La proteina 4 dell epididimo umano (HE4) come marcatore di recidiva di carcinoma dell ovaio

La proteina 4 dell epididimo umano (HE4) come marcatore di recidiva di carcinoma dell ovaio Simona Michienzi, Renato Falzarano, Valentina Viggiani, Daniele Rossini, Flavia Longo, Emanuela Anastasi Oncologia A, Dipartimento di Medicina Molecolare, Università Sapienza, Roma ABSTRACT Human epididymis protein 4 (HE4) as a marker of ovarian cancer relapse. Carbohydrate antigen 125 (CA-125) is considered a good marker of ovarian cancer (OC) progression, although high CA-125 concentrations may be observed in several benign conditions, such as pelvic inflammatory disease and endometriosis. Recent studies sought to identify markers with improved specificity for OC detection and monitoring, highlighting interesting results only for HE4. The aim of this study was to evaluate HE4 as marker of OC relapse in 18 patients (50% in relapse) monitored after surgery and adjuvant chemotherapy. Serum HE4 and CA-125 concentrations were determined by ELISA and IRMA methods, respectively. Each patient contributed three serum samples drawn at 3-month intervals (between 1-3, 4-6 and 7-10 months from surgery). Concerning OC patients in remission, marker increase over the threshold level was observed only for CA-125 (n=3, 33%). Conversely, in patients with relapsed OC the increase of HE4 occurred in 22%, 78% and 89% of patients at 3, 6 and 10 months from treatment, respectively. The positivity for CA-125 was found later (7-10 months after surgery) and only in 44% of patients. According to the reference change value available only for CA-125 (69%), 11% of patients both in remission and in relapse showed a clinically significant CA-125 increase at 6 months. However, no further increase was later detectable in patients in remission. Conversely, 67% of patients with recurrent disease showed a further significant CA-125 increase in the following three months. In conclusion, although preliminarily, this study shows that HE4 is more specific and sensitive than CA-125 for the detection of OC relapse. INTRODUZIONE Il carcinoma dell'ovaio (CO) costituisce la prima causa di morte per neoplasie ginecologiche nell'emisfero occidentale e la quarta causa di morte per tumore in generale nelle donne dei paesi industrializzati (1). Questa neoplasia si presenta con un quadro sintomatologico aspecifico e viene pertanto generalmente diagnosticata in fase tardiva, quando le possibilità di guarigione sono ormai compromesse (2-4). Negli stadi più avanzati, le recidive si manifestano nel 20%-60% dei casi, generalmente entro i primi 5 anni dall esordio della malattia (5). L identificazione precoce di ripresa di malattia assume pertanto grande importanza dal punto di vista della gestione clinica di queste pazienti. L utilizzo e il ruolo dei biomarcatori tumorali nella diagnosi e nel follow-up del CO è un argomento molto dibattuto. Le più recenti linee guida raccomandano la determinazione dell antigene carboidratico 125 (CA- 125) in associazione all ecografia pelvica (6, 7). Il CA- 125 è una glicoproteina appartenente alla famiglia delle mucine, codificata dal gene MUC16. L aumentata espressione di questa molecola, oltre che al CO, si associa spesso a patologie benigne ginecologiche e non, quali epatopatie croniche, pancreatiti, nefropatie e malattie infiammatorie croniche (8, 9). Inoltre, CA125 è quasi esclusivamente espresso nel CO sieroso ed endometrioide e in genere non caratterizza gli stadi precoci, in cui è prevalente l istotipo mucinoso. In ragione della scarsa sensibilità e specificità di CA- 125, negli ultimi anni l interesse si è concentrato sullo studio di nuovi biomarcatori, che possano fornire informazioni più attendibili riguardo lo stato di malattia. Recentemente, è stato identificato un nuovo biomarcatore, la proteina 4 dell epididimo umano ( human epididymis protein 