, si accoppi di nuovo ed usi lo sperma dei partner successivi per fecondare le proprie uova. I costi del controllo della compagna decrescono nella misura in cui le femmine recettive scarseggiano e di conseguenza i maschi che rimangono con una partner perdono meno la possibilità di individuare ed inseminare altre femmine. In alcuni casi tuttavia la sorveglianza della femmina è impossibile perché interferisce con altre attività come procurarsi il cibo, difendersi dai predatori etc (Westneat 1994). In questo caso come adattamento si ha la copula frequente dato che il partner che insemina più spermatozoi di un altro massimizza le probabilità di essere il padre dei futuri nascituri. 1.2.4 Adattamenti a livello di spermi. I testicoli della maggior parte delle specie sono strutture a coppa, di forma ovoidale o sferica. Comprendono numerosi e lunghi tubuli seminiferi caratterizzati da cellule che originano gli spermatozoi. Appena prodotti gli spermatozoi vengono spinti nell epididimo dove vengono immagazzinati. I testicoli riescono a produrre un numero variabile, ma comunque elevato, di spermatozoi e questo in relazione alle loro dimensioni. Le differenze tra le dimensioni relative dei testicoli vennero interpretate inizialmente in termini di frequenza di copula. Studi successivi hanno tuttavia confermato che le dimensioni dei testicoli sono da mettere in relazione alla competizione spermatica ed è il comportamento copulatorio della femmina il miglior parametro per prevedere le dimensioni relative dei testicoli. In generale un intensa competizione spermatica è da correlare a testicoli relativamente grandi (Stockley, 1997). 10

Anche la dimensione degli spermatozoi e la loro forma sono da associare alla competizione spermatica. In particolar modo esistono tre ipotesi per spiegare perché gli spermatozoi differiscono così tanto per dimensioni e forma. La prima non ha niente a che fare con la competizione spermatica e sostiene che le differenze si siano evolute attraverso la selezione naturale per prevenire la fecondazione tra membri di specie diverse. Le altre due idee fanno invece riferimento alla competizione spermatica e propongono che le differenze nelle dimensioni degli spermatozoi si siano evolute come il risultato della selezione sessuale o attraverso la scelta degli spermatozoi da parte della femmina o attraverso la competizione tra maschi. Queste ultime due ipotesi si basano sul fatto che gli spermatozoi più voluminosi siano in grado di surclassare quelli degli altri maschi. Specie nelle quali la competizione spermatica è più intensa tendono infatti ad avere spermatozoi più grandi rispetto a quelle in cui la competizione è rara o assente. Diverse teorie cercano di spiegare il maggior successo degli spermatozoi di maggiori dimensioni. Secondo la prima teoria gli spermatozoi più grandi sono preferiti dalle femmine perché portano un beneficio diretto nel senso che maggiori sono le dimensioni maggiore è il contributo di sostanza nutrienti per lo zigote. La seconda ragione per cui una femmina potrebbe preferire spermatozoi lunghi e grandi è perché così facendo acquisisce un particolare vantaggio genetico per la sua prole. Questi spermatozoi apparirebbero più attraenti per la femmina rispetto ad altri. La femmina avrà così figli che a loro volta produrranno spermatozoi attraenti e figlie che preferiranno essere fecondate da spermatozoi con quelle caratteristiche. Infine, l ultima ipotesi, è che la diversità di spermatozoi sia una risposta alla competizione tra maschi. L idea di base è che gli spermatozoi più grandi siano più competitivi ed abbiano maggior possibilità di fecondare le uova di una femmina rispetto a quelli piccoli e questo perché sono più veloci nel raggiungere l uovo, possiedono maggiori riserve energetiche o sono più efficienti nell evitare controadattamenti delle femmine. 11

