Metodi dell ecologia microbica -Biodiversità: isolamento identificazione e quantizzazione dei microrganismi nei diversi habitat; -Attività microbica: misura di ciò che i microrganismi fanno nel loro ambiente
Analisi delle comunità microbiche -Metodi colturali: isolamento e coltivazione delle diverse componenti di una comunità; -Metodi molecolari: identificazione e quantizzazione delle diverse componenti di una comunità senza coltivarli.
Coltura di arricchimento Il terreno (i nutrienti) e l insieme delle condizioni di incubazione sono scelte in modo da essere selettive per l organismo desiderato e controselettive per gli organismi non desiderati. Fornisce informazioni solo sulla presenza di un determinato microrganismo in un campione ambientale ma non sulla sua importanza ecologica né sulla sua abbondanza.
Analisi quantitativa di una comunità microbica: colorazione e osservazione al microscopio DAPI (4,6-diamido-2-fenilindolo) fluorocromo che lega gli acidi nucleici e non reagisce con materiale inerte LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Stain - Colorante verde: penetra in tutte le cellule - Colorante rosso: penetra solo nelle cellule morte
ANTICORPI FLUORESCENTI Microcolonie di Sulfolobus acidocaldarius GFP (Green Fluorescent Protein) Cellule di Pseudomonas fluorescens
FISH
LIMITI DEI METODI DI COLTURA VANTAGGI DELLA FISH Richiedono tempo Sono, a volte, troppo selettivi Sottostimano la diversità microbica dei campioni ambientali o clinici Non richiede la coltivazione Elevata sensibilità Sicuro per l operatore
COLTIVABILITA Microbiological Reviews, Mar. 1995, p. 143-169
LE MOLECOLE DELLA FISH IL BERSAGLIO : rrna LA SONDA : OLIGONUCLEOTIDI 15-30 bp
RIBOSOMI PROCARIOTICI
Perché gli rrna? Presenti in tutti gli organismi viventi Relativamente stabili Elevato numero di copie (diverse migliaia/cellula) Comprendo sequenze altamente conservate e sequenze altamente variabili
Sequenze tipizzanti (signature sequenses)
La sonda: scelta della sequenza Microbiological Reviews, Mar. 1995, p. 143-169 -----------------------------------------------------------//--------------------------------------------------------------------
La sonda: metodi di marcatura = fosfatasi alcalina = fluoresceina tirammide
Fluorocromi
La procedura della FISH
perché? Fissazione.. Mantenere l integrità cellulare e le caratteristiche morfologiche Proteggere gli RNA dalla degradazione da parte delle RNAsi endogene Permeabilizzare le cellule e permettere l ingresso della sonda
metodo Fissazione.. Prelievo del campione Soluzione fissativa 4 C Soluzione fissativa: Agenti cross-linking: aldeide o parafolmaldeide 3-4% (Gram-negativi) Agenti che favoriscono la precipitazione: etanolo o metanolo 50% (Gram-positivi)
Preparazione del campione.. Trattare la superficie del vetrino con agenti di adesione (gelatina, poly-l-lisina) Trasferire un aliquota del campione sul vetrino............... Asciugare all aria
Preparazione del campione.. Disidratare in etanolo...... 50% 80% 100% Asciugare all aria Trattamento enzimatico (es. lisozima, mutanolisina)
Ibridazione campione...... sonda..... Tampone di ibridazone (NaCl; Tris/HCl ph 8.0; formamide; SDS) Incubazione (37-50 ) per 0,5-2 ore L incubazione deve essere eseguita sotto condizioni di strigenza per garantire un appropriato annealing della sonda con la sequenza bersaglio
Lavaggi Eseguiti nelle stesse condizioni di stringenza dell ibridazione 16 S Servono ad eliminare la sonda in eccesso 23 S Microbiological Reviews, Mar. 1995, p. 143-169
Visualizzazione Microscopio a epifluorescenza o ad acquisizione laser confocale Macchina fotografica digitale applicata al microscopio Software per l analisi dell immagine
Applicazioni Diversità microbica nei campioni ambientali - habitat quatici - suolo - rizosfera Diversità microbica nel trattamento delle acque di scarico - bioreattori - fanghi attivi Batteri simbionti Analisi di comunità microbiche complesse - cavità orale - flora gastro-intestinale - infezioni del tratto respiratoio Identificazione di patogeni nei tessuti o nel materiale biomedico sterile
Es.: placca subgengivale (da un paziente con periodontite) Verde: sonda eubatterica (EUB338 FITC ), per la visualizzazione delle diverse morfologie batteriche; Giallo: sonda specifica per i treponemi (spirocheti) di gruppo I (TRE I Cy3 ), la maggior parte dei quali non è coltivabile. Verde: sonda specifica per i treponemi di gruppo I (TRE I FITC ); Giallo: sonda specifica per i treponemi di gruppo II (TRE II Cy3 ).
Es.: biofilm subgengivale (organizzazione e distribuzione spaziale di treponemi) Sezione a basso ingrandimento Verde: sonda eubatterica (EUB338 FluoX ); Giallo: sonda specifica per i treponemi di gruppo I (TRE I Cy3 ). Sezione a più alto ingrandimento ingrandimento
Es.: biopsia di tessuto animale malato di dermatite digitale Verde: sonda eubatterica (EUB338 FITC ); Giallo: sonda specifica per i treponemi (spirocheti) di gruppo I (TRE I Cy3 ). Microscopio a epifluorescenza Microscopio a epifluorescenza + charged coupled device (CCD) camera Microscopio laser confocale