4, HE4), codificato dal gene WDFDC2. Questa glicoproteina di 20-25 kda, individuata inizialmente nell epitelio dell epididimo distale umano come inibitore della proteasi, risulta essere coinvolta nella maturazione dello sperma (10-12). La proteina viene normalmente espressa a livello delle cellule epiteliali del tratto respiratorio superiore, del pancreas e Corrispondenza a: Emanuela Anastasi, Laboratorio Marcatori Tumorali, Dipartimento di Medicina Molecolare, Sapienza Università, Viale Regina Elena 324, 00161 Roma. Tel. 064472347, Fax 064478381, E-mail emanuela.anastasi@uniroma1.it Ricevuto: 01.10.2012 Revisionato: 07.01.2013 Accettato: 22.01.2013 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 3 195

SCIENTIFIC PAPERS dell apparato riproduttore. E stato dimostrato che HE4 è amplificata nel CO, ma non nel tessuto ovarico in condizioni fisiologiche (13, 14). Come per CA-125, l espressione di HE4 è maggiore negli istotipi sieroso ed endometrioide dei tumori epiteliali dell ovaio (80-90%) e minore nei carcinomi a cellule chiare (50%); non è invece espressa nei tumori mucinosi (15-17). E stato proposto che la determinazione di HE4 associata a CA-125 possa permettere una miglior definizione delle masse pelviche e orientare la decisione clinica verso più appropriati protocolli terapeutici al fine di migliorare prognosi e gestione clinica delle pazienti (18). Un nostro studio recente, in accordo con dati di letteratura precedente, ha dimostrato, in una casistica di 32 donne, una sensibilità e una specificità per HE4 di 73% e 94% (19). Obiettivo del presente studio è stato quello di valutare HE4 e CA-125 come indicatori di recidiva di CO. A tale proposito sono state studiate retrospettivamente, per un periodo di circa 10 mesi, 18 pazienti in post-menopausa con CO sottoposte a intervento chirurgico e chemioterapico adiuvante, selezionate per essere recidivanti nel 50% dei casi. MATERIALI E METODI Pazienti Nello studio retrospettivo sono state selezionate 18 pazienti in post-menopausa con diagnosi di CO in stadio avanzato (FIGO III-IV), a partire da una casistica di 80 pazienti, afferite consecutivamente tra gennaio 2009 e dicembre 2011 all unità di Oncologia A del Policlinico Umberto 1 di Roma. Tutte le pazienti sono state sottoposte a intervento chirurgico e chemioterapico adiuvante, a seguito del quale sono risultate libere da malattia. La casistica è stata selezionata in modo da reclutare 9 pazienti, che in fase di follow-up erano state classificate in remissione da malattia, e 9 con ripresa di malattia. La ripresa e la remissione da malattia sono state valutate con risonanza magnetica (RM), per la caratterizzazione della massa tumorale, e con tomografia computerizzata (TC), per la stadiazione. Il follow-up ha consentito il monitoraggio delle pazienti per un periodo complessivo di ~10 mesi, con raccolta di campioni sierici a intervalli di ~3 mesi su cui determinare le concentrazioni di HE4 e CA-125. Il primo dosaggio dei marcatori è stato effettuato su un campione prelevato entro 3 mesi dall intervento chirurgico (intervallo 1-3 mesi). Il secondo è stato effettuato su un campione prelevato entro 6 mesi (intervallo 4-6), mentre il terzo entro 10 mesi (intervallo 7-10). Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico Dipartimentale e tutte le pazienti hanno dato il loro consenso informato. Metodi di laboratorio I campioni ematici sono stati raccolti in provette Red Top Vacutainer, lasciati coagulare per 60-90 min e centrifugati per 10 min a 1300 x g. La frazione di siero così ottenuta è stata conservata a -80 C fino al momento dell esecuzione delle analisi. Le concentrazioni di HE4 sono state determinate usando un metodo EIA (Fujirebio Diagnostics) in fase solida, non competitivo, basato su tecnica sandwich diretta, che utilizza due anticorpi monoclonali, rispettivamente 2H5 e 3D8, diretti contro due differenti