1.3 SCELTA CRIPTICA FEMMINILE Il concetto di scelta criptica femminile è venuto alla luce nel 1996 grazie al libro Female control di Bill Eberhard in cui l autore documenta decine di casi nel regno animale in cui le femmine possono esercitare un controllo postcopulatorio relativamente a quali maschi fecondano le loro uova. In linea generale infatti con il termine scelta criptica femminile intendiamo tutti quei processi sotto controllo femminile che prima e/o dopo la fecondazione possono in qualche modo favorire gli spermatozoi di un maschio a spese di quelli di un altro. Questo processo si presta poco all osservazione in quanto avviene a livello microscopico all interno dell apparato riproduttivo delle femmine. In molti casi la femmina può esercitare una scelta pre-copulatoria riguardo al maschio che la inseminerà ma ci sono altre situazioni in cui le femmine vengono costrette alla copula. È il caso per esempio della mosca gialla Scatophaga stercoraria in cui le femmine sono afferrate dai maschi, decisamente più grossi di loro, e costrette ad accoppiarsi. In queste circostanze è vantaggioso per le femmine sviluppare dei meccanismi post-copulatori con cui scegliere il padre dei loro figli. La manipolazione della paternità può essere raggiunta dalla femmina in vari modi: - accoppiamento con altri maschi - rigetto tappi spermatici - espulsione spermatozoi dopo la copula - mancata ovulazione - aborto selettivo - mancato investimento nella prole - interruzione precoce della copula La scelta criptica femminile si contrappone spesso alla competizione spermatica e crea inevitabilmente un conflitto tra i sessi per il controllo della paternità delle uova. 12

Nei sistemi in cui le femmine sono costrette all accoppiamento è comune che le femmine vengano inseminate da molti maschi impedendo qualsiasi forma di scelta femminile pre-copulatoria e favorendo in questo modo le femmine che sono in grado di discriminare tra i maschi e scegliere quale eiaculato usare. Dall altra parte però, appena le femmine stabiliscono una qualche forma di controllo sulla fecondazione delle uova, questo creerà una forte pressione selettiva sui maschi per l evoluzione di controadattamenti che ripristinino il loro controllo dei sistemi di fecondazione, e così via in un circolo potenzialmente infinito. La competizione spermatica può portare inoltre all evoluzione di caratteri che aumentano l efficienza di fecondazione dei maschi a scapito della fitness delle femmine creando in questo modo un conflitto evolutivo tra i sessi. Molti caratteri di tipo comportamentale, fisiologico o anatomico prima inspiegabili acquistano senso se visti alla luce del conflitto evoluzionistico tra i sessi. Ad esempio la specie promiscua di coleottero Chelymorpha alternans ha un pene molto lungo e la femmina ha una spermateca estremamente lunga e circonvoluta. È stato proposto che questi caratteri si siano evoluti in risposta a conflitti sessuali continui in cui entrambi i sessi hanno cercato di ottenere il controllo della fecondazione delle uova. Il comportamento di scelta evolve se vi sono dei benefici a compensare i costi pagati dalla femmina. A questo proposito è necessario illustrare tre teorie fondamentali: 1) Teoria di Fisher (o runaway selection). 2) Teoria dei buoni geni 3) Teoria last in - first out 1.3.1 Teoria di Fisher È chiamata anche teoria della selezione rapidissima (runaway selection) e sostiene che le femmine scelgano il proprio partner esclusivamente sulla base di preferenze arbitrarie per determinati caratteri sessuali. Fisher fu il primo a formulare in termini chiari l ipotesi che le elaborate esibizioni maschili potessero essere promosse dalla selezione sessuale 13

semplicemente perché rendono i maschi attraenti agli occhi delle femmine. Egli ipotizzò che all inizio le femmine preferissero un particolare carattere maschile perché esso segnalava una particolare qualità del maschio. Se questo carattere ha una base genetica, viene trasmesso ai figli maschi della femmina e, allo stesso tempo, viene favorita anche l affermazione del gene che induce le figlie femmine a preferire i maschi portatori di quel carattere. Dal procedere di questo feedback positivo fra la preferenza della femmina ed il carattere del maschio deriva che i caratteri maschili diverranno sempre più esagerati nell'evoluzione, fino ad un livello massimo in cui verranno sottoposti a selezione naturale. 1.3.2 Teoria buoni geni Questa teoria presuppone che i maschi differiscano geneticamente riguardo alla loro attitudine alla sopravvivenza. Il comportamento e gli ornamenti del maschio forniscono un informazione precisa sul valore adattativo dei geni del maschio e le femmine utilizzano questa informazione per selezionare i compagni i cui geni le aiutino a produrre prole particolarmente vitale. 1.3.3 Teoria last in - first out Un ultimo aspetto su cui è importante soffermarsi è quello che viene definito precedenza spermatica dell ultimo maschio conosciuta anche come teoria last in - first out. In numerose specie, in cui le femmine mostrano un comportamento promiscuo, si è infatti osservato che l ultimo maschio ad inseminare la femmina diventava il padre di quasi tutti i figli di questa (Simons-Siva-Jothy, 1998). In queste specie le femmine hanno un magazzino per gli spermatozoi situato di solito vicino ad un estremità dell ovidotto e che rilascia gli spermatozoi sulle uova al loro passaggio. Potrebbe trattarsi di una sorta di gara tra gli spermatozoi dei due maschi combattuta all interno dell apparato riproduttivo femminile oppure potrebbe 14