epitopi del dominio C-WFDC dell HE4. I calibratori, i materiali di controllo e i campioni dei pazienti sono stati fatti incubare con un anticorpo monoclonale anti-he4 2H5 coniugato con biotina, in pozzetti sensibilizzati con streptavidina. Terminata l incubazione, l eccesso dei campioni è stato rimosso e si è proceduto all incubazione con un secondo anticorpo monoclonale anti-he4 3D8 coniugato con enzima. Dopo i lavaggi, è stato aggiunto a ogni pozzetto un substrato cromogeno e la conseguente reazione enzimatica è stata messa in evidenza dallo sviluppo di una colorazione blu direttamente proporzionale alla quantità del marcatore presente nei campioni. L'intensità del colore è stata determinata mediante lettura con uno spettrofotometro per micropiastre. Il livello decisionale di HE4 è 150 pmol/l, secondo le indicazione riportate dalla casa produttrice del kit. Le concentrazioni di CA-125 sono state misurate usando un metodo IRMA sandwich a uno step (CISBio). Le microsfere di polistirene trattate con l anticorpo di cattura M11, che reagisce con le molecole contenenti i determinanti reattivi OC 125, sono state messe a incubare con i campioni e il tracciante. Quest ultimo composto di OC 125 (monoclonale di ratto) marcato con 125 I quantifica il numero di determinanti reattivi all OC 125 ed è distinto dall anticorpo a fase solida. I materiali non legati presenti nel campione del paziente sono stati rimossi tramite aspirazione del fluido e lavaggio delle microsfere. La radioattività è proporzionale alla concentrazione del determinante (antigene) reattivo all OC 125 presente nel campione. Il livello decisionale utilizzato è stato di 35 ku/l. Metodi statistici Le concentrazioni dei marcatori sono state riportate come mediana e 25-75 percentile. L aumento clinicamente significativo del CA-125 entro 6 mesi (definito come differenza tra le concentrazioni misurate al primo e al secondo prelievo) e 10 mesi (definito come differenza tra le concentrazioni misurate al secondo e al terzo prelievo) è stato valutato in accordo con la differenza critica ( reference change value, RCV), per cui RCV = 2,77(CV I 2+CV A 2) 1/2 (20), dove CV I è il coefficiente di variabilità biologica intraindividuale e CV A il coefficiente di variazione analitica riportato dal laboratorio. In particolare, il CV I utilizzato per CA-125 era 24,7% (21) e il CVA A 3%. Il confronto tra gruppi è stato effettuato mediante l esame statistico non parametrico di Mann-Whitney, eseguito con il programma MedCalc v12.3.0. Il livello di significatività statistica considerato era P <0,05. 196 biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 3

Tabella 1 Concentrazioni mediane (25-75 percentile) di HE4 e CA-125 nell'intera casistica, nelle pazienti in remissione e in recidiva Totale (n=18) In remissione (n=9) In recidiva (n=9) 1-3 mesi 4-6 mesi 7-10 mesi 1-3 mesi 4-6 mesi 7-10 mesi 1-3 mesi 4-6 mesi 7-10 mesi HE4 (pmol/l) 97 (55-131) 108 (62-162) 131 (57-300) 52 (43-90) 58 (42-96) 54 (33-66) 120 (110-140) 165 (155-220) 300 (181-700) CA-125 (ku/l) 14 (11-18) 13 (11-19) 15 (12-36) 11 (11-13) 11 (10-13) 12 (10-14) 15 (15-19) 18 (15-26) 34 (15-91) Concentrazione biomarcatore Figura 1 Andamento dei valori medi di HE4 (in pmol/l) e CA-125 (in ku/l) nelle pazienti con recidiva di malattia. Le frecce evidenziano i punti in cui si verifica il superamento del valore soglia per i biomarcatori. La soglia di positività per HE4 (150 pmol/l) e per CA-125 (35 ku/l) è rappresentata, rispettivamente, dalle linee tratteggiate superiore e inferiore. L area del rettangolo rappresenta graficamente il guadagno temporale fornito da HE4 rispetto a CA-125. RISULTATI Le concentrazioni di HE4 e CA-125 (espresse come mediana e 25-75 percentile), determinate tra 1-3 mesi (1 dosaggio), 4-6 mesi (2 dosaggio) e 7-10 mesi (3 dosaggio) dal trattamento, in tutte le pazienti arruolate, nelle pazienti in