trattarsi di una scelta della femmina che preferisce l ultimo maschio arrivato e manipola i liquidi seminali al suo interno. Sono stati effettuati numerosi studi per cercare di capire i meccanismi che in queste specie permettono all ultimo maschio di raggiungere una così alta percentuale di successo ma tutt oggi non si è giunti ad una risposta soddisfacente. Tra le varie teorie formulate importante è l ipotesi della lotteria secondo la quale gli spermatozoi di maschi diversi vengono mischiati nei magazzini femminili e la probabilità di fecondazione è direttamente proporzionale al numero di spermi inseriti (Parker, 2000). Oppure gli spermatozoi dell ultimo maschio potrebbero essere favoriti perché respingono sul fondo della spermateca quelli del maschio precedente guadagnandosi un posto vicino all uscita o addirittura potrebbero rimuovere gli spermatozoi rivali presenti nel corpo della femmina (spermatozoi killer) (Waage, 1979). Infine, dal momento che probabilmente all interno della spermateca gli spermatozoi non hanno vita lunga o comunque possono perdere la propria vitalità, viene avvantaggiato l ultimo maschio perché trasferisce sperma più attivo e fresco. 1.4 BENEFICI DELLA POLIANDRIA Il vantaggio che un maschio ha nell accoppiarsi con molte femmine è ovvio; il suo successo riproduttivo aumenta con il numero di femmine che riesce ad inseminare e con il numero di uova che riesce a fecondare. Questo non è altrettanto vero per le femmine. Grazie alle moderne tecniche biomolecolari si è dimostrato che la promiscuità femminile è diffusa in vari taxa animali e questo si riflette nella paternità multipla della prole all interno della stessa covata (Birkhead e Moller,1998). Questa promiscuità ha dei costi per la femmina ma nonostante questo rimane diffusa nelle popolazioni naturali. Il motivo del mantenimento di questo 15

comportamento è legato ai benefici di tipo diretto (materiali) ed indiretto (genetici) che ne possono derivare. I primi si riferiscono ai benefici ottenuti dalla femmina per se stessa e che aumentano la sua fecondità e comprendono ad esempio un aumento delle cure parentali o l accesso alle risorse materiali come riserve di cibo (Moller e Birkhead, 1992). I secondi sono i vantaggi genetici che la femmina ottiene per la sua prole in termini di maggior sopravvivenza o maggior successo riproduttivo. I benefici indiretti sono quindi quelli che una femmina ottiene per la prole accoppiandosi con più maschi. Questi benefici riguardano la prevenzione dell incompatibilità genetica del partner, l aumento della diversità genetica della prole o un aumento della sopravvivenza e del successo riproduttivo di quest ultima. La femmina può sfruttare i processi post-copulatori derivanti dall accoppiamento con più maschi per selezionare gli spermi più competitivi e maggiormente compatibili. 1.4.1 Riserve spermatiche nei Chelonidi Testudinae Sono state proposte numerose ipotesi che cercano di spiegare il motivo dell esistenza di queste riserve. Una prima teoria da prendere in considerazione è quella di Birkhead e Moller (1993) secondo la quale la capacità di conservare lo sperma è tipica di specie solitarie ed a bassa densità dal momento che per queste specie le possibilità di incontro e di accoppiamento sono più basse rispetto alle altre specie. Secondo questa teoria quindi le grandi quantità di sperma assicurano la fecondazione delle uova future. Un altra spiegazione plausibile per la presenza dei magazzini spermatici riguarda il fenomeno della separazione tra l atto della copula e quello della fecondazione (Birkhead e Moller, 1993). Se i cicli riproduttivi del maschi e della femmina fossero asincroni per qualsiasi ragione, la possibilità di immagazzinare lo sperma permetterebbe alla femmina di aggirare questo problema e di sincronizzare la copula, la fecondazione e la deposizione. 16

L ultima importante ipotesi è quella secondo la quale immagazzinare sperma potrebbe servire come periodo addizionale concesso alla femmina per la scelta del liquido seminale del maschio più adatto (Eberhard, 1998). Queste informazioni potrebbero derivare da segnali chimici relazionati con la qualità genetica del maschio e permetterebbero alla femmina di selezionare lo sperma per fecondare le proprie uova (Olsson et al., 1996 ; Peacock e Smith, 1997 ; Potts e Wakeland, 1993). Quest ultima teoria, in particolar modo, evidenzia il ruolo attivo della femmina nella riproduzione e la sua capacità di effettuare scelte post-copulatorie. Sotto questa prospettiva la conservazione dello sperma può essere vista non solo come riguardante un eventuale competizione spermatica ma anche come chiaro segno di conflitto tra i sessi in cui la femmina cerca di massimizzare il proprio successo. 1.5 BIOLOGIA RIPRODUTTIVA NEI CHELONIDI TESTUDINAE La stagione riproduttiva nella famiglia Testudinae ha inizio al momento del risveglio dal letargo e si protrae per tutta l estate (Kuchling, 1982) con eccezione dei mesi più caldi. Durante questo periodo le femmine si accoppiano ripetutamente con maschi diversi. Gli accoppiamenti hanno due picchi che si verificano al risveglio e prima del letargo invernale cioè nei mesi di Aprile- Maggio e Settembre (Willemsen e Hailey, 2003). Nelle femmine sono presenti due ovaie che producono gli ovuli e gli ormoni sessuali; dopo l ovulazione le uova vengono raccolte nell ovidotto le cui ghiandole secernono l albume ed il guscio. Nella porzione terminale dell ovidotto le uova si accumulano e vengono conservate fino al momento della deposizione. Le deposizioni variano da una a tre per stagione ma la loro frequenza ed il numero di uova per covata devono essere messe in relazione con l età e con le dimensioni della femmina. Dopo una breve pausa nelle settimane più calde, la crescita follicolare ricomincia ad estate inoltrata in preparazione alla stagione riproduttiva della primavera successiva (Cruce e Raducan, 1976). 17

La spermatogenesi nei maschi inizia a primavera e si completa ad inizio autunno. Gli spermatozoi prodotti sono conservati nel dotto dell epididimo e nei vasi deferenti per tutto il periodo del letargo. L accoppiamento ha luogo poco dopo il risveglio primaverile ed è preceduto da rituali di corteggiamento che includono segnali olfattivi, tattili, visivi ed acustici (Galeotti, 2003). Appena intercettata una femmina ricettiva il maschio inizia un prolungato corteggiamento che può essere anche molto violento tanto da poter a volte provocare ferite alla femmina e sottoporla a grande stress. Il rituale di accoppiamento prevede l annusare e l inseguire la femmina, morsi ripetuti sulle zampe e sul collo, annusi e colpi sulla corazza. Durante l accoppiamento il maschio monta sul dorso della femmina per la copula che avviene con l estroflessione del pene fuori dalla coda. In questo momento il maschio emette una particolare vocalizzazione associata alla fuoriuscita di liquido seminale. Annusare è un comportamento molto importante durante il corteggiamento e consiste nell allungare il collo e dondolare la testa all avvicinarsi dell oggetto d interesse (Carpenter e Ferguson, 1977). Entrambi i sessi sono capaci di distinguere i loro conspecifici annusandoli, basandosi sulla diversa produzione di feromoni. Tuttavia sembra che solo i maschi siano in grado di discriminare le compagne mature sessualmente (Chelazzi e Delfino, 1986). Recenti studi (Sacchi et al., 2003) hanno dimostrato che il successo di monta del maschio nelle testuggini è legato ad alcuni aspetti del display di corteggiamento come ad esempio il numero di morsi dati alla femmina ed il tasso di vocalizzazione. Dal momento che tutti questi segnali riflettono lo stato di salute del maschio (i maschi debilitati infatti non sono motivati nel corteggiamento), la femmina potrebbe usare questi tratti proprio per discriminare tra maschi diversi (Galeotti, 2005) attuando una selezione pre-copulatoria. Dopo la fase di maturazione delle uova la femmina va alla ricerca di un sito ottimale per la deposizione e, una volta individuato, inizia a scavare una buca con le zampe posteriori. A deposizione avvenuta la femmina chiude la buca 18