remissione e in quelle con recidiva di malattia sono riportate nella Tabella 1. Confrontando le concentrazioni dei marcatori in corrispondenza dei tre controlli temporali, si è osservata una differenza statisticamente significativa tra i valori di HE4 dei pazienti in remissione e con recidiva, ottenuti al 1, 2 e 3 dosaggio (P <0,004, P <0,001, P <0,0003, rispettivamente). Considerando le concentrazioni di CA- 125 si è invece osservata una differenza statisticamente significativa solo tra le determinazioni effettuate al 2 e al 3 dosaggio (P <0,03 e P <0,008, rispettivamente). Nelle 9 pazienti che non hanno manifestato ripresa di malattia, le concentrazioni di HE4 sono risultate in tutte le determinazioni al di sotto della soglia decisionale (150 pmol/l), mentre per CA-125 abbiamo riscontrato, in tre pazienti, 4 valori modestamente elevati (<56 ku/l). Nelle 9 pazienti che hanno manifestato recidiva di malattia, abbiamo osservato durante il follow-up concentrazioni assolute di HE4 al di sopra della soglia decisionale nel 22% delle pazienti al 1 dosaggio, 78% delle pazienti al 2 dosaggio e 89% delle pazienti al 3 dosaggio. Invece, per CA-125 non abbiamo osservato concentrazioni sieriche superiori alla soglia decisionale in nessuna paziente, né al 1 né al 2 dosaggio. Solo le determinazioni effettuate al 3 dosaggio (tra 7 e 10 mesi dal trattamento) hanno permesso di identificare concentrazioni positive del marcatore nel 44% delle pazienti. In particolare, in queste pazienti a 10 mesi dall intervento, il rapporto tra la concentrazione media dei marcatori e la soglia decisionale risultava pari a 3 volte nelle determinazioni di HE4 e a 1,7 volte per CA- 125 (Figura 1). Sulla base di questi dati preliminari, si può osservare che nelle pazienti con ripresa di malattia l incremento delle concentrazioni di HE4 al di sopra del valore soglia sembrava anticipare di ~3 mesi quello di CA-125 e che l alterazione aumentava con la progressione della malattia (Figura 1). Sono stati anche valutati gli incrementi dei due marcatori tra 1 e 2 dosaggio (primo intervallo) e tra 2 e 3 dosaggio (secondo intervallo), sia nelle pazienti con recidiva di malattia che nel gruppo di pazienti in remissione (Tabella 2). Dal confronto emerge una differenza significativa nei due gruppi solo per gli incrementi valutati per entrambi i biomarcatori tra 2 e 3 dosaggio (secondo intervallo) (HE4, P <0,0003; CA-125, P <0,008). Considerando il RCV del CA-125 (69%), il marcatore mostrava un incremento clinicamente significativo in una delle 9 pazienti in remissione di malattia a 6 mesi dall intervento terapeutico. In nessuna paziente, tuttavia, si verificava un incremento significativo nel trimestre successivo. Anche nel gruppo delle pazienti con recidiva di malattia si osservava un aumento clinicamente significativo in una donna a 6 mesi, seguito, invece, da un ulteriore incremento clinicamente rilevante nel 67% dei casi (6 su 9). DISCUSSIONE Le caratteristiche biologiche del CO favoriscono una progressione asintomatica e spesso determinano una diagnosi tardiva (22, 23). Studi recenti hanno evidenziato un aumentata espressione negli stadi precoci di malattia di un nuovo biomarcatore, denominato HE4 (24, 25). Di conseguenza, HE4 potrebbe migliorare l identificazione della malignità nella biochimica clinica, 2013, vol. 37, n. 3 197