passandoci sopra svariate volte con il proprio corpo per rendere invisibile il nido. Un importante aspetto della biologia riproduttiva delle Testudo è la capacità delle femmine di conservare lo sperma nei loro ovidotti per lunghi periodi di tempo (Gist e Jones, 1989). Alcuni studi riportano casi di tartarughe femmine che hanno potuto continuare a fecondare le loro uova per 4-7 anni successivi all ultimo accoppiamento (Ewing, 1943; Magnusson, 1979) e questo è probabilmente reso possibile dal fatto che questi animali, essendo ectotermi, hanno temperature corporee minori rispetto agli organismi endotermi. I tubuli di immagazzinamento dello sperma sono posizionati nella porzione posteriore della regione secernente l albumina dell ovidotto (Gist e Jones, 1989). A questa capacità delle femmine di conservare a lungo lo sperma si aggiunge un sistema di accoppiamento promiscuo testimoniato dalla presenza di paternità multiple all interno di singole covate. Questi fattori gettano le basi per un meccanismo di scelta criptica feminile. Mentre in molte specie il sistema di accoppiamento promiscuo è da mettere in relazione ai benefici diretti che la femmina ottiene (ad esempio un aumento delle cure parentali), questo non può essere applicato alla famiglia delle Testudinae per il semplice motivo che le tartarughe non formano coppie stabili o gruppi sociali coesivi e l investimento energetico in cure parentali è praticamente assente sia nel maschio che nella femmina. Il contributo del maschio sembra quindi essere limitato alla sola fecondazione delle uova e legato ai benefici genetici indiretti. Questi benefici, come detto in precedenza, riguardano l aumento della diversità genetica della prole, la prevenzione dell incompatibilità genetica del partner ed un aumento della sopravvivenza e del successo riproduttivo dei figli stessi 1.6. CENNI SULL ANALISI DI PATERNITÀ Come detto in precedenza, nelle tartarughe del genere Testudo è stato evidenziato un sistema di accoppiamento promiscuo testimoniato dalla presenza 19

di paternità multiple all interno di singole covate. Dal momento che in questo studio sono state effettuate analisi per stabilire la paternità nelle varie covate delle tartarughe Testudo hermanni hermanni, ritengo necessario fare qualche precisazione sul test di parentela. L'analisi del DNA per l'esecuzione del test di paternità si basa sul rilevamento di normali variazioni che sono presenti a livello di molte regioni del materiale genetico di ogni individuo (polimorfismo). La determinazione contemporanea di queste variazioni permette di derivare un profilo genetico che per ogni individuo è praticamente unico. Il profilo genetico di un figlio/a sarà costituito da metà profilo genetico materno e metà profilo genetico paterno. La paternità viene esclusa nel caso in cui le caratteristiche genetiche del padre presunto discordino con quelle del figlio oggetto di indagine. La paternità viene, invece, attribuita qualora le caratteristiche genetiche del padre e del figlio concordino. In quest ultimo caso, viene effettuata un analisi statistica dei risultati ed infine viene fornita una percentuale di attribuzione che sarà tanto più prossima al 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni polimorfiche del DNA analizzate, e quanto meno frequenti sono le caratteristiche genetiche riscontrate. Queste regioni polimorfiche del DNA investigate sono ereditate in maniera tra loro indipendente e, per la loro straordinaria variabilità interindividuale, determinano la formazione di un numero molto elevato di combinazioni genotipiche. La prima fase del test di paternità consiste nell estrazione del DNA dai campioni biologici prelevati per l esame. Il tratto di DNA che contiene un'informazione genetica viene definito gene, e la sua localizzazione sui cromosomi viene definita locus. Forme alternative dello stesso gene vengono definite alleli. Un gene che mostra più alleli viene definito polimorfico. Per ogni locus, un individuo eredita un allele dalla madre e un allele dal padre; se gli alleli ereditati sono uguali, l'individuo è omozigote per quel determinato locus, se sono diversi, l'individuo è eterozigote. La derivazione del profilo genetico di un individuo implica la determinazione degli alleli presenti in determinati loci altamente polimorfici. La determinazione 20

del profilo genetico di un individuo comporta quindi la genotipizzazione di un certo numero di regioni del DNA altamente polimorfiche in lunghezza, variabili da individuo ad individuo, che prendono il nome di microsatelliti. 1.7 MICROSATELLITI I microsatelliti sono anche conosciuti come Simple Sequence Repeats (SSRs) (Jacob et al., 1991), Short Tandem Repeats (STR) (Edward et al., 1991) o Sequence Tag Microsatellite Sites (STMs). Sono delle corte sequenze di basi (1-6 paia di basi, bp), presenti nel DNA nucleare di eucarioti e procarioti, ripetute in tandem per un numero variabile di volte in blocchi spesso più piccoli di 200 bp (Strachan Reed, 2004). Sono ubiquitari, cioè possono trovarsi sia in regioni codificanti che in regioni non codificanti, sebbene siano più frequenti in queste ultime perché non soggetti a selezione (Tautz e Renz, 1984). Sembra però esistere una sorta di selezione a livello dimensionale del numero di repeat: è infatti interessante notare che la lunghezza delle sequenze microsatellite presenta un limite massimo non superabile, determinato probabilmente da un meccanismo selettivo che impedirebbe la formazione di alleli eccessivamente lunghi i quali destabilizzerebbero l accoppiamento meiotico tra individui eterozigoti aumentando il numero di crossing-over aberranti (Samadi et al., 1998). I marcatori SSRs rispondono ai seguenti requisiti: abbondanza, elevato polimorfismo, riproducibilità, codominanza, alta risoluzione e portabilità all interno dello stesso genere. In base alla loro composizione, cioè al tipo di repeat, i microsatelliti si distinguono in: 1) perfetti: costituiti esclusivamente da un solo tipo di modulo ripetuto n volte: (CA) n 2) interrotti: costituiti da sequenze ripetute n volte occasionalmente interrotte da 7-8 bp casuali: (CA) n GCATTCG(CA) n 21

3) composti: contengono due diversi tipi di sequenze ripetute n volte ed alternate: (CA) n (GC) n. Le regioni fiancheggianti i microsatelliti sono molto conservate nei genotipi appartenenti alla stessa specie. Costruendo su queste regioni primer specifici è possibile amplificare mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) frammenti contenenti SSRs ed analizzare i polimorfismi esistenti (Lee et al.,2004). La percentuale di successo nell amplificazione diminuisce al crescere della distanza filogenetica (Allendorf et al., 2007). Amplificando il DNA con la PCR è possibile rilevare la diversità dei microsatelliti. I primer che si attaccano alle regioni che fiancheggiano i microsatelliti sono utilizzati per definire la regione di DNA che deve essere amplificata. I frammenti di DNA che ne derivano sono separati, in base alla dimensione, attraverso un elettroforesi su gel di acrilamide o di agarosio. Dopo la separazione i frammenti possono essere visualizzati in tre modi: 1) Tramite colorazione del gel con bromuro di etidio 2) Attraverso l uso di sonde marcate radioattivamente ed autoradiografia del gel. 3) Utilizzando dei primer marcati con fluorescenza e separando con una corsa i prodotti di PCR in un sequenziatore automatico (come nel caso del presente studio). La distribuzione dei microsatelliti all interno del singolo genoma non è omogenea ma sembra essere condizionata dalle diverse limitazioni a cui sono soggette le zone codificanti rispetto a quelle non codificanti: i microsatelliti sono rari, ad esempio, nel DNA mitocondriale e nelle regioni regolatrici. Le frequenze genomiche dei microsatelliti sembrano variare tra i diversi taxa sia per il numero assoluto di loci presenti che per il numero di ripetizioni (Zane et al., 2002; Lee et al., 2002). Gli SSRs sembrano essere più abbondanti e lunghi nei vertebrati che negli invertebrati e, in particolar modo, in quelli endotermi. Dai vari studi effettuati è emerso che i microsatelliti sono molto abbondanti nel genoma e sono caratterizzati da un elevata velocità di mutazione (da 10-2 a 10-6 ) (Amos et al., 1996) rispetto alla velocità di mutazione riscontrata sia nel DNA 22

mitocondriale che nelle point mutation per i loci dei geni codificanti nucleari (Li et al., 2002). Il grado elevato di variabilità dipende quindi da un tasso di mutazione molto alto con un valore di retromutazione altrettanto consistente che può permettere il ritorno all allele di partenza in poche generazioni. I polimorfismi che si osservano sono legati alla presenza di varianti alleliche che differiscono nella lunghezza della sequenza ripetuta, nel numero di ripetizioni della sequenza base (i tassi di mutazione dei microsatelliti aumentano con il numero di ripetizioni), nei tipi di ripetizioni (i tassi di mutazione dei microsatelliti diminuiscono al crescere dei motivi ripetuti) o nella presenza di mutazioni puntiformi all interno del microsatellite (Li et al., 2004). Le variazioni del numero di ripetizioni sono dovute allo strange-slippage replication, cioè ad uno scivolamento della polimerasi durante la replicazione del DNA che comporta l aggiunta o la delezione di basi ripetute (Schlotterer e Tauz, 1992) oppure derivano da eventi di crossing over ineguale tra cromatidi omologhi (Innan et al., 1997). Figura 1.1 Modello di crossing-over ineguale e origine della duplicazione di un microsatellite La frequenza con cui avvengono questi due meccanismi è legata alle condizioni ambientali e a molti altri fattori come ad esempio la taglia degli alleli, la posizione lungo il cromosoma, il contenuto in GC nelle sequenze fiancheggianti, 23