SCIENTIFIC PAPERS Tabella 2 Mediane (25-75 percentili) degli incrementi assoluti di HE4 e CA-125 nell intervallo di tempo tra primo e secondo dosaggio (I) e nell intervallo tra secondo e terzo dosaggio (II) per le pazienti con carcinoma ovarico in remissione e con recidiva di malattia Pazienti in remissione Pazienti in recidiva HE4 (pmol/l) CA-125 (ku/l) HE4 (pmol/l) CA-125 (ku/l) I intervallo II intervallo I intervallo II intervallo I intervallo II intervallo I intervallo II intervallo 0 (0-13) 0 (0-0) 0 (0-0) 0 (0-2) 45 (2-80) 100 (80-480) 1 (0-3) 14 (4-65) valutazione delle masse pelviche, ridimensionando l utilità diagnostica del CA-125 (26, 27), considerato ancora il marcatore d elezione per la diagnosi e il followup del CO, sebbene siano ampiamente riconosciute le sue limitazioni, in particolare nella specificità diagnostica (28). Per la gestione clinica delle pazienti affette da CO è di fondamentale importanza individuare marcatori in grado di prevedere precocemente la ripresa clinica di malattia in fase di follow-up. Studi preliminari hanno dimostrato che HE4 è in grado di anticipare la ripresa di malattia rispetto al CA-125 (19). Sulla base di queste premesse abbiamo condotto questo studio di follow-up retrospettivo. Lo studio ha evidenziato nelle pazienti in remissione di malattia una specificità superiore di HE4 rispetto a CA-125, confermando i risultati di studi precedenti effettuati in associazione a tecniche di imaging (TC) (29). Di maggiore interesse dal punto di vista clinico sono i risultati ottenuti nelle 9 pazienti che avevano manifestato ripresa di malattia. In particolare, nell intervallo 4-6 mesi 78% delle pazienti presentavano valori positivi di HE4, mentre nello stesso intervallo temporale nessuna mostrava concentrazioni sieriche di CA-125 alterate. La positività per CA-125 era evidenziata nel 44% delle pazienti solo nell ultima finestra temporale del nostro studio (6-10 mesi). L impiego del RCV migliorava la capacità del CA-125 di rilevare aumenti significativi, dimostrando che 67% delle pazienti con ripresa di malattia mostravano un aumento di CA-125 clinicamente significativo, ma sempre tra 7 e 10 mesi dall'intervento chirurgico. I risultati relativi all impiego del RCV mettono in evidenza la rilevanza clinica di questo parametro. A tale riguardo sarebbe utile pianificare studi in grado di definire la variabilità biologica anche per HE4 e in tal modo calcolare il RCV anche per questo marcatore. I risultati del presente studio confermano che HE4 è in grado di anticipare di ~3 mesi l eventuale aumento di CA-125 (19, 30, 31). Dati di letteratura hanno dimostrato che non esiste nessuna evidenza che un trattamento chemioterapico precoce deciso sulla base dell incremento del CA-125, in assenza di segni clinici, comporti benefici di sopravvivenza e per tali motivi questo marcatore è considerato poco utile nel monitoraggio delle pazienti affette da CO (32, 33). Questo potrebbe essere dovuto al fatto che il CA-125 aumenta quando la malattia è ormai estesa. D altra parte, invece, è noto che HE4 è un buon indicatore per la diagnosi di CO nelle fasi precoci (34). Resta quindi da valutare se l espressione precoce di HE4 rispetto a CA- 125 possa permettere di applicare schemi terapeutici efficaci nei primi stadi di ripresa di malattia e determinare così benefici sulla sopravvivenza. E importante osservare che HE4 mantiene costante la sua positività e incrementa con la progressione della malattia. In conclusione, HE4 non è solo un buon indicatore di remissione, ma, soprattutto se paragonato a CA125, potrebbe rappresentare uno strumento in grado di fornire un contributo importante per il follow-up. E determinante ai fini della possibile definizione di nuove strategie terapeutiche in caso di ripresa di malattia, convalidare questi risultati con studi su casistiche più numerose. CONFLITTO DI INTERESSI Nessuno. BIBLIOGRAFIA 1. Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer 1999; 80:827-41. 2. Dunleavey R. Importance of early diagnosis in managing ovarian cancer. Nurs Times 2006;102:28-9. 3. Odicino F, Pecorelli S, Zigliani L, et al. History of the FIGO cancer staging system. Int J Gynaecol Obstet 2008; 101:205-10. 4. Harries M, Gore M. Part I: chemotherapy for epithelial ovarian cancer-treatment at first diagnosis. Lancet Oncol 2002;3:529-36. 5. Tanner EJ, Chi DS, Eisenhauer EL, et al. 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