la frequenza con cui avviene la divisione cellulare, il sesso ed il genotipo che sembrano alterare la velocità di mutazione in corrispondenza dei loci microsatelliti. Lo slippage della DNA polimerasi consiste quindi in una sorta di slittamento, lungo il filamento copia del DNA, della polimerasi durante la replicazione con formazione di errori. Questo scivolamento sfalsato porta ad un disaccoppiamento dei filamenti ed il ritorno ad una situazione di doppia elica completa avviene grazie alla DNA-polimerasi che si lega ad un filamento di DNA rimuovendo i tratti in eccesso o aggiungendo nucleotidi dove sono mancanti in modo da creare una successione continua (Schlotterer e Tauz, 1991). Si verifica quindi una contrazione o un espansione del nuovo filamento rispetto al primo con una variazione della sua lunghezza e soprattutto del numero di monomeri costituenti la ripetizione. Figura 1.2 DNA Slippage Alcuni di questi errori sono corretti da meccanismi di riparazione cellulare come ad esempio le correzioni delle bozze ed il mismatchrepair (MMR) ma molti non 24

vengono riparati e generano mutazioni. Conoscere il meccanismo di mutazione dei microsatelliti è fondamentale in quanto molte analisi statistiche dipendono dal modello di mutazione. Il modello degli alleli infiniti (IAM) nel quale ogni evento di mutazione crea nuovi alleli è stato scelto per le principali analisi della genetica di popolazione. Si ritiene invece che il meccanismo più probabile per i microsatelliti sia quello dello stepwise mutation model (SMM) secondo il quale la mutazione cambia la lunghezza del microsatellite aggiungendo o sottraendo singole ripetizioni ad un tasso fisso che è indipendente dalla lunghezza del microsatellite (Ellengren, 2004). Tuttavia questo modello ha dei limiti in quanto è incompatibile con il fatto che i microsatelliti hanno un limite nella dimensione (gli alleli molto lunghi sono rari). Alcune varianti dell SMM affrontano questo problema introducendo un limite nella lunghezza degli alleli in modo che alleli molto lunghi mutano verso alleli più piccoli e viceversa. 1.7.1 Applicazioni dei microsatelliti I microsatelliti sono oggi comunemente utilizzati come marcatori di DNA negli studi di genetica e biologia molecolare. Sono marcatori specie-specifici, multiallelici per un determinato locus e codominanti. Hanno un elevato livello di polimorfismo, seguono un eredità mendeliana e presentano modelli semplici di evoluzione. Inoltre, si rendono particolarmente utili negli studi di genetica di conservazione, sia a livello operativo che analitico dal momento che sono usati perché permettono di registrare l eterozigosità, il grado di inbreeding e di ricostruire il pedigree di animali allevati, fornendo così i dati di base per agire nel rispetto della conservazione della variabilità genetica di specie minacciate (Jones et al., 2003; Blouin et al., 2003). I campi di applicazione dei microsatelliti sono tantissimi e vanno dal settore dell ecologia comportamentale e della biologia evolutiva, in cui i microsatelliti sono utilizzati in studi di parentela, test di paternità e successo riproduttivo maschile, alla genetica di popolazione che utilizza i microsatelliti per misurare il grado di connettività tra popolazioni. Tuttavia i marcatori microsatelliti non 25

sono scevri da problemi, quali l omoplasia, ossia la condizione di uguaglianza nella tipologia e nel numero di repeat microsatellite tra due alleli che hanno diversa discendenza ma che si presentano identici in stato (non distinguibili elettroforeticamente). Questo fenomeno, che è una delle conseguenze dell alta variabilità dei tassi mutazionali dei microsatelliti, induce a sottostimare il reale livello di divergenza di due popolazioni. Un altro problema è la presenza di alleli nulli. Infatti, se nella regione di appaiamento dei primer per l amplificazione del locus esiste una mutazione che impedisce l appaiamento stesso dell oligonucleotide alla sequenza bersaglio, l amplificazione non avviene e l allele non viene individuato (allele nullo). Ne risulta una sottostima del reale numero di omozigoti per l allele nullo (in quanto non verranno amplificati) e degli eterozigoti (che daranno un profilo omozigote). Infine il tasso di mutazione complica l analisi dei microsatelliti. I tassi di mutazione variano considerevolmente tra i diversi taxa; sono state osservate sostanziali variazioni tra e nei loci in relazione ai tassi di mutazione (Brinkmann et al. 1998; Crozier et al. 1999; Ellegren 2000; Gardner et al. 2000; Xu et al. 2000). Quando i microsatelliti si presentano con dimensioni alleliche diverse (Garza et al. 1995), il loro tasso di mutazione in un dato locus non è sempre lo stesso e non è costante nel tempo. Infatti il tasso di mutazione e la direzione della mutazione sono influenzati dalla lunghezza dell allele (Ellegren 2000a; Xu et al. 2000). Le mutazioni e l evoluzione di queste semplici sequenze ripetute derivano probabilmente da vari e continui processi dinamici (Brohede et al. 2002). Se per le specie di studio non sono state mai effettuate ricerche simili, allora sarà necessario procedere alla costruzione di una libreria genomica tramite sonde marcate e al successivo disegno di coppie di primer per poter amplificare i microsatelliti isolati. In altri casi, invece, sono presenti in letteratura studi sulla specie in questione ed è quindi possibile utilizzare i microsatelliti indicati. 1.8 SCOPO DELLA TESI Lo scopo della mia tesi era quello di capire se le femmine di Testudo hermanni 26

hermanni, in caso di accoppiamenti multipli, usano lo sperma dei maschi con cui si sono accoppiate secondo l ordine inverso di accoppiamento (ipotesi last in first out). Per fare questo ho stimato il successo riproduttivo dei maschi usati per gli accoppiamenti sperimentali tramite analisi genetiche (assegnazioni di parentela) sui piccoli nati dalle femmine con cui questi erano stati fatti accoppiare. Le femmine, come spiegato precedentemente, trattengono lo sperma anche per molti anni dopo la copula in tubuli specifici che si trovano nella porzione posteriore dell ovidotto a livello della regione secretrice di albumina. Inoltre le femmine delle tartarughe del genere Testudo hanno un sistema di accoppiamento promiscuo e numerosi studi hanno evidenziato casi di paternità multipla all interno di una stessa covata. La mia tesi si inserisce nell ambito di un progetto di ricerca più ampio basato su osservazioni comportamentali e analisi genetiche, che ha lo scopo di capire se ed eventualmente basandosi su quali fattori le femmine siano in grado di scegliere in modo attivo il futuro padre della loro prole oppure se sia solo l ordine d inseminazione o il caso a determinare chi sarà il padre di una covata. 27

2. MATERIALI E METODI 2.1 SPECIE DI STUDIO Oggetto del presente studio è la tartaruga terrestre Testudo hermanni hermanni (Gmelin, 1789) (Famiglia Testudinae, Superfamiglia Testudinoidea, sottordine Cryptodira, Ordine Testudines, Classe Reptilia). T.h. hermanni, come molte altre specie del genere Testudo, è inserita nella Red List della IUCN che comprende le specie in via d estinzione. Come tale è protetta dalla Convenzione di Berna (allegato II), inclusa nella convenzione di Washington CITES (appendice II) e nell allegato A del regolamento dell Unione Europea 1332/2005. Questo comporta che ne è proibita la detenzione o la vendita (salvo deroghe particolari), a meno che non si tratti di un soggetto nato in cattività, da genitori a loro volta nati in cattività. Anche in tal caso, però, è necessario rispettare specifiche regolamentazioni: per poter essere venduto, l'animale deve essere reso riconoscibile mediante vari mezzi come l inserimento del microchip, se la tartaruga è lunga almeno 10 cm o ha almeno cinque anni di età, oppure tramite riconoscimento fotografico del piastrone e del carapace e accompagnata sempre dalla relativa documentazione legale. Si riconoscono principalmente due sottospecie di T. hermanni la prima diffusa ad Occidente del Mar Adriatico, T. h. hermanni, e la seconda, T. h. boettgeri,ad Oriente nella penisola Balcanica, (Grecia, Croazia, Albania.). T. h. hermanni è la testuggine terrestre maggiormente diffusa nella nostra penisola ed è l unica sicuramente autoctona. La troviamo, seppur con un areale frammentato, lungo tutta la costa tirrenica, lungo parte di quella adriatica (Abruzzo, Molise, Puglia) e nelle isole come la Sicilia, la Sardegna e quelle dell arcipelago toscano mentre è presente con distribuzione puntiforme in Spagna ed in Corsica. Permane infine una ristretta popolazione di queste tartarughe nel Massiccio del Mauri in Francia ( Stubbs, 1989). La distribuzione frammentata e la forte riduzione delle popolazioni della forma occidentale di Testudo è da ricondursi all alta frequenza di incendi boschivi e alla diminuzione degli habitat adeguati a favore degli spazi per l agricoltura, per 28